一种含有重组XVII型胶原蛋白的促毛发生长组合物及制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种含有重组xvii型胶原蛋白的促毛发生长组合物及制备方法和应用。

背景技术：

1、脱发是困扰全球数亿人的常见问题，其核心病理特征之一是在脱发后期毛囊发生不可逆的“微小化”改变。毛囊微小化表现为毛囊体积缩小、生长期缩短，最终导致粗大的终毛被细小的毳毛替代，形成肉眼可见的毛发稀疏。目前临床上针对脱发的主流治疗手段主要包括植发手术、表面涂擦药物和口服药物。植发手术主要适用于毛囊已完全坏死的区域，属于“拆东墙补西墙”的移植策略，不能逆转原生毛囊的微小化进程，且移植后毛囊的长期存活率和密度维持效果往往不佳。米诺地尔等表面涂擦药物通过刺激头皮血液循环延长毛囊生长期，但停药后效果迅速消失，脱发易复发，且对已发生微小化的毛囊结构修复能力有限。非那雄胺等口服药物通过抑制5α-还原酶降低二氢睾酮水平，虽能延缓微小化进程，但存在性功能障碍、情绪波动等潜在副作用，部分患者无法耐受。

2、目前，已有现有技术将重组xvii型人源化胶原蛋白单独用于防脱和生发。例如，中国专利cn120284771a公开了重组xvii型人源化胶原蛋白在防脱和生发中的应用，其公开了特定序列的重组xvii型人源化胶原蛋白具有促进毛囊干细胞增殖、降低毛乳头细胞内ros水平、提升vegf表达等生物学活性，并公开了洗发水、精华液、注射剂、微针等多种剂型。该专利证明了重组xvii型人源化胶原蛋白单独使用即可对防脱和生发产生一定效果，但其不能为萎缩毛囊提供必要的物理生长空间和支架支撑，对于脱发后期已发生毛囊微小化的患者，单独使用重组xvii型人源化胶原蛋白难以从根本上逆转毛囊微小化，限制了其进一步的应用。

3、发明人在先研究的重组xvii型人源化胶原蛋白是通过选取人源xvii型胶原蛋白α1链中第957-968位、1441-1482位、914-932位等高亲水性、高稳定性关键功能域进行组合，胶原蛋白单体片段重复2-10次，能够得到序列完全源自人源xvii型胶原蛋白天然序列的裁剪与拼接、未引入任何非人源外源性氨基酸残基或非天然连接肽的重组xvii型人源化胶原蛋白。该重组xvii型人源化胶原蛋白具有典型的三螺旋结构，对细胞增殖、细胞粘附和细胞迁移均具有显著促进作用；同时，通过对毕赤酵母宿主细胞yps1基因进行精确敲除，可从源头抑制宿主内源性蛋白酶活性，大幅降低发酵过程中目标蛋白的降解，提高目标蛋白的收率和纯度。然而，上述胶原蛋白具有修复，补充营养，快速止血、促进伤口愈合等多方面的功效，但是单独使用在脱发方面效果不佳。

4、钙磷矿化材料因具有良好的生物相容性、可降解性和一定机械支撑能力，已被广泛研究用于骨修复和组织工程等领域。现有矿化胶原材料多采用动物源胶原或非人源重组胶原与钙磷盐复合，存在免疫原性、病毒风险、序列不明确及降解不可控等问题，简单将胶原蛋白与钙磷盐混合，往往存在沉淀不均匀、注射性差、体内降解过快、难以同时满足物理填充和生物调控等缺陷。

5、因此，如何将重组胶原蛋白与钙离子、磷酸根离子等钙磷矿化组分结合，构建同时具备物理填充和生物调控双重功能的促毛发生长组合物，使其能够注射或植入毛囊微小化区域，为萎缩毛囊提供生长空间并激活毛囊干细胞，已成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为此，本发明提供一种含有重组xvii型胶原蛋白的促毛发生长组合物及制备方法和应用，以解决现有技术中的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明第一方面提供一种促毛发生长组合物，包含重组xvii型人源化胶原蛋白和钙磷矿化组分；所述重组xvii型人源化胶原蛋白包括重组胶原蛋白单链，所述重组胶原蛋白单链是由如seq id no.1所示的胶原蛋白单体片段重复2-10次得到；所述钙磷矿化组分包含钙离子和磷酸根离子；所述重组xvii型人源化胶原蛋白与所述钙磷矿化组分形成矿化凝胶。

