用于在T细胞中诱导活化和DNA表达的方法和组合物与流程

背景技术：

1、靶向的免疫疗法依赖于免疫细胞或分子的使用，所述免疫细胞或分子接合免疫细胞以治疗多种疾病，如癌症、感染性和自身免疫性病状以及心脏损伤。这些疾病包括但不限于b细胞恶性病、慢性淋巴细胞白血病（cll）、急性成淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤（non-hodgkin's lymphoma）、慢性成淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、成胶质细胞瘤、间皮瘤和红斑狼疮。参见例如，miller和sadelain, 《癌细胞（cancer cell）》. 27(4):439-49(2015)；sabatos-peyton等人, 《当代免疫学观点（curr. opin. immunol.）》 22(5):609-615 (2010)；mcleod和anderton, 《当代药理学观点（curr. opin. pharmacol.）》 23:1-108 (2015)；rurik, j. g等人, 《科学（science）》. 375(6576), 91–96 (2022)；以及billingsley等人, 《纳微小快报（nano micro small journal）》. 2304378- 2304378(2023)，所述文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。

2、用于治疗患有这些疾病的患者的一种方法是对t细胞进行基因修饰以通过嵌合抗原受体（car）的表达靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。car是被设计为以人白细胞抗原非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。使用表达car的经基因修饰的细胞来治疗这些类型的患者的尝试已取得了非常有限的成功。参见例如，brentjens等人, 2010, 《分子疗法（molecular therapy）》, 18:4, 666-668；morgan等人, 2010, 《分子疗法》, 于2010年2月23日在线公布, 第1-9页；以及till等人, 2008, 《血液（blood）》, 112:2261-2271，所述文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。

3、然而，免疫效应细胞靶向纳米颗粒（tnp）已经成为用于将核酸（如dna、rna）递送至免疫效应细胞（如t细胞）的有前景的方法。编码car的治疗mrna的非病毒纳米颗粒介导的递送可能引起快速car t细胞产生，但car的瞬时表达可能限制car t细胞的治疗功效。

4、序列表

5、本技术含有通过电子方式以xml文件格式提交的序列表，并且所述序列表通过引用以其整体特此并入。本技术的序列表标记为“123690-5004-wo sequence listing.xml”，其创建于2025年1月27日，并且大小为162字节。

技术实现思路

1、本领域需要用于使用可以在体内扩增的car来治疗癌症的组合物和方法。本公开通过利用tnp作为递送媒剂，包封car mrna（例如，cd19 car或bcma car）连同含有所关注的基因goi（例如，cd19 car或bcma car、治疗基因或其它所关注的基因）的转座子，连同介导goi稳定整合到经转染的t细胞的基因组中的转座酶mrna，解决了这一点以及其它需求。这些tnp选择性地靶向t细胞，从而促进所述tnp在细胞的细胞质内内化，并且随后释放共装载的dna和rna核酸。

2、在大多数癌症中，肿瘤特异性抗原尚未明确定义，但在b细胞恶性病中，cd19是有吸引力的肿瘤靶标。cd19的表达限于正常和恶性b细胞，使得cd19是安全测试car的广泛接受的靶标。参见例如，uckun等人 《血液》, 1988, 71:13-29，所述文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。虽然car可以以类似于内源t细胞受体的方式触发t细胞活化，但迄今为止此技术的临床应用的主要障碍是car+ t细胞的体内扩增有限、输注后细胞的快速消失和令人失望的临床活性。参见例如，jena等人, 《血液》, 2010, 116:1035-1044；uckun等人《血液》, 1988, 71:13-29，所述文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。

3、在一些实施例中，本公开涉及免疫效应细胞靶向纳米颗粒（tnp）组合物用于分别产生表达t细胞受体（tcr）的细胞或表达嵌合抗原受体（car）的细胞，如tcr t细胞或car t细胞的用途，凭此通过将编码tcr或car的dna稳定整合到经tnp转染的细胞的基因组中来实现tcr或car的持久的表达。

4、解决通过非病毒媒剂（如tnp）的有效dna递送的挑战对于实现此目标至关重要。值得注意的是，纳米颗粒通常将核酸（dna）释放到经转染的细胞的细胞质中。然而，dna易位到核中是转录和稳定整合（随后的基因组整合由转座酶技术介导）的前提条件，通常受到免疫效应细胞（像t细胞）的静息和非分裂状态的阻碍。

