一种抗冻抗菌双功能短肽的重构及双路径筛选方法

本发明涉及生物活性肽设计与筛选，特别是涉及一种抗冻抗菌双功能短肽的重构及双路径筛选方法。

背景技术：

1、低温保存过程中，冰晶形成和重结晶会对细胞、组织等生物样品造成机械和渗透损伤，同时样品在制备、储存和转运过程中还存在微生物污染风险。现有体系通常分别采用二甲基亚砜等低温保护剂和抗生素进行控制，但前者存在一定细胞毒性，后者长期使用又受到耐药性问题限制。因此，兼具抗冻和抗菌功能、且结构简单可设计的短肽具有潜在应用价值。

2、已有研究表明，部分天然冰结合蛋白或抗菌肽可同时表现出抗冻和抗微生物相关活性。例如mitchell和gibson报道，抗菌肽nisin在ph变化或金属离子诱导条件下可形成类似抗冻蛋白的两亲性结构，并表现出可检测的冰重结晶抑制活性（biomacromolecules,2015, 16, 3411–3416）。近年来也已有针对抗冻肽序列的从头设计工作，但抗冻肽与抗菌肽通常仍作为两个相对独立的功能体系进行设计。

3、现有技术尚缺少一种能够在短α-螺旋肽层面同时关联冰界面识别和细菌膜相互作用的共同结构框架，也缺少将该结构特征与数据驱动预测相结合的高效筛选流程。本发明拟解决的主要问题是：识别抗冻肽与抗菌肽之间可用于双功能短肽设计的共同结构特征，并将其用于已有抗菌肽的理性重构以及天然抗菌肽空间中潜在抗冻活性序列的筛选。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种抗冻抗菌双功能短肽的重构及双路径筛选方法。更具体的，本发明提供了一种基于janus α-螺旋亲水/疏水表面径向分区特征的重构和筛选兼具冰重结晶抑制活性与抗菌活性短肽的方法。

2、为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

3、一种基于janus α-螺旋结构的抗冻抗菌双功能肽的重构方法，包括以下步骤：

4、步骤s1，以抗菌肽作为母体序列，对其α-螺旋表面亲水或阳离子残基与疏水残基的空间分布进行分析，并通过调整残基排列增强亲水面与疏水面的径向分离，从而获得具有抗冻抗菌双功能的候选肽；

