一种检测单核苷酸变异的核酸复合体及检测方法

本发明涉及生物信息学，尤其涉及一种检测单核苷酸变异的核酸复合体及检测方法。

背景技术：

1、单核苷酸变异（snvs）是指基因组中单个碱基的替换、插入或缺失，广泛存在于人体基因中，并与多种遗传疾病、肿瘤易感性及药物代谢密切相关。因此，实现对snvs的准确、快速检测，对疾病诊断、精准医疗及个性化治疗具有重要意义。

2、现有的snv检测技术主要包括pcr及其延伸方法、dna测序、crispr/cas系统检测和dna芯片等。pcr方法如qpcr或arms-pcr，通过特异性引物实现扩增检测，操作简便、灵敏度较高，但在多位点联合检测中容易出现非特异性扩增，且依赖热循环设备，难以满足快速、等温检测的需求。dna测序技术，包括高通量测序（ngs）和sanger测序，能够提供全面的序列信息，适用于深度分析，但成本高、操作复杂、检测周期长，不适用于快速现场诊断。crispr/cas系统借助cas蛋白的序列识别特性并结合信号放大策略实现snv检测，具有一定特异性和灵敏度，但体系设计复杂，对靶序列的设计要求严格，且多位点联合检测仍存在技术挑战。dna芯片通过寡核苷酸探针实现多位点并行检测，适合大规模筛查，但制备工艺复杂、成本较高，对低丰度突变的检出灵敏度不足，同时难以实现快速、等温检测。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种检测单核苷酸变异的核酸复合体及检测方法。

2、第一方面，本发明提供一种核酸复合体，包括：

3、一条单链核酸，所述单链核酸上依次串联n个检测单元，其中n为大于1的整数；每个检测单元包括各自的立足序列和结合序列；

4、所述检测单元的检测位点位于所述立足序列在所述结合序列方向上的相邻位置，并且所述立足序列长度为5~7bp；

5、n-1条fp-dna，每条fp-dna与一个检测单元的部分或全部结合序列以及及其相邻检测单元的部分或全部立足序列结合；

6、可检测的信号部分，与所述单链核酸末端检测单元的部分或全部结合序列相结合。

7、本发明基于链置换反应的基本原理，巧妙构建逻辑门体系进行多个靶标序列的同步检测。当起始检测单元的立足序列被识别时，发生链置换，fp-dna被挤出单链核酸，相邻检测单元的立足点被暴漏，给另一靶标序列的触发链提供立足点。基于此可以依次串联多个检测单元。而当最外侧的检测单元的立足点被暴漏时，最后一个靶标片段的触发链结合并触发链置换反应，使得可检测信号部分被释放，进而触发后续的信号检测反应。当预设信号被检测到，则说明这些靶标序列同时存在，由此实现多靶标序列的检测。

8、本发明提供的立足序列和结合序列设计方法可以保证检测的准确性，既保证了靶标序列触发链的结合效率，同时使得链置换反应可以正常发生（fr-dna被顺利挤出）。该方法可以有效保证检测结果的特异性、灵敏度，同时抑制单点错配导致的假阳性。

9、当立足序列为5~7bp时，具有较优的链置换反应效率和反应稳定性，而当优选为6bp时，其在链杂交效率、反应稳定性及体系平衡性方面表现最佳。

10、进一步地，所述fp-dna还可以结合对应检测单元的部分立足序列，但是不能全部结合，以该立足点仍能够稳定发生链置换反应为准。

11、进一步地，所述可检测的信号部分为：信号核酸链，或核酸链-信号发生分子；

12、优选地，所述信号核酸链的识别序列包括如下核苷酸序列：

13、gacgtgact（如seq id no.15所示的核苷酸序列）。

14、本发明提供的方法中可检测的信号部分，可以采用本领域的多种信号分子，例如通过信号探针触发cha放大反应。或是通过核酸链-信号发生分子的形式，此处的信号发生分子可选荧光基团-淬灭基团发光体系（基于fret效应）、酶-催化底物发光体系（例如hrp酶+tmb底物显色体系）等。优选为信号探针触发cha放大反应，采用前述信号核酸链作为信号探针。

15、进一步地，n为2、3或4。

16、本发明优选检测单元在2-4的范围内，在该数量的检测单元下，单链核酸的长度不会太长，可以保持较高的链置换反应效率。

17、作为一种优选的具体实施方式，若同时检测阿尔茨海默病rs7412和rs429358，则提供如seq id no.1-seq id no.3的核酸复合体，以seq id no.1作为单链核酸，其中ttttttttttt用于和固相载体连接，toholds1为caggca，toholds2为acttca。以seq id no.2作为fp-dna，以seq id no.3作为可检测的信号部分（用于cha放大反应）。