5、许多基因递送系统需要细胞主动分裂，因为有丝分裂期间的核膜分解促进dna进入到核中，这一事实加剧了这一挑战。因此，向免疫效应细胞的核的有效dna递送，特别是从这些细胞（如t细胞）的非分裂状态开始，仍然是需要创新解决方案的巨大挑战。

6、本公开通过在tnp内共包封或共递送编码car的mrna（如cd19 car或bcma car），连同含有所关注的基因（goi）的转座子（dna）和转座酶，所述转座酶优选地呈mrna格式，共同称为药物产品来解决这一点。

7、在向受试者（例如，人或其它动物，包括但不限于犬科动物、猫科动物和马）体内施用药物产品或转染（体外）时，这些tnp选择性地靶向静息t细胞和经活化的t细胞两者，从而促进有效载荷的内化和细胞质释放。随后将car mrna翻译成蛋白质、将所述蛋白质转运到细胞表面和将所述蛋白质与相应靶标接合来诱导t细胞活化和增殖。

8、此增殖状态使得胞质溶胶递送的dna能够进入到核中，从而允许其随后通过同时存在的转座酶使转座子转录和稳定整合。

9、此外，本公开可以降低在t细胞中其由纳米颗粒释放后胞质dna的存在可能触发的不期望的先天免疫应答的风险。此创新组合物和方法为与非病毒dna递送到核中相关的挑战提供了解决方案，特别是在当此类dna递送到细胞溶胶中时处于非分裂状态的免疫效应细胞中。

10、本公开代表基因递送系统领域和体内（例如，在人或其它动物，包括但不限于犬科动物、猫科动物和马中）car/tcr t细胞两者的产生的显著进展。另外，对于car/tcr t细胞的离体产生，本公开提供了使用t细胞活化珠的替代方案，并且允许缩短的制备过程。

11、在一些实施例中，无论是通过mrna还是dna表达的嵌合抗原受体（car）可以表现出相同或不同的构型。例如，在第一car（如编码cd19 car的mrna）和第二car（源自dna，如cd19car）分子被引导至相同的抗原（如cd19）的情况下，所述分子可以是相同的car分子，从而确保均匀性。可替代地，在第一car（如编码cd19 car的mrna）和第二car（源自dna，如cd22car）分子靶向不同抗原（如cd19和cd22）的情况下，所述分子可以表示不同的car分子，由此为不同的肿瘤细胞抗原提供特异性。实现相同或不同car构型的适应性赋予了免疫细胞疗法的通用性，基于治疗要求和所期望的免疫应答满足各种应用。

12、在一些实施例中，一种纳米颗粒，其包含：表面暴露的t细胞结合部分；mrna，所述mrna编码第一嵌合抗原受体（car）或t细胞受体（tcr）；以及dna，所述dna编码第二嵌合抗原受体（car）或t细胞受体（tcr）。

13、在一些实施例中，所述dna可以是当不需要基因组整合时能够表达基因的简单dna构建体，或者对于基因组整合由转座酶促进的情况，所述dna可以是可转座元件，所述可转座元件包含侧接有反向末端重复序列（itr）的编码所述第二嵌合抗原受体（car）或t细胞受体（tcr）的序列，并且所述纳米颗粒进一步包含编码对所述itr具有特异性的转座酶的核酸。

14、在一些实施例中，一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含表面暴露的t细胞结合部分；可转座元件，所述可转座元件包含侧接有反向末端重复序列（itr）的基因序列；核酸，所述核酸编码对所述itr具有特异性的转座酶；以及mrna，所述mrna编码第一嵌合抗原受体（car）或t细胞受体（tcr）。

15、在一些实施例中，所述纳米颗粒具有编码第二car或tcr的可转座元件的基因序列。

16、在一些实施例中，所述纳米颗粒具有所述可转座元件的基因序列和编码相同car或tcr的所述mrna。

17、在一些实施例中，所述纳米颗粒具有所述第一car或tcr，所述第一car或tcr对选自以下基因的组的细胞表面抗原具有亲和力：tnfrsf17、il3ra、sdc1、cd19、bcma、ms4a1、cd22、tnfrsf8、cd33、cd38、cd5、ncam1、cd70、ulbp1、ulbp2、il1rap、ceacam5、met、egfr、egfrviii、epcam、epha2、erbb2、gpc3、msln、muc1、pdcd1、cd274、kdr、il13ra2、folh1、fap、ca9、folr1、l1cam、ror1、cd23、cd44、cd174、slamf7、gd2、psca、gpnmb、cd276、cspg4、cd133和tem1。