5、步骤s2，对步骤s1得到的抗冻抗菌双功能的候选肽进行实验验证，得到抗冻抗菌双功能肽。

6、在上述技术方案中，所述步骤s1中，调整残基的方式为：在抗菌短肽上引入赖氨酸以增强阳离子亲水面，保留富亮氨酸区域形成疏水面，并利用甘氨酸作为非疏水间隔残基。

7、在上述技术方案中，所述步骤s2中，实验验证包括：

8、通过冰-水界面分子动力学模拟评价候选肽的冰界面吸附稳定性、界面取向及对冰持续生长的抑制能力；

9、通过细菌膜分子动力学模拟评价候选肽的膜扰动行为；

10、通过冰重结晶抑制实验、最低抑菌浓度实验、扫描电子显微镜实验、圆二色谱和溶血实验评价候选肽的抗冻活性、抗菌活性及膜破坏行为、二级结构及溶血性。

11、本发明的另一方面，还包括利用所述重构方法得到的抗冻抗菌双功能肽，其氨基酸序列为seq id no.2所示。

12、本发明的另一方面，还包括一种基于janus α-螺旋结构约束与抗冻活性预测的抗冻抗菌双功能肽的双路径筛选方法，包括以下步骤：

13、步骤1，获取已知抗菌活性的天然抗菌肽序列库；

14、步骤2，基于janus α-螺旋结构参数，从步骤1的天然抗菌肽序列库中筛选得到第一抗冻抗菌双功能肽候选序列；

15、步骤3，利用抗冻活性预测模型对步骤1的天然抗菌肽序列库中的每个序列进行评分，得到预测得分safp，筛选safp达标的第二抗冻抗菌双功能肽候选序列；

16、步骤4，取步骤2和步骤3得到的第一及第二抗冻抗菌双功能肽候选序列的交集，得到抗冻抗菌双功能肽共识序列；

17、步骤5，通过对步骤4得到的抗冻抗菌双功能肽共识序列进行实验验证，得到抗冻抗菌双功能肽。

18、在上述技术方案中，所述步骤2中janus α-螺旋结构参数包括基于肽链长度、α-螺旋倾向pα、疏水矩μh和疏水面疏水性fh。

19、在上述技术方案中，所述步骤2的筛选原则为肽链长度为10～40氨基酸残基、α-螺旋倾向pα＞0.85、疏水矩μh＞0.20且疏水面疏水性fh＞1.5。

20、在上述技术方案中，所述步骤3中利用afpropred抗冻活性预测模型进行评分，预测得分safp不低于0.60时达标。

21、在上述技术方案中，所述步骤5中的实验验证包括冰-水界面分子动力学模拟和冰重结晶抑制实验。

22、本发明的另一方面，还包括基于所述筛选方法得到的抗冻抗菌双功能肽，其氨基酸序列为seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6或seq id no.7。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

24、1.本发明基于α-螺旋抗冻肽与α-螺旋抗菌肽所共有的janus样径向亲水/疏水分区特征，建立抗冻抗菌双功能短肽的设计与发现方法。基于该结构框架，本发明提供两种互补的技术路线：一是利用janus α-螺旋结构特征对已有抗菌肽进行理性重构，以获得兼具抗冻和抗菌活性的双功能短肽；二是将janus α-螺旋结构约束与抗冻活性预测相结合，建立从天然抗菌肽空间中筛选潜在抗冻活性序列的虚拟筛选流程。

25、2.在本发明的代表性实施例中，p-janus的疏水矩

μh由母体p-parent的0.828提高至1.531，冰-水界面模拟显示其吸附取向更稳定，实验中其冰重结晶抑制活性高于p-parent，并在0.1 mg/ml 时即可检测到抑制活性。

26、p-janus 对大肠杆菌atcc 25922的最低抑菌浓度由母体肽的35 μm降低至17.5 μm，对金黄色葡萄球菌 atcc 25923的最低抑菌浓度为70 μm；在2.1875～280 μm 测试范围内溶血率低于 2%。

27、3.采用本发明的双路径筛选流程，从3306条天然抗菌肽中获得12条共识候选，并进一步实验验证得到5条具有明显冰重结晶抑制活性的抗菌肽来源序列，说明该方法可用于缩小实验筛选范围。

1.一种基于janus α-螺旋结构的抗冻抗菌双功能肽的重构方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的重构方法，其特征在于，所述步骤s1中，调整残基的方式为：在抗菌短肽上引入赖氨酸以增强阳离子亲水面，保留富亮氨酸区域形成疏水面，并利用甘氨酸作为非疏水间隔残基。

3.如权利要求1所述的重构方法，其特征在于，所述步骤s2中，实验验证包括：

4.利用如权利要求1-3中任一项所述重构方法得到的抗冻抗菌双功能肽，其特征在于，氨基酸序列为seq id no.2所示。

5.一种基于janus α-螺旋结构约束与抗冻活性预测的抗冻抗菌双功能肽的双路径筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的双路径筛选方法，其特征在于，所述步骤2中janus α-螺旋结构参数包括基于肽链长度、α-螺旋倾向pα、疏水矩μh和疏水面疏水性fh。

7.如权利要求5所述的双路径筛选方法，其特征在于，所述步骤2的筛选原则为肽链长度为10～40氨基酸残基、α-螺旋倾向pα＞0.85、疏水矩μh＞0.20且疏水面疏水性fh＞1.5。

8.如权利要求5所述的双路径筛选方法，其特征在于，所述步骤3中利用afpropred抗冻活性预测模型进行评分，预测得分safp不低于0.60时达标。

9.如权利要求5所述的双路径筛选方法，其特征在于，所述步骤5中的实验验证包括冰-水界面分子动力学模拟和冰重结晶抑制实验。

10.基于如权利要求5-9中任一项所述的双路径筛选方法得到的抗冻抗菌双功能肽，其特征在于，氨基酸序列为seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6或seq idno.7。