基于FliC/CpG佐剂系统的HSV-2三价黏膜疫苗组合物及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗组合物及其应用。

背景技术：

1、单纯疱疹病毒2型（herpes simplex virus type 2，hsv-2）属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科单纯疱疹病毒属，是一种基因组全长为152kb左右的包膜双链dna病毒。hsv-2是引起生殖器疱疹的主要原因，其感染率逐年增加，harfouche等人在2025年发布2020年总感染人数占世界人口的13.3%。

2、疫苗是防治生殖器疱疹最经济有效的手段。在生殖器疱疹病毒广泛流行，且因其潜伏感染的特征难以被彻底治愈的背景下，疫苗是解决问题的最优选择。目前研究进展最领先的四款预防型疫苗：亚单位疫苗gsk208141、gb2/gd2 亚单位疫苗、mrna 疫苗gsk-4108771a 皆在临床试验阶段终止研究。这意味着生殖道疱疹疫苗的研发前路是充满挑战又极具紧迫性的。

3、宾夕法尼亚大学friedman实验室提出了一种全新的疫苗设计理念--不再仅聚焦于阻断病毒进入，而是同时阻断病毒的两大核心免疫逃逸机制，构建一个“三位一体”的多靶点防御体系：诱导gc2抗体负责解除补体逃逸，gd2抗体负责阻止病毒进入而ge2抗体则恢复抗体依赖性介导的细胞毒性作用，他们的结果则是gc2、gd2、ge2组合抗原具有很好的保护效果。但是，gc2、gd2、ge2三种蛋白组合的抗原存在生产升本高、生产线复杂的不足，并且他们的尝试没有考虑到诱导黏膜免疫对于hsv-2疫苗设计的重要性，以致于该gc2、gd2、ge2组合抗原成为合格的hsv-2候选疫苗依旧相距甚远。

4、因此如何克服现有技术的不足是目前生物医药技术领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗组合物及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明第一方面提供基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗组合物，包括鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic、cpg寡核苷酸和hsv-2 gc2-gd2-ge2三抗原串联重组蛋白；

4、其中，鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic的氨基酸序列如seq id no.1所示；

5、cpg寡核苷酸的序列如seq id no.3所示。

6、进一步，鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic、cpg寡核苷酸和hsv-2 gc2-gd2-ge2三抗原串联重组蛋白的质量比为1：10：15。

7、本发明第二方面提供一种基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗的制备方法采用所述的基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗组合物，所述的基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗包括滴鼻疫苗和皮下疫苗；

8、具体制备方法如下：

9、用生理盐水溶解hsv-2 gc2-gd2-ge2三抗原串联重组蛋白、鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic、cpg寡核苷酸，至总体积与cpg寡核苷酸质量的比例为70μl：10μg，得到滴鼻疫苗；

10、用生理盐水溶解hsv-2 gc2-gd2-ge2三抗原串联重组蛋白、鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic、cpg寡核苷酸，至总体积与cpg寡核苷酸质量的比例为100μl：10μg，得到皮下疫苗。

11、进一步，用生理盐水溶解15μg hsv-2 gc2-gd2-ge2三抗原串联重组蛋白、1μg 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic、10μg cpg寡核苷酸，至总体积为70μl，得到滴鼻疫苗；每剂次滴鼻疫苗体积为70μl；

12、用生理盐水溶解15μg hsv-2 gc2-gd2-ge2三抗原串联重组蛋白、1μg 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flic、10μg cpg寡核苷酸，至总体积为100μl，得到皮下疫苗；每剂次皮下疫苗体积为100μl。

13、本发明第三方面提供所述的基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗的制备方法制得的基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗。

14、本发明第四方面提供所述的基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗组合物在制备预防或者治疗单纯疱疹病毒2型的感染导致的疾病的疫苗中的应用。

15、本发明提供基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗组合物及其应用，本发明将gc2、gd2、ge2 蛋白融合表达，构hsv-2 gc2-gd2-ge2三抗原串联重组蛋白作为疫苗抗原。在佐剂选择上，选择新佐剂鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白（flic）主要用于负责th2型免疫激活，经典佐剂cpg寡核苷酸用于th1型免疫补齐，它们的组合是hsv-2疫苗研究领域中尚未出现的全新尝试。