18、作为一种优选的具体实施方式，若同时检测帕金森综合征的rs94704480和rs1564282，则提供如seq id no.8-10的核酸复合体，以seq id no.8作为单链核酸，toholds1为ttagtc，toholds2为tctcta。以seqid no.9为fp-dna，以seq id no.10作为可检测的信号部分（用于cha放大反应）。

19、作为一种优选的具体实施方式，本发明提供前述核酸复合体的制备方法，反应体系包括：

20、所述单链核酸、所述fp-dna、所述可检测的信号部分、smb、pbst和tbe。

21、反应程序包括：

22、92~98℃，3~10min；

23、下降至50~60℃，下降速度为0.5~1.5℃/min；

24、50~60℃，3~10min；

25、下降至20~30℃，下降速度为0.5~1.5℃/min；

26、20~30℃，3~10min；

27、下降至3~8℃，下降速度为0.5~1.5℃/min。

28、第二方面，本发明提供一种核酸检测组合物，包括：固相载体，以及固定于所述固相载体上的如前述的核酸复合体。

29、进一步地，所述固相载体选自磁珠、聚苯乙烯微球、纳米颗粒、试纸条、平面载体、容器载体或电极；

30、优选地，所述核酸复合体通过生物素-链霉亲合素体系固定于所述固相载体上。

31、本发明进一步采用固相载体富集逻辑门结构，同时还能够在后续离心分离中提供锚点，降低筛选过程中的假阳性概率和非特异性反应。

32、本发明优选采用磁珠，通过磁珠-生物素-链霉亲合素-柔性连接子的方式连接逻辑门体系。

33、进一步地，还包括：

34、与所述可检测的信号部分对应的信号放大体系；

35、优选地，所述信号放大体系包括：催化发夹组装反应体系、杂交链式反应体系、滚环扩增体系、crispr-cas信号放大体系、基于生物酶的链置换扩增体系、指数扩增反应体系、或脱氧核酶催化放大体系中的一种或多种；

36、进一步优选地，所述信号放大体系包括用于cha反应的发夹结构序列；

37、更进一步优选地，所述发夹结构序列包括如seq id no.15和如seq id no.16所示的核苷酸序列。

38、本发明进一步采用cha循环放大体系进行信号放大，本研究采用的cha体系在基本反应原理上仍属于传统催化发夹组装（cha）机制，但针对单核苷酸变异检测需求，对发夹结构稳定性、链置换动力学及背景抑制能力进行了优化设计，优化内容主要包括h1、h2发夹的茎环长度、与sp链结合区域的toehold长度、h1与h2之间的toehold结合长度以及自锁双臂长度等参数，并结合nupack对不同结构条件下的热力学稳定性及链置换效率进行模拟分析。通过上述优化，本发明在降低体系背景泄漏的同时，提高了目标链触发后的反应效率，从而增强了本发明体系的特异性、稳定性及通用性。

39、cha信号放大体系并非独立于逻辑门模块的常规扩增单元，而是与前级dna逻辑门之间形成了动力学耦合与结构协同关系。逻辑门输出链同时作为cha反应的特异性启动链，其释放浓度决定cha循环反应的启动效率。相较于hcr、rca或pcr等常规信号放大策略，本发明采用的cha体系与dna逻辑门在链置换机制、等温反应条件及动态发夹结构方面具有更高兼容性，可在维持低背景泄漏的同时提高单核苷酸变异检测的灵敏度与特异性，能够形成更稳定的协同放大效果。

40、第三方面，本发明提供一种试剂盒，包括前述的核酸复合体，或前述的核酸检测组合物。

41、第四方面，本发明提供前述的核酸复合体，或前述的核酸检测组合物，或前述的试剂盒在检测靶标序列中的应用；

42、优选地，所述靶标序列包括：单核苷酸变异核苷酸序列、插入或缺失突变核酸序列、基因融合特征核酸序列、病原体特征核酸序列或微小rna中的任意一种；

43、进一步优选地，所述靶标序列为多个单核苷酸变异核苷酸序列。

44、本发明提供的方法适用于多种靶标序列，只要其可以与立足点结合引发后续的链置换反应。

45、第五方面，本发明提供一种检测单核苷酸变异核苷酸序列的方法，包括：

46、采用前述核酸复合体，或前述的核酸检测组合物，或前述的试剂盒对待测样本进行检测；

47、根据所述可检测的信号部分的信号检测结果判断所述单核苷酸变异的多态性。

48、进一步地，所述检测的条件包括：

49、在25~37℃的条件下，检测30-40 min。

50、本发明具备如下有益效果：

51、本发明提供了一种检测单核苷酸变异的核酸复合体检测体系以及相应的检测方法，采用模块化设计串联多个检测单元，基于链置换反应的基本原理构建逻辑门，可以同时实现多个snvs的检测。

52、本发明提供的方法可灵活拓展至不同snvs或新增检测功能，操作简便，具备特异性强、灵敏度高、多位点通用检测等优势，具有重要的应用价值。