基于径向导液结构与仿生凝血蛋白冠的双机制骨缺损止血海绵及其制备方法

本发明涉及止血海绵，具体涉及一种具有规则径向排列导液结构的负载高凝血活性蛋白冠颗粒的止血海绵的制备方法及其使用方法，属于生物医用材料。

背景技术：

1、止血在临床和生物医用材料领域都是一个常见的课题。无论是无法控制的持续出血还是意外的术中出血，无法迅速有效止血都可能会增加并发症和手术失败的风险，甚至导致死亡。近年来，止血材料领域取得了蓬勃发展的成就。在众多止血材料中，止血海绵因其得天独厚的多孔结构，而广受青睐。进一步研究显示，海绵通过提供多孔结构来增强伤口部位的血小板活化和聚集。当血管组织受损时，该结构可促进血小板的聚集与内皮下基质的结合。这种相互作用产生化学信号，促进强初始止血阻滞的形成，从而改善整体止血反应。无论是什么样的海绵材料，它们大多围绕两个中心：①保证一定的机械强度，②保持海绵特有的多孔微观结构。海绵的机械强度直接影响其吸收血液和承受血压影响的能力。具有良好机械性能的海绵可以有效地抵抗血压，从而提高其止血功效；止血海绵的微形态结构在其疗效中起着至关重要的作用。因为它允许它们吸收大量的血液，同时浓缩凝血成分、红细胞和血小板。这种结构促进了血小板在与血液接触时粘附和聚集，以形成血小板栓，从而阻止血液从伤口流出。此外，它还触发凝血相关因子的释放，促进稳定的凝块形成和有效的出血控制。

2、目前，大多数针对手术伤口和创伤的传统外科止血，首先使用可吸收剂压迫开放性伤口，然后使用组织粘合剂密封伤口。而骨骼作为人体内矿化和血管化的结缔组织，其内部有大量海绵状的松质骨和中央骨髓腔。一旦骨折，除了形成骨缺损外，还会有血液不断从这些微小孔隙中渗出。当面临严重的创伤和危急手术情况时,受损或切开的骨骼通常会遇到机械稳定性丧失、不规则缺陷形状、骨再生失败和出血等问题。目前传统的止血海绵材料与其他各种天然或合成的常规止血材料（例如水凝胶、绷带、生物粘合剂、生物胶等等）往往难以应对这样的骨止血特殊挑战——①骨骼解剖结构复杂挑战：骨组织（尤其是松质骨）具有多孔性和高血供特性，出血点分散且血窦丰富，传统止血材料难以贴合不规则表面，易因渗漏导致止血失败；②高压血流环境挑战：骨内血管（如髓腔血管）压力较高，常规物理封堵材料（如止血粉、绷带）易被血流冲散或无法形成有效屏障；③润湿界面黏附困难挑战：骨表面常存在血液、组织液或骨髓，湿润环境显著降低粘合剂（如纤维蛋白胶、氰基丙烯酸酯类）的界面结合强度。面对以上挑战，传统止血材料往往表现出力学性能不足、界面黏附薄弱、形态适配性差、残留风险高、操作复杂等缺陷。到目前为止，大多数止血材料已应用于皮肤、肝脏和肾脏等主要组织，关于骨止血的报道相对较少。骨止血材料的研究仍处于发展阶段，距离商业化应用还有很长的路要走。开发新型功能材料或改性后的传统材料以加速骨止血具有迫切意义。

