一种面向靶蛋白功能位点阻断并融合脱靶风险评估的蛋白结合物智能设计方法

本发明涉及一种面向靶蛋白功能位点阻断并融合脱靶风险评估的蛋白结合物智能设计方法，属于人工智能蛋白设计。

背景技术：

1、蛋白结合物是一类能够与特定靶蛋白选择性结合的功能性分子，可通过占据或遮挡靶蛋白关键区域，影响靶蛋白与天然配体、底物、受体或相互作用蛋白之间的结合，从而调控相关生物学功能。抗体、纳米抗体、迷你蛋白、人工设计结合蛋白及支架蛋白等均可作为蛋白结合物的重要候选形式。由于蛋白结合物通常具有较大的结合界面和较强的靶向识别能力，其在受体-配体阻断、蛋白-蛋白相互作用抑制、酶活性调控和信号通路干预等方面具有重要应用价值。

2、传统的蛋白结合物设计主要依赖免疫获取、噬菌体展示或酵母展示等实验筛选方法，资源开销大、生产周期长、成本高。近年来，随着深度学习结构预测模型、蛋白质语言模型和生成式蛋白设计方法的发展，基于结构信息和人工智能的蛋白结合物计算设计效率显著提高。现有技术能够根据靶蛋白三维结构生成候选结合物，预测复合物构象，并对候选序列进行稳定性、可溶性和结构适配性优化，从而降低传统实验筛选成本。

3、然而，现有计算设计流程存在以下不足：

4、第一，现有方法通常更关注候选结合物与靶蛋白之间的结合能力，例如结合能、界面面积、接触数量、结构置信度或复合物预测评分等指标。这些指标虽然能够反映候选结合物是否可能稳定结合靶蛋白，但不能保证其结合位置具有明确的功能阻断作用。候选结合物即使具有较高结合评分，也可能结合在靶蛋白的非功能表面，远离配体结合位点、蛋白-蛋白相互作用界面、酶活性位点或信号转导关键区域，从而难以有效阻断疾病相关功能。

5、第二，现有方法对功能位点阻断的评估不够精准。部分方法虽然涉及蛋白-配体结合的阻断概率计算，但通常采用基于原子覆盖的简化模型，未能充分考虑功能位点的多层次特征（如残基保守性、界面接触频率、突变影响、能量贡献等），也难以针对不同功能关键区域（如受体结合位点、酶活性位点、信号转导区域等）构建差异化的阻断约束。

6、第三，蛋白结合物的特异性和安全性评估不足。许多疾病相关靶蛋白与同源蛋白、家族成员或结构相似蛋白之间具有相似的表面结构或保守功能区域。若候选结合物仅针对目标蛋白优化，可能同时与其他非目标蛋白发生交叉结合，尤其当非目标蛋白在正常组织中高表达或参与重要生理功能时，可能带来脱靶毒性或正常信号通路干扰风险。现有方法虽然有个别涉及脱靶蛋白识别或抗脱靶效应设计，但大多针对小分子药物而非蛋白结合物，且未能将脱靶风险评估与功能位点阻断设计有机融合。

7、第四，缺乏多目标综合筛选机制。蛋白结合物的临床应用需要同时满足高功能阻断能力、高靶向特异性、良好的结构稳定性、良好的可开发性以及低脱靶风险等多项目标。现有设计流程往往侧重于单一或少数几个指标，难以在多项目标之间进行有效平衡和综合排序。

8、因此，蛋白结合物设计不能仅依赖结合强度或结构稳定性指标，还需要判断候选结合物是否覆盖靶蛋白功能关键区域，是否能够有效阻断配体结合、蛋白-蛋白相互作用界面、酶活性位点或信号转导区域，并进一步评估其与同源蛋白、结构相似蛋白或正常人体蛋白之间的潜在误结合风险。

9、基于此，有必要建立一种融合功能位点识别、功能阻断约束、功能阻断评分、脱靶风险评估和多目标筛选的蛋白结合物智能设计方法，以提高候选蛋白结合物的功能有效性、靶向特异性和药物开发可行性。

技术实现思路

1、本发明目的是为了解决现有蛋白结合物设计方法中，候选结合物难以确保有效阻断靶蛋白功能关键区域，且缺乏系统性脱靶风险评估，导致功能有效性与安全性不足的问题，提供了一种面向靶蛋白功能位点阻断并融合脱靶风险评估的蛋白结合物智能设计方法。