18、在一些实施例中，所述纳米颗粒具有所述第二car或tcr，所述第二car或tcr对选自以下基因的组的细胞表面抗原具有亲和力：tnfrsf17、il3ra、sdc1、cd19、cd20、bcma、ms4a1、cd7、cd22、cd123、cd135、cd38、cd138、cd269、tnfrsf8、cd33、cd38、cd5、ncam1、cd70、ulbp1、ulbp2、il1rap、ceacam5、met、egfr、egfrviii、epcam、epha2、erbb2、gpc3、msln、muc1、pdcd1、cd274、kdr、il13ra2、folh1、fap、ca9、folr1、l1cam、ror1、ror2、gprc5d、psma、cd23、wt1、cd44、cd44v6、cd174、slamf7、l1 cam、flt3、sigle-6、gd2、psca、ny-eso-1、gpnmb、cd276、cspg4、magea3、magea4、cd133和tem1。

19、在一些实施例中，所述第一car和所述第二car中的至少一者对cd19具有亲和力。

20、在一些实施例中，所述第一car具有用于以下的所述car的多肽序列：利基迈仑赛（lisocabtagene maraleucel）、替沙仑赛（tisagenlecleucel）、阿基仑赛（axicabtageneciloleucel）、布瑞基奥仑赛（brexucabtagene autoleucel）或奥贝卡仑赛（obecabtageneautoleucel）。

21、在一些实施例中，所述第二car具有用于以下的所述car的多肽序列：利基迈仑赛、替沙仑赛、阿基仑赛、布瑞基奥仑赛或奥贝卡仑赛。

22、在一些实施例中，所述第一car或所述第二car对bcma具有亲和力。

23、在一些实施例中，所述第一car具有用于艾基维仑赛（idecabtagene vicleucel）或西达基奥仑赛（ciltacabtagene autoleucel）的所述car的多肽序列。

24、在一些实施例中，所述第二car具有用于艾基维仑赛或西达基奥仑赛的所述car的多肽序列。在一些实施例中，所述纳米颗粒具有的编码所述转座酶的核酸是mrna。

25、在一些实施例中，所述纳米颗粒具有的编码所述转座酶的核酸是dna。

26、在一些实施例中，所述可转座元件是睡美人（sleeping beauty，sb）可转座元件。在一些实施例中，所述itr源自sb转座子。在一些实施例中，所述转座酶是sb转座酶。在一些实施例中，所述转座酶是sb100x转座酶。

27、在一些实施例中，所述可转座元件是piggybac（pb）可转座元件。在一些实施例中，所述itr源自pb转座子。在一些实施例中，所述转座酶是pb转座酶。在一些实施例中，所述转座酶是pb7转座酶。

28、在一些实施例中，所述第一tcr或所述第二tcr通过与以下中的一者或多者相互作用来与t细胞结合：t细胞γ链、t细胞β链、t细胞δ链、t细胞恒定链、ccr7、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd11b、cd11c、cd16、cd19、cd20、cd21、cd22、cd25、cd28、cd34、cd35、cd40、cd45ra、cd45ro、cd52、cd56、cd62l、cd68、cd80、cd95、cd117、cd127、cd133、cd137（4-1bb）、cd163、f4/80、il-4rα、sca-1、ctla-4、gitr、garp、lap、颗粒酶b、lfa-1、转铁蛋白受体和其组合。

29、在一些实施例中，所述t细胞结合部分是cd7结合部分。在一些实施例中，所述cd7结合部分是抗cd7抗体或其抗原结合结构域。在一些实施例中，所述cd7结合部分是抗cd7vhh。

30、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 142中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 143-145中所示的cdr1-3。

31、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 146中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 147-149中所示的cdr1-3。

32、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 150中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 151-153中所示的cdr1-3。

33、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 154中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 155-157中所示的cdr1-3。

34、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 158中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 159-161中所示的cdr1-3。

35、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 162中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 163-165中所示的cdr1-3。

36、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 166中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 167-169中所示的cdr1-3。

37、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 170中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 171-173中所示的cdr1-3。

38、在一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 174中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no: 175-177中所示的cdr1-3。

39、在一些实施例中，编码所述第一car或tcr的所述mrna和编码所述第二car或tcr的所述dna的比率是约1:1。在一些实施例中，编码所述第一car或tcr的所述mrna、编码所述第二car或tcr的所述dna和编码所述转座酶的所述核酸的比率是约1:1:1。