3、人体中最坚硬的骨骼之一——颅骨，不仅起着维持头面部形态功能的作用，还发挥着保护脑组织的重要作用。颅骨损伤一般伴有脑损伤，这意味着颅骨作为创伤性脑损伤（tbi）发生之际的第一道防线，在保护大脑方面发挥着关键的初始作用。然而，在全球范围内，从1990年到2016年，估计与tbi相关的残疾增加了8.4%。大多数情况下，这种增加与跌倒和道路相关伤害率的增加有关。尽管人们已经做出了初级预防工作，但由于更频繁地使用机动车辆、不安全的路况和更高的酒精使用量，这个比率很可能会继续增加。此外，在一些冲突频发的中东国家或在街头暴力率高的国家，由于战争、犯罪而导致的tbi发生率近年来并未显著下降。也就是说，由各种头部外伤和手术引起的颅骨缺损在生活与临床中极易发生。值得注意的是，颅骨缺损的主要发生部位——颅顶骨因其具有圆顶状的独特形貌，在受到外力冲击时，往往因外力集中于一点而形成以受力点为中心、向四周放射形状的骨折线。尤其是儿童的颅顶骨由于弹性较大，在遭受外伤时很有可能发生凹陷性骨折。而在开颅手术中，近圆形颅顶骨的取出往往伴随着出血源复杂的持续渗血。由于颅顶骨位置的特殊性——临近脑组织和硬脑膜，颅骨止血需避免机械压迫，以防增加脑损伤。因此术中止血的操作空间较为狭小；由于开颅手术的高术野要求——血液积聚可能遮挡视野。故颅骨止血需快速高效止血以减少手术时间，降低感染与并发症风险。在骨组织中，止血反应的一个显著特征是在骨折的骨头末端之间产生一个大而明显的血凝块，这被称为“血肿”。血肿结构的形成可以维持骨组织中血管的完整性。最重要的是，它可以稳定骨折的终末状态，防止骨折碎片发生位移而损伤局部血管、脑膜、脑组织等关键结构的同时，帮助骨组织实现重塑，并促进炎症反应和肉芽组织形成。此外，骨止血的发生是促进最终目标骨愈合的关键阶段之一。血肿结构的生成可通过释放生长因子（如骨形态发生蛋白）来影响骨组织重塑细胞的迁移、血管生成和最终成骨。尽管颅骨缺损在现实中极易发生，但目前却鲜有报道适配于颅骨缺损出血特点的高效止血材料。总的来说，颅骨缺损出血具有以下独有特点与需求：①颅骨松质骨比例高，血窦丰富，出血点分散且呈多孔渗血；②临近脑组织和硬脑膜，硬膜下血管压力较低但易形成硬膜外血肿，止血材料需避免压迫脑组织或阻碍脑脊液循环；③需同时满足快速止血以暴露术中视野、骨再生空间保留的要求；④止血材料不可因机械强度过高或降解不匹配而影响后续骨修复（如骨水泥或钛网植入在颅骨缺损止血场景中就不太适用）。针对以上特点，我们拟构建一种生物安全的具有规则径向排列的“微渠”导液结构丝素止血海绵，可在术中对已知尺寸（如开颅手术中取出一定大小的头盖骨）的骨缺损进行快速止血，并在缺损末端形成血肿以促进下一阶段骨愈合的进行。

4、基于这一目的，如何成功实现构建具有规则径向排列的“微渠”导液结构丝素止血海绵是本课题的重点所在。定向冷冻铸造是一种基于冰晶模板的简单通用技术，在构建具有空心和对齐微通道结构的各种3d气凝胶方面受到广泛关注。在典型的冷冻铸造过程中，冰晶在低温下成核并沿温度梯度方向进行生长，形成具有高度取向的平行冰晶结构。通过冻干法去除冰晶模板，最终获得具有平行排列管道结构的三维海绵。此外，通过调节冰晶的形成和生长过程可实现对孔结构调控，以获得具有高度连通的孔结构。近些年来，定向冷冻冰模板铸造技术逐渐关注到了模具形状对材料孔道结构的影响，一批使用圆柱形模具以制备径向孔道的材料在各个应用领域涌现。在阅读学习这些材料的制备方法以后，我们选择使用具有快速导热性的圆柱形铜模具，以诱导冰晶从铜壁圆周的低温源出发，向中心生长。由于冰模板法的使用大多要求模具部分浸入液态低温环境（如液氮、液态乙醇），冰晶因底部受冷会具有发生向上生长的趋势，这将影响径向孔道生长。因此，我们特制了具有优异隔热性能的pvdf材料作为模具底部，来减少这一影响。

5、除了高效的物理止血手段，凝血级联反应的快速有效激活是止血的内在核心机制之一。然而，临床中常用的止血剂凝血酶（凝血因子iia（fiia））对环境温度、ph值和载体的性质高度敏感。商业凝血酶通常需要在4℃或以下储存以保持其酶活性。研究表明，在25℃下储存时，凝血酶纳米复合物会随着时间的推移而失去显着的酶活性。因此，目前可用的凝血酶最佳递送方法是冷链管理。然而，冷链配送消耗大量能源，限制了在资源稀缺地区的公平分配，并将安全储存和处理的责任转移到了消费者身上。在药物输送中，与直接装载到载体上的蛋白相比，在载体上原位生成的蛋白通常表现出更高的生物活性。因此，在载体上原位生成凝血酶可能是保持其生物活性的更有效方法。根据我们先前研究报道，shi等人开发了一种具有蛋白质电晕并携带具有高酶活性和卓越室温稳定性的血小板凝血酶递送平台（蛋白冠caco3@csf/ca2+-p），可在恶劣的生理条件下有效止血。鉴于此，我们在具有规则径向排列的“微渠”导液结构丝素止血海绵表面负载该高凝血活性蛋白冠颗粒，这一物理与生物双机制协同策略将有望实现颅骨缺损出血的快速高效止血。

6、针对颅骨止血问题，目前商业化的的解决方案及其相较于本发明的优缺点有以下几种：

7、（1）对于现有的电凝技术或超声骨刀技术，前者通过高频电流产生热量，使血管壁蛋白质变性闭合，后者通过高频超声振动精准切骨，减少血管损伤。然而，电凝技术伴随着高热损伤风险，尤其是在富含神经与脑组织的颅骨区域。其次，过度使用该技术将导致骨坏死，可能影响骨愈合，使术后骨瓣吸收风险增加。同时，电凝伴随烟雾干扰，需实时辅助抽吸，且有可能在过程中阻挡视野。电凝技术与超声骨刀技术不仅需要专门仪器，其效果还很大程度上取决于医生水平，具有较高的资金和人力资源成本。尤其是超声骨刀技术，若操作不当很可能导致骨裂。而本材料简单易得，成本低廉，仅需简单在颅骨缺损区域放置便可实现高效快速凝血，技术难度低，且可以节省术中时间；