2、本发明所述一种面向靶蛋白功能位点阻断并融合脱靶风险评估的蛋白结合物智能设计方法，包括如下步骤：

3、步骤1、获取疾病相关靶蛋白信息，对所述靶蛋白信息进行特征解析，识别功能关键区域，并根据所述功能关键区域构建功能位点阻断约束；

4、步骤2、基于所述功能位点阻断约束生成候选蛋白结合物，根据与靶蛋白的空间接触关系划分界面残基与非界面残基，在保持界面残基中参与功能位点接触的关键残基不变的条件下，对非界面区域进行序列优化；

5、步骤3、对步骤2得到的候选蛋白结合物，分别预测其与靶蛋白形成的复合物结构，并根据所述复合物结构计算功能阻断评分；所述功能阻断评分用于量化候选蛋白结合物对靶蛋白功能关键区域的阻断能力；

6、步骤4、构建非目标蛋白集合，预测步骤2获得的候选蛋白结合物与所述非目标蛋白的交叉结合能力，并综合非目标蛋白与靶蛋白之间的序列同源性、结构相似性，以及所述非目标蛋白在正常组织中的表达风险，计算脱靶风险评分；

7、步骤5、根据步骤3得到的功能阻断评分和步骤4得到的脱靶风险评分，结合候选蛋白结合物的靶向结合评分、结构稳定性评分和可开发性评分进行多目标综合筛选，确定优选候选物，并输出所述优选候选蛋白结合物的序列信息、结构信息及各项评分报告。

8、优选的，步骤1所述疾病相关靶蛋白信息包括靶蛋白氨基酸序列、三维结构、pdb文件、预测结构、蛋白名称、物种来源、疾病类型、功能类别、天然配体、底物、受体、相互作用蛋白和已知突变位点信息中的一种或多种；

9、所述特征解析包括解析靶蛋白残基的空间坐标、二级结构、表面可及性、电荷、疏水性和保守性特征，形成目标蛋白结构化数据对象。

10、优选的，步骤1所述功能关键区域包括受体结合位点、配体结合位点、蛋白-蛋白相互作用界面、酶活性位点、底物结合口袋、信号转导关键区域、变构调控区域和用户指定热点残基中的一种或多种；

11、所述功能关键区域通过用户指定、结构注释解析、已知复合物界面提取、口袋识别、保守性分析或热点残基预测中的一种或多种方式确定；

12、功能位点集合表示为：

13、；

14、热点残基集合表示为：

15、；

16、其中，表示靶蛋白全部残基集合，表示第个靶蛋白残基，表示功能位点评分，表示热点残基评分，和分别表示功能位点阈值和热点残基阈值。

17、优选的，所述热点残基评分根据残基保守性、界面接触频率、突变影响和能量贡献中的至少两项计算，表示为：

18、；

19、其中，表示第个残基的保守性得分，表示界面接触频率，表示突变影响得分，表示能量贡献得分，、、、为权重参数。

20、优选的，步骤1所述根据所述功能关键区域构建功能位点阻断约束的具体方法包括：

21、根据功能关键区域残基的空间坐标、表面可及性、电荷分布、疏水性、二级结构环境和空间范围生成功能位点阻断约束；

22、功能位点阻断约束包括目标接触残基集合、优先覆盖区域、排除区域、结合方向约束、空间距离约束、空间遮挡约束、界面形状互补约束和候选结合姿态限制中的一种或多种；

23、其中，优先覆盖区域表示为：

24、；

25、其中，表示三维空间中的任一点，表示热点残基的空间坐标，表示欧氏距离，表示阻断半径。

26、优选的，步骤2所述基于所述功能位点阻断约束生成候选蛋白结合物的具体方法包括：

27、候选蛋白结合物对功能位点的覆盖约束表示为：

28、；

29、其中，表示候选蛋白结合物，表示候选蛋白结合物中的第个残基，表示接触距离阈值；

30、通过结构预测模型、扩散生成模型、序列设计模型、蛋白质语言模型、结构生成模型生成候选蛋白结合物，生成的候选蛋白结合物满足所述覆盖约束；

31、所述候选蛋白结合物的生成包括骨架生成、序列生成和结合姿态生成；

32、候选蛋白结合物集合表示为：

33、；

34、其中，表示第个候选蛋白结合物，表示候选数量；

35、候选生成损失函数表示为：

36、；

37、其中，表示候选蛋白结合物偏离功能位点区域的距离惩罚，表示功能位点覆盖不足惩罚，表示热点残基接触数量不足惩罚，表示空间冲突惩罚，表示结构稳定性不足惩罚，至为权重参数；

