柯里拉京在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒编码NSP4蛋白酶抑制剂中的应用

本发明属于兽医药学，具体涉及柯里拉京在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）编码的nsp4蛋白酶抑制剂中的应用。

背景技术：

1、prrsv感染以免疫抑制、易变异重组为特征，常常导致疫苗免疫失效。自20世纪80年代末首次爆发以来，prrsv已在全球范围内造成巨大经济损失。近年来，prrsv突变毒株的持续出现并不断蔓延和演化，凸显对该新型病毒防控的迫切需求。

2、prrsv是一种有囊膜的正链rna病毒，属于动脉炎病毒科。其基因组全长约15.4kb，编码11个开放阅读框（orfs）。在病毒蛋白酶介导下，orf1a和orf1ab编码的两个多蛋白前体被切割成14个非结构蛋白（nsps）。其中，猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白4（nsp4）负责识别并切割多蛋白中的10个位点，从而释放成熟的nsps。此外，nsp4还能切割一系列宿主限制因子，包括nemo、visa、dcp1a、zap、gbp1和ikkβ，从而逃逸宿主天然免疫应答，有利于prrsv的有效复制。由此可见，nsp4蛋白酶具备广泛的切割活性，使其成为抗病毒药物开发的潜在靶点。目前针对nsp4的特异性抑制剂仍鲜见报道。

3、柯里拉京（corilagin，化学式c27h22o18，cas no.23094-69-1）是一种天然多酚单宁酸类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、保肝等作用。有文献报道，柯里拉京通过靶向宿主cgas-sting通路抑制单纯疱疹病毒2型（hsv-2）和人类巨细胞病毒（hcmv）复制；还通过靶向宿主clk1抑制流感病毒增殖；通过靶向宿主tlr2通路抑制单纯疱疹病毒1型（hsv-1）增殖。在新冠病毒（sars-cov-2）研究中，柯里拉京可结合刺突蛋白s、核衣壳蛋白n、蛋白酶nsp5、rna聚合酶nsp12及nsp14 exon结构域等多个病毒靶点。

4、柯里拉京是否能够靶向抑制prrsv nsp4蛋白酶的活性，目前尚无相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：提供一种柯里拉京在制备prrsv编码nsp4蛋白酶抑制剂中的应用，以填补现有技术中缺乏有效nsp4特异性抑制剂的空白。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种包含有效剂量的柯里拉京的nsp4蛋白酶抑制剂，其有效剂量为12.5 -100 μm。

4、所述抑制剂以柯里拉京为活性成分，抑制剂的剂型为药学上可接受的水溶性盐口服剂、喷雾剂或注射剂。

5、柯里拉京在制备prrsv编码nsp4蛋白酶抑制剂中的应用。

6、所述抑制剂用于抑制prrsv的nsp4蛋白酶活性，prrsv包括prrsv一型毒株、prrsv二型经典毒株、高致病性毒株、nadc30-like毒株、nadc34-like毒株，以及上述任意两类及两类以上毒株重组形成的重组毒株。

7、本发明通过实验系统验证了柯里拉京对nsp4蛋白酶活性的抑制作用。

8、（1）采用表面等离子共振（spr）技术，利用大肠杆菌原核表达并纯化的his-nsp4融合蛋白，检测柯里拉京与nsp4蛋白之间的亲和力，证实两者能高亲和力结合。

9、（2）利用cck-8试剂盒检测柯里拉京在hek293t细胞上的细胞毒性，评估其安全性。

10、（3）利用flipgfp-t2a-nsp4报告系统，通过荧光显微镜检测柯里拉京对prrsv-2hn07-1毒株来源nsp4蛋白酶活性的影响。

11、（4）利用nsp4真核表达质粒pcmv-nsp4-ha和nanolock荧光素酶报告质粒pcmv-nluc-flag，在hek293t细胞上检测不同浓度的柯里拉京对不同prrsv毒株来源的nsp4蛋白酶活性的影响。

12、（5）借助western blot技术，检测柯里拉京对prrsv-2 hn07-1毒株来源的nsp4蛋白酶切割底物nsp3-4的影响。

13、本发明的有益效果

14、本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：

15、（1）首次揭示柯里拉京对prrsv nsp4蛋白酶的抑制作用。目前尚无柯里拉京靶向prrsv nsp4蛋白酶的报道，本发明为柯里拉京在抑制nsp4对含有nsp4特异性切割序列底物切割中的应用开辟了新方向。

16、（2）spr实验显示，柯里拉京与nsp4的亲和力达到0.517 μm，两者亲和力较高，为柯里拉京作为nsp4蛋白酶抑制剂提供了关键证据。

17、（3）本发明综合运用spr、cck-8、flipgfp-t2a-nsp4、nanolock荧光素酶和westernblot五种方法，从药靶结合、细胞毒性分析、酶活性定量检测和底物蛋白切割等多个层面证实柯里拉京对nsp4的抑制作用，实验结果相互印证，结果可靠。

18、（4）柯里拉京对nsp4酶活性的抑制呈剂量依赖性，在25 μm浓度时可使酶活性显著下调，在低于100 μm的浓度范围内对hek293t细胞活性无明显影响（细胞活性在80%以上），表明其具有良好的体外安全性。

19、（5）柯里拉京不仅能抑制prrsv-2高致病性毒株hn07-1来源的nsp4蛋白酶活性，还对prrsv-1（gxfs20220129、sl-01）和prrsv-2的经典毒株bj-4以及nadc30-like、nadc34-like毒株重组形成的sccd2020毒株来源的nsp4表现出显著抑制效应，表明其具备广谱抑制nsp4酶活性的作用。

20、（6）本发明为开发以nsp4为靶点的特异性抑制剂提供了技术基础，具有潜在的临床应用价值和产业化前景。

1.一种nsp4蛋白酶抑制剂，其特征在于，包含有效剂量的柯里拉京。

2.根据权利要求1所述的nsp4蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂以柯里拉京为活性成分，柯里拉京的有效剂量为12.5 -100 μm。

3.根据权利要求2所述的nsp4蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂剂型为药学上可接受的水溶性盐口服剂、喷雾剂或注射剂。

4.柯里拉京在制备prrsv编码nsp4蛋白酶抑制剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制剂用于抑制prrsv的nsp4蛋白酶活性，所述prrsv包括prrsv一型毒株、prrsv二型经典毒株、高致病性毒株、nadc30-like毒株、nadc34-like毒株，以及上述任意两类及两类以上毒株重组形成的重组毒株。