4、进一步地，所述重组胶原蛋白单链是在人源xvii型胶原蛋白α1链的基础上裁剪、拼接得到，所述人源xvii型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。所述胶原蛋白单体片段是由人源xvii型胶原蛋白的第957-968位、1441-1482位、914-932位、914-932位、914-932位氨基酸依次组合得到。所述重组胶原蛋白单链的氨基酸序列如seq id no.3所示，编码所述重组胶原蛋白单链的核苷酸序列如seq id no.4所示。所述胶原蛋白单体片段的重复次数优选2-5次，最优选2次。

5、进一步地，所述重组xvii型人源化胶原蛋白与最终生成的磷酸钙盐的质量比范围为1:9至9:1，优选8:2至6:4；所述磷酸钙盐的钙磷比为1.0至1.67。所述组合物的剂型为凝胶、注射剂、敷料、海绵或冻干粉，优选为可注射凝胶。

6、进一步地，所述重组xvii型人源化胶原蛋白通过包括以下步骤的方法制备：将编码所述重组胶原蛋白单链的核苷酸序列插入表达载体，转化至毕赤酵母宿主细胞，所述毕赤酵母宿主细胞的yps1基因被敲除，发酵培养，诱导表达，纯化得到重组xvii型人源化胶原蛋白。优选地，所述表达载体为ppic9k，所述宿主细胞为毕赤酵母gs115。

7、本发明第二方面提供上述促毛发生长组合物的制备方法，包括以下步骤：

8、（1）将重组xvii型人源化胶原蛋白溶解于无菌去离子水中，得到浓度为0.5-5 mg/ml的蛋白溶液，调节ph至3-4；

9、（2）配制钙盐溶液并加入步骤（1）的蛋白溶液中；

10、（3）配制磷酸盐溶液并加入步骤（2）的混合溶液中，控制ph至5-6，持续搅拌；

11、（4）用碱溶液将ph调节至9-10，持续搅拌后静置；

12、（5）离心收集下层沉淀，洗涤，得到重组xvii型人源化胶原蛋白-钙磷矿化凝胶。

13、进一步地，步骤（2）中所述钙盐为氯化钙；步骤（3）中所述磷酸盐为磷酸钠盐或磷酸钙盐；步骤（4）中所述碱溶液为氢氧化钠溶液，持续搅拌4h后静置大于12h；步骤（5）中离心速度为5000 rpm，离心10分钟，洗涤为加入注射水搅拌均匀后离心，重复3次。

14、本发明第三方面提供上述促毛发生长组合物或上述方法制备得到的促毛发生长组合物在制备促进毛发生长、逆转毛囊微小化和/或治疗脱发的产品中的应用。所述产品为药品、医疗器械或化妆品；所述药品为注射剂，用于注射或植入毛囊微小化区域；所述医疗器械为凝胶敷料、微针或植入材料；所述化妆品为头皮护理液、精华液或凝胶。

15、本发明具有如下优点：

16、本发明首次将完全人源、抗降解、具有三螺旋结构和良好细胞活性的重组xvii型人源化胶原蛋白与钙磷矿化凝胶体系有机结合，通过共沉淀和自组装形成三维多孔矿化凝胶，同时具备物理填充和生物调控双重功能。通过矿化凝胶可直接填充于微小化毛囊周围的萎缩组织间隙，为毛囊增大、伸长提供必要的物理空间和支架支撑，从结构上逆转毛囊微小化。通过重组xvii型人源化胶原蛋白是毛囊干细胞的关键微环境成分，能直接调控毛囊细胞的增殖与分化；钙元素作为细胞信号第二信使，参与调控毛囊周期相关基因表达。二者协同作用，可激活休眠毛囊干细胞，诱导毛囊从休止期向生长期转化，并维持毛囊结构完整性。

17、本发明的重组xvii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列完全源自人源xvii型胶原蛋白天然序列的裁剪与拼接，未引入任何非人源外源性氨基酸残基或非天然连接肽，100%人源序列覆盖率从根本上消除了动物源胶原蛋白携带病毒的风险，并极大降低了异种蛋白引起的免疫原性和过敏反应风险。本发明通过对毕赤酵母宿主细胞yps1基因进行精确敲除，从源头抑制了宿主内源性蛋白酶活性，大幅降低了发酵过程中目标蛋白的降解，提高了目标蛋白的收率和纯度。本发明制备的重组xvii型人源化胶原蛋白具有典型的三螺旋结构，与天然胶原蛋白三螺旋构象一致，确保其能够充分发挥天然xvii型胶原蛋白的生物学功能。

18、本发明的矿化凝胶采用人体可降解吸收的重组蛋白和生物矿物质，无传统药物的全身性副作用，降解产物可被机体代谢或利用，长效且安全。