40、在一些实施例中，所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒（lnp）。

41、在一些实施例中，所述lnp包含cd7结合部分，所述cd7结合部分包含抗cd7抗体或其抗原结合结构域；mrna，所述mrna编码第一car或tcr；sb可转座元件，所述sb可转座元件包含侧接有反向末端重复序列（itr）的编码第二car或tcr的基因序列；以及核酸，所述核酸编码对所述itr具有特异性的sb转座酶。

42、在一些实施例中，所述lnp包含cd7结合部分，所述cd7结合部分包含抗cd7 vhh；mrna，所述mrna编码对cd19具有亲和力的car；sb可转座元件，所述sb可转座元件包含侧接有反向末端重复序列（itr）的编码相同car的基因序列；以及核酸，所述核酸编码对所述itr具有特异性的sb100x转座酶。

43、一方面，本公开提供了包含如本文所描述的纳米颗粒的组合物。在一些实施例中，所述组合物是药物组合物。

44、在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含t细胞靶向纳米颗粒，所述t细胞靶向纳米颗粒包封包含以下的核酸有效载荷：dna表达构建体，所述dna表达构建体编码嵌合抗原受体（car）基因或t细胞受体（tcr）或其它所关注的基因（goi），以及mrna，所述mrna编码用于诱导t细胞活化和增殖的car或tcr，由此使得dna能够进入到核中，从而允许所述car或所述tcr或所述goi的转录和后续翻译。

45、在一些实施例中，所述dna和所述mrna编码相同的car或不同的car。

46、在一些实施例中，所述dna和所述mrna编码相同的tcr或不同的tcr。

47、在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，其包含根据本文所描述的实施例中的任一个实施例的t细胞靶向纳米颗粒，所述t细胞靶向纳米颗粒包封核酸有效载荷，其中所述表面暴露的t细胞结合部分能够与cd7结合。

48、在一些实施例中，所述表面暴露的t细胞结合部分靶向人cd7。

49、在一些实施例中，所述表面暴露的t细胞结合部分靶向人cd7，并且呈vhh或scfv格式。

50、在一些实施例中，所述表面暴露的t细胞结合部分具有人源化序列或人序列。

51、在一些实施例中，所述方法用于治疗受试者的疾病或病症，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的包含纳米颗粒的组合物。

52、在一些实施例中，所述疾病或病症是癌症。

53、在一些实施例中，所述癌症是b细胞恶性病或多发性骨髓瘤。

54、在一些实施例中，所述癌症是实体瘤癌症。

55、在一些实施例中，所述疾病或病症是血液恶性病。

56、在一些实施例中，所述血液恶性病是成人急性髓系白血病（aml）。

57、在一些实施例中，所述疾病或病症是自身免疫性疾病。

58、在一些实施例中，所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。

59、在一些实施例中，所述疾病或病症是心脏纤维化。

60、在一些实施例中，所述疾病或病症是心脏损伤。

61、在一些实施例中，所述疾病或病症是衰老相关疾病。所述衰老相关疾病也称为衰老相关病。可以通过本文所描述的方法和组合物治疗的衰老相关病的非限制性实例包括心血管疾病、代谢障碍、肌肉骨骼疾病、肝病、肾病、神经变性、肺病、动脉粥样硬化、癌症、癌、细胞衰老、慢性组织损伤、肝硬化、细胞因子释放综合征、糖尿病、衰竭、脂肪肝病、纤维蛋白溶解、纤维化、肝炎诱导的肝纤维化、丙型肝炎、低温症、炎症、病变、白血病、肝损害、肝纤维化、肺腺癌、肺纤维化、nash（非酒精性脂肪性肝炎）、nash诱导的肝纤维化、非小细胞肺癌、癌基因诱导的衰老、骨关节炎、胰腺上皮内瘤变、肺纤维化、难治性b细胞恶性病、衰老、衰老胰腺上皮内瘤变、疗法诱导的衰老、组织损伤、肿瘤、肿瘤发生、溃疡、体重减轻和创伤。有关衰老相疾病的更多信息，一般参见lushchak o.等人, 衰老相关病-与细胞衰老相关的疾病（senopathies-diseases associated with cellular senescence）, 《生物分子（biomolecules）》 13(6):966 (2023)，所述文献的公开内容通过引用并入本文。

62、在一些实施例中，用于治疗衰老相关疾病的示例性car或tcr治疗剂可以靶向包括但不限于以下的抗原：cd3、cd4、cd3z、cd3ζ、cd8、cd19、cd25、cd28、cd45.1、cd45ra、cd62l、cd69、cdk4/6、eμ-all01、kras、lag3、lngfr、mek、nalm6、nras、p-53、pd1、衰老相关β半乳糖苷酶、血清丙氨酸氨基转移酶、血清天冬氨酸氨基转移酶、supar、tim3、trp53、upa、upar和其组合。