16、与单抗原疫苗不同的是，本发明疫苗组合物诱导的gc2抗体负责解除补体逃逸，gd2抗体负责阻止病毒进入而ge2抗体则恢复抗体依赖性介导的细胞毒性作用（adcc），“三位一体”构建多靶点防御体系。

17、本发明中的hsv-2 gc2-gd2-ge2三抗原串联重组蛋白，其具体制备方法按照下述文献记载的方法实施，文献的著录信息为：施建东等. 一种hsv-2三抗原串联重组蛋白疫苗组合物及其应用：zl 2026 1 0277038.6 [p]. 2026-06-12。

18、本发明提供了上述基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗在balb/c小鼠模型上的两种免疫方式，两种免疫方式分别为滴鼻免疫和皮下免疫。

19、本发明将临床分离株hsv-2/km-1应用于本基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗的保护性评价上。在攻毒株选择上，传统的实验室参考株常常是作为一种相对稳定、均一的“金标准”，它的核心作用是验证疫苗的通用保护效力，但经过多年在细胞上的传代适应，毒力特征可能与最新流行的临床株有一定差异。因此本发明将临床分离株hsv-2/km-1投入到疫苗保护性评价的应用中，以反应疫苗在最新流行毒株的攻势下的保护效力。

20、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

21、1、本发明基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗通过滴鼻途径免疫小鼠后，阴道灌洗液中分泌型iga（siga）水平显著升高，而皮下免疫组对阴道中的siga的诱导作用微弱，说明本发明能够通过滴鼻免疫有效激活共同黏膜免疫系统，在hsv-2感染的初始部位--生殖道黏膜建立第一道免疫防线。

22、2、本发明基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗经滴鼻免疫能够显著上调脾细胞th1型细胞因子ifn-γ和il-2以及th2型细胞因子il-10的分泌水平；基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗经皮下免疫仅能上调脾细胞分泌il-2和il-10，对关键的抗病毒因子ifn-γ诱导能力有限。

23、3、本发明基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗经滴鼻或皮下免疫小鼠后，初次免疫42天后小鼠血清中特异性igg、igg1和igg2a抗体滴度均显著升高，且呈现igg1>igg2a的特征，表明本发明能够诱导以th2型为主的体液免疫应答。此外，滴鼻免疫组血清iga水平显著高于皮下免疫组，进一步证实滴鼻免疫途径能更有效地激发全身黏膜免疫反应。

24、4、本发明对被基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗经滴鼻免疫和皮下免疫后的小鼠采用15倍半数致死剂量（15×ld50）的hsv-2/km-1临床分离株进行阴道攻毒，抗原佐剂组合经滴鼻免疫组（即滴鼻疫苗组）攻毒后14天10只小鼠全部存活，抗原佐剂组合经皮下免疫组（即皮下疫苗组）攻毒后14天10只小鼠存活9只，死亡一只。此外，设置了单一变量对照组，即除去不添加抗原外，佐剂用量和免疫方式都与滴鼻疫苗组（或皮下疫苗组）相同的佐剂对照组（滴鼻佐剂组和皮下佐剂组），滴鼻佐剂组和皮下佐剂组的小鼠在攻毒后第12天全部死亡。结果表明，本发明提供的基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗能够为小鼠提供高效的保护，显著降低hsv-2感染导致的死亡率。

25、5、本发明基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗能够有效抑制病毒复制并加速病毒清除。攻毒后阴道病毒脱落监测结果显示，滴鼻疫苗组和皮下疫苗组小鼠阴道病毒载量峰值出现在攻毒后第2天，随后第4至第8天迅速下降，至第10天阴道病毒完全清零；而滴鼻佐剂组和皮下佐剂组小鼠阴道病毒脱落高峰在第4天，之后持续维持病毒核酸高拷贝。结果表明，本发明能有效控制hsv-2在体内的复制并加速病毒清除。

26、6、本发明基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗能够显著延缓生殖器病变的发生与进展。滴鼻疫苗组和皮下疫苗组小鼠生殖器病变出现时间（第7-8天）显著晚于滴鼻佐剂组和皮下佐剂组（第3天），且病变程度明显减轻。结果表明，本发明能有效延缓hsv-2感染引起的生殖器病变，减轻疾病严重程度。

27、7、本发明所述基于flic/cpg佐剂系统的hsv-2三价黏膜疫苗经滴鼻或皮下三次免疫后，小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要脏器均未见明显病理损伤。