一种高活性复合益生菌肠道调节制剂及其制备工艺的制作方法

本发明涉及益生菌制剂，具体涉及一种高活性复合益生菌肠道调节制剂及其制备工艺。

背景技术：

1、肠道菌群失调与多种疾病密切相关，包括炎症性肠病、肠易激综合征、代谢综合征及免疫功能紊乱等。益生菌作为调节肠道微生态的重要手段，已广泛应用于功能性食品和医药领域。然而，口服益生菌制剂在实际应用中面临多重挑战：胃酸和胆盐环境导致大量活菌在到达肠道前即死亡；益生菌在肠道炎症部位的靶向定植效率低；多种功能菌株同时释放时难以形成协同的时序治疗效应。

2、为提高益生菌的胃肠道存活率，微胶囊包埋技术被广泛研究。海藻酸钠、壳聚糖、明胶等天然高分子材料常用于制备益生菌微胶囊，通过物理屏障保护菌体免受胃酸和消化酶的侵蚀。近年来，刺激响应性智能材料逐渐应用于益生菌递送系统，其中活性氧响应性材料因其能够感知肠道炎症部位的氧化应激微环境而备受关注。含硫缩酮键、苯硼酸酯键或草酸酯键的聚合物可在高浓度活性氧作用下发生结构断裂，实现益生菌的炎症靶向释放。然而，现有技术多采用单一响应阈值的包埋策略，多种功能菌株同时释放，难以形成“先清障、后修复”的序贯治疗效应。

3、另一方面，胞外多糖作为益生菌的代谢产物，具有益生元活性、免疫调节功能和肠道黏附特性，常被用作包埋基质或保护剂。现有技术中，胞外多糖多作为外加成分与益生菌简单混合，未能充分发挥其原位自组装形成三维网络结构的潜力。此外，益生菌在储存和胃肠道转运过程中，其关键酶活性易丧失，导致到达靶部位后功能下降。活性维持因子如金属离子辅因子和含硫氨基酸衍生物虽被用于冻干保护，但多采用物理混合方式，在胃酸环境中易流失，无法实现靶向位点的精准供给。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高活性复合益生菌肠道调节制剂及其制备工艺，以解决现有技术中复合益生菌制剂胃肠道存活率低、炎症靶向释放能力不足、多种功能菌株缺乏时序协同效应以及活性维持因子易流失的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：所述制备工艺流程如图1所示。

3、一种高活性复合益生菌肠道调节制剂的制备工艺，包括以下步骤：

4、步骤一，将产胞外多糖的第一益生菌菌株进行发酵培养，收集发酵上清液并提取胞外多糖，获得高分子量胞外多糖；

5、步骤二，将具有活性氧清除能力的第二益生菌菌株用第一活性氧响应性壁材包埋，制备第一活性氧响应性微胶囊；将产短链脂肪酸的第三益生菌菌株用第二活性氧响应性壁材包埋，制备第二活性氧响应性微胶囊；所述第一活性氧响应性壁材和第二活性氧响应性壁材在不同活性氧浓度阈值下发生结构断裂，且所述第一阈值低于所述第二阈值；

6、作为优选，所述第一活性氧响应性微胶囊和第二活性氧响应性微胶囊的制备方法为：将菌泥与壁材溶液按质量比1:2至1:5混合，采用界面聚合法时，油相为含壁材的二氯甲烷或乙酸乙酯溶液，水相为含菌体的磷酸盐缓冲液，油水相比例为1:3至1:8，搅拌速度为300至800rpm，室温反应1至3小时；采用喷雾冷凝法时，进料速度为5至15ml/min，雾化气压为0.1至0.3mpa，冷凝温度为-20℃至-40℃。

7、步骤三，将所述胞外多糖溶解于含二价金属离子的缓冲液中，加入所述第一活性氧响应性微胶囊和第二活性氧响应性微胶囊，调节体系ph至6.0至7.4，使所述胞外多糖通过金属离子配位交联在微胶囊表面及间隙中自组装形成三维凝胶骨架，将两种微胶囊包埋并固定于所述三维凝胶骨架中；

8、步骤四，向所述三维凝胶骨架中加入含巯基多肽和活性维持因子组合物，所述活性维持因子组合物包含金属离子辅因子和含硫氨基酸衍生物，使所述活性维持因子组合物通过配位作用以及与所述含巯基多肽形成的二硫键动态结合于所述三维凝胶骨架中；所述配位作用为所述金属离子辅因子中的金属离子与所述胞外多糖的糖醛酸羧基之间的配位络合；所述含巯基多肽选自谷胱甘肽、半胱氨酸-甘氨酸二肽或巯基化明胶，所述含巯基多肽的添加量为所述高分子量胞外多糖质量的0.5%至5%；

9、步骤五，将所得混合物冷冻干燥，制得所述高活性复合益生菌肠道调节制剂。

10、作为优选，所述高分子量胞外多糖的重均分子量大于500kda。

11、作为优选，所述第一益生菌菌株选自鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌或双歧杆菌属的菌株，且所述菌株具有高产胞外多糖能力；所述胞外多糖的提取方法包括醇沉、透析和冻干。

12、作为优选，所述第二益生菌菌株具有超氧化物歧化酶或过氧化氢酶活性；所述第三益生菌菌株具有丁酸激酶或丁酰-coa转移酶活性。

13、作为优选，所述第一活性氧响应性壁材为含硫缩酮键的聚己内酯衍生物或含草酸酯键的聚氨酯，所述第二活性氧响应性壁材为含苯硼酸酯键的聚乙二醇衍生物或含硫缩酮键的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述第一阈值对应的h2o2浓度为50至200μm，所述第二阈值对应的h2o2浓度为250至500μm。所述阈值定义为：在含对应浓度h2o2的磷酸盐缓冲液中，37℃处理2小时，微胶囊中益生菌释放率达到50%以上时所对应的最低h2o2浓度。