63、在一些实施例中，本公开提供了一种用于产生嵌合抗原受体t细胞（car-t细胞）或tcr工程化t细胞（tcr-t t细胞）的方法，所述方法包含使t细胞与根据本文所描述的实施例中的任一个实施例所述的纳米颗粒在体内接触。

64、在一些实施例中，所述用于产生嵌合抗原受体t细胞（car-t细胞）或tcr工程化t细胞（tcr-t t细胞）的方法包含使t细胞与纳米颗粒离体接触。

65、在一些实施例中，所述t细胞从受试者中分离，并且所述方法进一步包含向所述受试者施用所述car-t细胞或所述tcr-t t细胞。

66、在一些实施例中，所述施用用于治疗癌症。

67、在一些实施例中，所述癌症是b细胞恶性病或多发性骨髓瘤。

68、在一些实施例中，所述癌症是实体瘤癌症。

69、在一些实施例中，所述疾病或病症是血液恶性病。

70、在一些实施例中，所述血液恶性病是成人急性髓系白血病（aml）。

71、在一些实施例中，所述疾病或病症是自身免疫性疾病。

72、在一些实施例中，所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。

73、在一些实施例中，所述疾病或病症是心脏纤维化。

74、在一些实施例中，所述疾病或病症是心脏损伤。

75、在一些实施例中，所述疾病或病症是衰老相关疾病。

76、在一些实施例中，所述用于产生嵌合抗原受体t细胞（car-t细胞）或tcr工程化t细胞（tcr-t t细胞）的方法，所述t细胞不与基于抗cd3的刺激珠接触。

77、在一些实施例中，用于在细胞中表达外源基因的方法包含使所述细胞与纳米颗粒接触，其中所述可转座元件中的所述基因序列是所述外源基因。

78、在一些实施例中，组合物包含t细胞靶向纳米颗粒，所述t细胞靶向纳米颗粒包封包含以下的核酸有效载荷：转座酶mrna或dna，所述转座酶mrna或dna用于介导稳定整合，具有反向末端重复序列（itr）的转座子，所述转座子含有嵌合抗原受体（car）基因或t细胞受体（tcr）或其它所关注的基因（goi），以及mrna，所述mrna编码car或tcr，以诱导t细胞活化和增殖，由此使得dna能够进入到核中，从而允许所述转座子通过转座酶转录和稳定整合。

79、在一些实施例中，在体内和离体（身体外）产生t细胞受体（tcr）或嵌合抗原受体（car）的方法包含：向受试者施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，其中所述纳米颗粒包封核酸有效载荷，即含有tcr或car基因或所关注的基因的dna，以及编码tcr或car的mrna以进行t细胞活化和增殖。

80、在一些实施例中，在体内和离体（身体外）产生t细胞受体（tcr）或嵌合抗原受体（car）的方法包含：向受试者施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，其中所述纳米颗粒包封核酸有效载荷，所述核酸有效载荷包括转座酶mrna或dna以进行稳定整合、具有itr且含有tcr或car基因或所关注的基因的转座子，以及编码tcr或car的mrna以进行t细胞活化和增殖。

81、在一些实施例中，用于在身体外/离体产生car t细胞的方法，作为标准活化方法如活化珠的替代方案，所述方法包含：向t细胞施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，其中所述纳米颗粒包封核酸有效载荷，所述核酸有效载荷包括转座酶mrna或dna以进行稳定整合、具有itr且含有tcr或car基因或所关注的基因的转座子，以及编码tcr或car的mrna以进行t细胞活化和增殖。

82、在一些实施例中，所述标准活化方法包括活化珠。

83、在一些实施例中，用于选择性地在体内活化静息t细胞的方法，所述方法包含以下步骤：施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，由此利用经包封的核酸有效载荷来选择性地活化t细胞。

84、在一些实施例中，用于选择性地诱导t细胞特异性dna表达的方法包含：施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，由此利用经包封的核酸有效载荷来选择性地诱导t细胞特异性dna表达。