38、所述候选蛋白结合物包括抗体片段、纳米抗体、迷你蛋白、人工设计结合蛋白或支架蛋白。

39、优选的，步骤2所述根据与靶蛋白的空间接触关系划分界面残基与非界面残基的具体方法包括：

40、候选蛋白结合物的界面残基集合表示为：

41、；

42、非界面残基集合表示为：

43、；

44、其中，表示靶蛋白，表示候选蛋白结合物全部残基集合，表示候选蛋白结合物界面残基集合，表示候选蛋白结合物非界面残基集合，表示界面距离阈值；

45、对于参与功能关键区域接触的界面关键残基设置固定约束：

46、；

47、其中，表示界面关键残基集合，表示优化前残基类型，表示优化后残基类型；

48、对于非界面残基进行序列重设计，其优化目标表示为：

49、；

50、其中，表示稳定性评分，表示可溶性评分，表示表达可行性评分，表示聚集风险，表示可开发性风险，至为权重参数。

51、优选的，步骤3所述对候选蛋白结合物分别预测其与靶蛋白形成的复合物结构，并根据所述复合物结构计算功能阻断评分，具体包括：

52、复合物结构预测输出结合姿态、界面残基、残基接触图、界面接触数量、复合物结构置信度、界面可信度、几何互补性、界面面积、姿态一致性和空间冲突程度中的一种或多种；

53、功能阻断评分根据功能位点覆盖率、热点残基接触得分、空间遮挡得分、界面面积得分和结合姿态稳定性得分中的至少两项计算，表示为：

54、；

55、其中，表示第个候选蛋白结合物的功能阻断评分，表示加权功能位点覆盖率，表示热点残基接触得分，表示空间遮挡得分，表示界面面积得分，表示结合姿态稳定性得分，至为权重参数。

56、优选的，步骤4所述非目标蛋白集合包括与靶蛋白具有序列同源性的蛋白、与靶蛋白具有结构相似性的蛋白、具有相似表面口袋或结构域的蛋白以及在正常人体组织中表达的蛋白中的一种或多种；

57、步骤4所述综合非目标蛋白与靶蛋白之间的序列同源性、结构相似性，以及所述非目标蛋白在正常组织中的表达风险，计算脱靶风险评分，表示为：

58、；

59、其中，表示候选蛋白结合物针对第个非目标蛋白的脱靶风险评分，表示候选蛋白结合物对非目标蛋白的预测结合能力，表示非目标蛋白与靶蛋白之间的序列相似性，表示结构相似性，表示正常组织表达风险，至为权重参数；

60、对于多个非目标蛋白，综合脱靶风险评分通过最大值或加权和方式得到：

61、；

62、或：；

63、其中，表示第个非目标蛋白的风险权重。

64、优选的，步骤5所述根据功能阻断评分和脱靶风险评分，结合候选蛋白结合物的靶向结合评分、结构稳定性评分和可开发性评分进行多目标综合筛选，确定优选候选物的具体方法表示为：

65、综合评分表示为：

66、；

67、其中，表示第个候选蛋白结合物的综合评分，表示功能阻断评分，表示靶向结合评分，表示结构稳定性评分，表示可开发性评分，表示脱靶风险评分，至为权重参数；

68、根据所述综合评分以及预设阈值对候选蛋白结合物进行排序、分级或剔除，其中脱靶风险评分超过预设阈值的候选蛋白结合物被降低优先级或剔除；

69、步骤5所述输出的优选候选蛋白结合物的序列信息、结构信息及各项评分报告具体包括：

70、候选蛋白结合物的氨基酸序列、三维结构、复合物结构、结合界面残基、功能位点覆盖情况、热点残基接触情况、空间遮挡情况、各项评分、候选分级、实验验证优先级和解释报告。

71、本发明的优点：本发明通过引入功能位点阻断约束，使候选蛋白结合物优先覆盖或接触靶蛋白功能关键区域，减少“能结合但不能阻断功能”的候选物；通过功能阻断评分体系，对功能位点覆盖、热点残基接触、空间遮挡、界面面积和姿态稳定性进行量化评价；通过脱靶风险评估机制，将同源蛋白、结构相似蛋白及正常人体表达蛋白的潜在误结合风险纳入筛选过程；通过多目标综合筛选，能够获得兼具高功能阻断能力、高靶向特异性、较好结构稳定性、较好可开发性和较低脱靶风险的候选蛋白结合物。