14、作为优选，所述二价金属离子选自钙离子、镁离子或锌离子中的一种或多种，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液；所述胞外多糖与所述第一活性氧响应性微胶囊和第二活性氧响应性微胶囊总质量的质量比为1:5至1:20。

15、作为优选，加入交联剂，所述交联剂为京尼平、戊二醛或转谷氨酰胺酶，所述交联剂与胞外多糖的质量比为1:50至1:200。

16、作为优选，所述金属离子辅因子选自含锰离子、亚铁离子、铜离子或锌离子的超氧化物歧化酶辅因子络合物，以及含钴离子或镁离子的短链脂肪酸合成酶辅因子络合物；所述含硫氨基酸衍生物选自n-乙酰半胱氨酸或硫辛酸。

17、进一步地，所述含巯基多肽选自谷胱甘肽、半胱氨酸-甘氨酸二肽或巯基化明胶，所述含巯基多肽的添加量为所述高分子量胞外多糖质量的0.5%至5%。所述二硫键动态结合通过以下方式验证：采用ellman试剂检测所述三维凝胶骨架中游离巯基含量，加入所述活性维持因子组合物后游离巯基含量下降50%以上；或采用二硫苏糖醇还原处理后，所述活性维持因子组合物的释放率提高30%以上。

18、作为优选，所述冷冻干燥包括：于零下40℃至零下80℃预冻2至8小时，在真空度5至50pa下，于零下40℃至零下30℃下一次干燥12至24小时，于0℃至10℃下过渡干燥2至4小时，最后于20℃至30℃下二次干燥4至8小时。

19、本发明还提供一种高活性复合益生菌肠道调节制剂，包括：由产胞外多糖的第一益生菌菌株自分泌的高分子量胞外多糖构成的三维凝胶骨架，所述高分子量胞外多糖的重均分子量大于500kda；分散并固定于所述三维凝胶骨架中的第一活性氧响应性微胶囊和第二活性氧响应性微胶囊，所述第一活性氧响应性微胶囊包埋具有超氧化物歧化酶或过氧化氢酶活性的第二益生菌菌株，所述第二活性氧响应性微胶囊包埋具有丁酸激酶或丁酰-coa转移酶活性的产丁酸第三益生菌菌株；所述第一活性氧响应性微胶囊和第二活性氧响应性微胶囊对活性氧的响应阈值不同，且第一阈值低于第二阈值，使所述第二益生菌菌株先于所述第三益生菌菌株释放；以及通过配位络合及与含巯基多肽形成的二硫键动态结合方式负载于所述三维凝胶骨架中的活性维持因子组合物；所述含巯基多肽选自谷胱甘肽、半胱氨酸-甘氨酸二肽或巯基化明胶，所述含巯基多肽的添加量为所述高分子量胞外多糖质量的0.5%至5%；所述活性维持因子组合物包含金属离子辅因子和含硫氨基酸衍生物。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、1、区别于现有技术中采用海藻酸钠、壳聚糖等外源多糖简单混合包埋的方式，本发明利用第一益生菌自产的高分子量胞外多糖原位自组装形成三维凝胶骨架，该骨架不仅作为结构支撑，其本身具有与第一益生菌匹配的黏附因子和益生元结构，可被肠道菌群选择性降解，为后续释放的益生菌创造定植条件，显著提高肠道靶向定植效率；

22、2、区别于现有技术中单一响应阈值导致多种功能菌株同时释放的缺陷，本发明采用第一阈值和第二阈值差异化的双活性氧响应性微胶囊，在肠道炎症部位的活性氧浓度梯度环境中，第二益生菌菌株先于第三益生菌菌株释放，先清除高浓度活性氧、缓解氧化应激，待局部氧化还原电位降至产丁酸菌最适范围后，第三益生菌菌株再释放并高效合成短链脂肪酸，形成“先清障、后修复”的代谢接力效应，两种菌株功能时序匹配，协同效果显著优于同时释放；

23、3、区别于现有技术中活性维持因子与菌粉物理混合导致胃酸大量流失的弊端，本发明预先在三维凝胶骨架中引入含巯基多肽，将金属离子辅因子和含硫氨基酸衍生物通过配位络合以及与含巯基多肽形成的二硫键动态结合于三维凝胶骨架中，随骨架被肠道菌群降解而按需释放，精准供给至微胶囊释放位点，避免胃酸破坏和过早流失，使第二益生菌菌株的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性、第三益生菌菌株的丁酸激酶和丁酰-coa转移酶活性得到有效维持；

24、4、区别于现有技术中单层包埋或简单复合结构各功能组分独立发挥作用的局限，本发明构建的制剂形成多级协同递送系统：三维凝胶骨架作为第一级屏障保护微胶囊通过胃肠道；第一活性氧响应性微胶囊作为第二级在低活性氧浓度下释放抗氧化菌；第二活性氧响应性微胶囊作为第三级在高活性氧浓度下释放产丁酸菌；动态结合的活性维持因子作为第四级随骨架降解释放辅因子，四级结构功能协同，显著提高制剂在炎症性肠病治疗中的靶向性和疗效；5、区别于现有技术中金属离子配位交联多糖凝胶在酸性或强碱性条件下制备导致益生菌大量死亡的矛盾，本发明调节体系ph至6.0至7.4，确保胞外多糖的糖醛酸残基充分去质子化带负电荷以实现配位交联，同时该ph范围对益生菌完全安全，兼顾凝胶形成效率和菌体存活率。