85、在一些实施例中，用于产生持久的表达t细胞受体（tcr）或嵌合抗原受体（car）的免疫效应细胞的方法包含施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，其中所述组合物共包封和/或共递送编码car的mrna和含有所关注的基因（goi）的转座子（dna）连同转座酶mrna，由此选择性地靶向静息t细胞和经活化的t细胞，促进有效载荷的内化和细胞质释放，并且通过随后将car mrna翻译成蛋白质、转运到细胞表面以及与相应靶标接合来诱导t细胞活化和增殖，凭此促进dna进入到核中，从而允许所述转座子通过转座酶转录和稳定整合。

86、在一些实施例中，用于降低car mrna的施用频率以在体内产生car t细胞的方法包含施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，由此：利用经包封的核酸有效载荷来实现体内car t细胞产生，降低所述施用频率并产生持久的car t细胞，以及除了所述经包封的核酸有效载荷之外，共递送car mrna，以实现即时肿瘤细胞裂解并提供快速抗肿瘤效应，其中组合的近期效应和长期效应在单次施用中充当通向持久的治疗效应的桥梁，从而克服与基于dna的治疗相关的等待时间。

87、在一些实施例中，用于降低由t细胞中胞质dna的存在触发的不期望的先天免疫应答的风险的方法包含施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，由此：利用经包封的核酸有效载荷来选择性地活化t细胞，以及除了所述经包封的核酸有效载荷之外，共递送car mrna，以进一步降低在t细胞中由纳米颗粒释放胞质dna后由所述胞质dna的存在触发的不期望的先天免疫应答的风险。

88、在一些实施例中，用于通过单一药物产品实现近期car介导的治疗效应和长期car介导的治疗效应的方法包含施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，由此：在t细胞靶向纳米颗粒（tnp）内共递送编码嵌合抗原受体（car）的mrna和编码car的dna（转座子）连同转座酶mrna，其中共装载促进即时car表达，从而产生近期治疗效应，并且稳定整合编码car的dna，从而提供持续的治疗益处。

89、在一些实施例中，用于选择性地在体内和离体活化t细胞以进行病毒转导的方法包含以下步骤：施用包含包封car mrna的t细胞靶向纳米颗粒的组合物，以诱导t细胞活化，以及随后施用含有car或tcr的t细胞靶向慢病毒载体（lv）的体内递送，以实现car t细胞的稳定且持久的表达。

90、在一些实施例中，用于在身体外/离体产生car t细胞的方法，作为包括活化珠的标准活化方法的替代方案，由此提供通用方法以进行t细胞活化和转导，所述方法包含：使t细胞与包封car mrna的t细胞靶向纳米颗粒接触，以诱导t细胞活化，以及随后使所述t细胞与含有car或tcr的t细胞靶向慢病毒载体（lv）接触，以实现car t细胞的稳定且持久的表达。

91、在一些实施例中，用于利用t细胞靶向脂质纳米颗粒（tlnp）对表达嵌合抗原受体（car）的免疫细胞群体进行体外或离体活化和/或扩增的方法包含：使用t细胞靶向纳米颗粒组合物转染免疫细胞，如t细胞，其中所述car并入有来自抗体的抗原结合结构域，使得所述表达car的细胞群体在有利于免疫细胞活化和扩增的条件下与car分子的相应配体，如同源抗原分子（例如，cd19）或抗抗原独特型抗体分子（例如，抗独特型cd19抗体分子）结合，由此产生经扩增的和/或经活化的免疫细胞群体，随后引起来自经递送的dna的car表达和通过转座酶mrna促进的稳定整合。

92、在一些实施例中，所述组合物包含t细胞靶向纳米颗粒，所述t细胞靶向纳米颗粒包封由以下组成的核酸有效载荷：a）转座酶mrna或dna，所述转座酶mrna或dna用于介导稳定整合；b）具有反向末端重复序列（itr）的转座子，所述转座子含有嵌合抗原受体（car）基因或t细胞受体（tcr）或其它所关注的基因（goi），以及c）mrna，所述mrna编码car或tcr，以诱导t细胞活化和增殖，由此使得dna能够进入到核中，从而允许所述转座子通过转座酶转录和稳定整合。

93、在一些实施例中，在体内和离体（身体外）产生t细胞受体（tcr）或嵌合抗原受体（car）的方法包含：a）向受试者施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物；b）所述纳米颗粒包封核酸有效载荷，所述核酸有效载荷包括转座酶mrna或dna以进行稳定整合、具有itr且含有tcr或car基因或所关注的基因的转座子，以及编码tcr或car的mrna以进行t细胞活化和增殖；以及c）利用用于在身体外/离体产生car t细胞的相同方法，作为标准活化方法如活化珠的替代方案。

94、在一些实施例中，用于选择性地在体内活化静息t细胞的方法，所述方法包含以下步骤：a）施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物；以及b）利用经包封的核酸有效载荷来选择性地活化t细胞。

95、在一些实施例中，用于选择性地诱导t细胞特异性dna表达的方法包含：a）施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物；以及b）利用经包封的核酸有效载荷来选择性地诱导t细胞特异性dna表达。

96、在一些实施例中，用于产生持久的表达t细胞受体（tcr）或嵌合抗原受体（car）的免疫效应细胞的方法包含：a）施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物，b）在tnp内共包封或共递送编码car的mrna和含有所关注的基因（goi）的转座子（dna）连同转座酶mrna；c）选择性地靶向静息t细胞和经活化的t细胞，促进有效载荷的内化和细胞质释放；d）通过随后将car mrna翻译成蛋白质、转运到细胞表面以及与相应靶标接合来诱导t细胞活化和增殖；e）使得dna能够进入到核中，从而允许所述转座子通过转座酶转录和稳定整合。

97、在一些实施例中，用于降低用于体内car t细胞产生的car mrna的施用频率（通过纳米颗粒）的方法包含：a）施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物；b）利用经包封的核酸有效载荷来实现体内car t细胞产生，由此降低所述施用频率并产生持久的car t细胞；c）除了所述经包封的核酸有效载荷之外，共递送car mrna，以实现即时肿瘤细胞裂解并提供快速抗肿瘤效应；以及d）组合的近期效应和长期效应在单次施用中充当通向持久的治疗效应的桥梁，从而克服与基于dna的治疗相关的等待时间。

98、在一些实施例中，用于降低由t细胞中胞质dna的存在触发的不期望的先天免疫应答的风险的方法包含：a）施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物；b）利用经包封的核酸有效载荷来选择性地活化t细胞；以及c）除了所述经包封的核酸有效载荷之外，共递送carmrna，以进一步降低在t细胞中由纳米颗粒释放胞质dna后由所述胞质dna的存在触发的不期望的先天免疫应答的风险，由此提供本公开的另外的益处。

99、在一些实施例中，用于通过单一药物产品实现近期car介导的治疗效应和长期car介导的治疗效应的方法包含：a）施用包含t细胞靶向纳米颗粒的组合物；b）在t细胞靶向纳米颗粒（tnp）内共递送编码嵌合抗原受体（car）的mrna和编码car的dna（转座子）连同转座酶mrna；以及c）施用药物产品，其中共装载促进即时car表达，从而产生近期治疗效应，并且稳定整合编码car的dna，从而提供持续的治疗益处。

100、在一些实施例中，用于选择性地在体内和离体活化t细胞以进行病毒转导的方法包含以下步骤：a）施用包含包封car mrna的t细胞靶向纳米颗粒的组合物，以诱导t细胞活化；b）随后施用含有car或tcr的t细胞靶向慢病毒载体（lv）的体内递送，以实现car t细胞的稳定且持久的表达；以及c）利用用于在身体外/离体产生car t细胞的相同方法，作为包括活化珠的标准活化方法的替代方案，由此提供通用方法以进行t细胞活化和转导。

101、在一些实施例中，用于利用t细胞靶向脂质纳米颗粒（tlnp）对表达嵌合抗原受体（car）的免疫细胞群体进行体外或离体活化和/或扩增的方法包含：a）使用t细胞靶向纳米颗粒组合物转染免疫细胞，如t细胞；以及b）所述免疫细胞群体瞬时表达car（源自经递送的car mrna，如cd19 car），其中所述car并入有来自抗体的抗原结合结构域。所述表达car的细胞群体在有利于免疫细胞活化和扩增的条件下与car分子的相应配体，如同源抗原分子（例如，cd19）或抗抗原独特型抗体分子（例如，抗独特型cd19抗体分子）结合。此过程引起经扩增和/或经活化的免疫细胞群体的产生，随后引起来自经递送的dna的car表达和通过转座酶mrna促进的稳定整合。此方法充当主要刺激cd3/tcr复合物的常规活化方法的替代方案。

102、一方面，本公开提供了一种纳米颗粒，其包含表面暴露的t细胞结合部分、编码嵌合抗原受体（car）或t细胞受体（tcr）的mrna和编码所关注的基因的dna。

103、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述dna是可转座元件，所述可转座元件包含侧接有反向末端重复序列（itr）的编码所述所关注的基因的序列；并且所述纳米颗粒进一步包含编码对所述itr具有特异性的转座酶的核酸。

104、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述car或tcr对选自以下基因的组的细胞表面抗原具有亲和力：tnfrsf17、il3ra、sdc1、cd19、cd20、bcma、ms4a1、cd7、cd22、cd123、cd135、cd38、cd138、cd269、tnfrsf8、cd33、cd38、cd5、ncam1、cd70、ulbp1、ulbp2、il1rap、ceacam5、met、egfr、egfrviii、epcam、epha2、erbb2、gpc3、msln、muc1、pdcd1、cd274、kdr、il13ra2、folh1、fap、ca9、folr1、l1cam、ror1、ror2、gprc5d、psma、cd23、wt1、cd44、cd44v6、cd174、slamf7、l1 cam、flt3、sigle-6、gd2、psca、ny-eso-1、gpnmb、cd276、cspg4、magea3、magea4、cd133和tem1。

105、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述car对cd19具有亲和力。在一些实施例中，所述car具有用于以下的所述car的多肽序列：利基迈仑赛、替沙仑赛、阿基仑赛、布瑞基奥仑赛或奥贝卡仑赛。

106、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述car对bcma具有亲和力。在一些实施例中，所述car具有用于艾基维仑赛或西达基奥仑赛的所述car的多肽序列。

107、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述所关注的基因编码以下：细胞因子、转录因子、增强t细胞功能、持久性或特异性的蛋白质、参与免疫信号传导通路的多肽、免疫检查点调节多肽。在上文所公开的方面的一些实施例中，所述免疫检查点调节多肽是程序性死亡p蛋白1（pd-1）。

108、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述可转座元件携带在以下上：质粒dna、微环dna、doggybone dna、微质粒dna、微小质粒dna、纳米质粒dna或闭合末端dna（cedna）。

109、在上文所公开的方面的一些实施例中，编码所述转座酶的所述核酸是mrna。

110、在上文所公开的方面的一些实施例中，编码所述转座酶的所述核酸是dna。

111、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒（lnp）。

112、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述可转座元件是睡美人（sb）可转座元件。在上文所公开的方面的一些实施例中，所述itr源自sb转座子。在上文所公开的方面的一些实施例中，所述转座酶是sb转座酶。在上文所公开的方面的一些实施例中，所述转座酶是sb100x转座酶。

113、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述可转座元件是piggybac（pb）可转座元件。在上文所公开的方面的一些实施例中，所述itr源自pb转座子。在上文所公开的方面的一些实施例中，所述转座酶是pb转座酶。在上文所公开的方面的一些实施例中，所述转座酶是pb7转座酶。

114、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述tcr通过与以下中的一者或多者相互作用来与t细胞结合：t细胞γ链、t细胞β链、t细胞δ链、t细胞恒定链、ccr7、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd11b、cd11c、cd16、cd19、cd20、cd21、cd22、cd25、cd28、cd34、cd35、cd40、cd45ra、cd45ro、cd52、cd56、cd62l、cd68、cd80、cd95、cd117、cd127、cd133、cd137（4-1bb）、cd163、f4/80、il-4rα、sca-1、ctla-4、gitr、garp、lap、颗粒酶b、lfa-1、转铁蛋白受体和其组合。

115、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述t细胞结合部分靶向选自由以下组成的组的t细胞表位：cd2、cd4、cd3、cd5、cd7、cd8、cd25、cd127、cd152、cd11和cd28。

116、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述t细胞结合部分是cd7结合部分。

117、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分是抗cd7抗体或其抗原结合结构域。

118、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分是抗cd7 vhh。

119、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 142中所示的氨基酸序列。

120、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:143-145中所示的cdr1-3。

121、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 146中所示的氨基酸序列。

122、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:147-149中所示的cdr1-3。

123、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 150中所示的氨基酸序列。

124、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:151-153中所示的cdr1-3。

125、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 154中所示的氨基酸序列。

126、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:155-157中所示的cdr1-3。

127、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 158中所示的氨基酸序列。

128、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:159-161中所示的cdr1-3。

129、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 162中所示的氨基酸序列。

130、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:163-165中所示的cdr1-3。

131、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 166中所示的氨基酸序列。

132、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:167-169中所示的cdr1-3。

133、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 170中所示的氨基酸序列。

134、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:171-173中所示的cdr1-3。

135、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含如seq id no: 174中所示的氨基酸序列。

136、在上文所公开的方面的一些实施例中，所述cd7结合部分包含分别如seq id no:175-177中所示的cdr1-3。