8、（2）对于现有的骨蜡材料，机械封堵骨面渗血，价高且难以清除完全。这将导致其易作为异物阻碍成骨细胞活动，增加骨不连或感染风险。尤其在污染伤口中，很可能成为细菌定植的载体。另外，残留骨蜡容易在术后影像（如ct）中被误诊为病变，影响医生判断。本材料造价低廉，具有很好的生物相容性，采取一体设计，完成止血后整体取出以暴露手术视野，方便进行后续操作，不存在残留问题；

9、（3）对于现有的传统止血纱布或海绵（如普通海绵或明胶海绵），通过吸血膨胀压迫止血，不适用于颅骨区域。因为过度填塞可能压迫脑组织，尤其在小儿或空间狭窄区域难以使用。而本技术所研制的海绵遇液体有自收缩的性质。同时，因其内部的高孔隙率，仍能保持一定的吸液能力，消除了传统止血海绵的弊端；

10、（4）对于现有的生物胶材料（如纤维蛋白胶、氰基丙烯酸酯）或复合止血剂，通过模拟凝血级联反应或形成物理屏障来封闭出血点。然而，纤维蛋白胶含人/动物源成分，在价格显著高于传统材料的同时还可能引发过敏反应。其次，其强度略微不足，通常需要联合其他技术。例如每支造价数千元的floseal复合生物止血剂，由明胶基质与凝血酶复合而成。其在使用时需要预混步骤，在紧急情况下占用宝贵的抢救时间。而本技术选用易得的丝素和甘油作为原料，按照先前的技术制备负载原位生成凝血酶的蛋白冠颗粒，在接触到血液的瞬间引发凝血级联反应，高效凝血的同时，维持了较低的生产成本；

11、（5）对于现有的可吸收材料（如氧化再生纤维素surgicel、微纤维胶原avitene、壳聚糖基材料），分别具有如下缺点：氧化再生纤维素制造的酸性环境可能损伤神经，且不可用于感染伤口；微纤维胶原颗粒可能迁移至脑脊液，继而引发无菌性脑膜炎；壳聚糖基材料的临床数据有限，且粘附性往往在富含血液的潮湿环境中下降。而本技术使用的止血海绵，随用随弃，操作便捷。且蛋白冠颗粒与等比的质子化氨甲环酸共混，在接触血液之初，便会接触反应，消融颗粒同时维持中性或偏弱碱性环境；

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明提供一种具有规则径向排列导液结构的负载高凝血活性蛋白冠颗粒的止血海绵的制备方法，该方法制备的止血海绵有四个突出特点：其一，我们在传统的丝素甘油体系中加入了交联剂乙二醇二缩水甘油醚，在加强海绵机械强度的同时，解决了丝素甘油体系遇水易溶解的问题；其二，该海绵有一个独特的致密的径向排列层片结构，可以在吸收血液的过程中，物理截留直径约为6-9 μm的红细胞，同时源源不断地将血液中的小分子成分引流至材料内部，实现筛分，物理增大红细胞密度；其三，负载有原位生成凝血酶的蛋白冠颗粒在接触到水的瞬间引发凝血级联反应。物理与生物的双重止血机制协同实现高效快速凝血；其四，蛋白冠颗粒与质子化氨甲环酸颗粒等比混合负载，蛋白冠的caco3壳在遇水瞬间与酸反应自行消融，使创面没有粉末状颗粒残留，同时维持中性或偏弱碱性环境。

2、具体的说，为实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、（1）具有规则径向排列导液结构的丝素止血海绵制备：第一步，根据报道的文献，使用三元溶液溶解获得丝素溶液。首先，切开家蚕茧的两端以去除蚕蛹，手动剥除蚕茧周围的杂丝，从中获得预处理后的蚕茧。接着，对其进行脱胶。将家蚕茧(20 g)浸入浓度为0.02mol·l-1的na2co3溶液(2 l)，并在100℃下煮沸60 min。随后，用蒸馏水洗涤脱胶的丝素蛋白纤维数次，直至洗去杂质和na2co3，没有滑腻感。放入60℃烘箱干燥12 h。然后，将脱胶后的蚕丝纤维在80℃下溶解于三元溶液(cacl2:c2h5oh:h2o=1:2:8 mol)中2 h，浴比为1：10。将混合溶液倒入3500分子量的透析袋中透析三天，每天早中晚各换水一次。最后，将透析后的纯丝素溶液冷冻后放入冷冻干燥机干燥2~3 d，获得干燥的丝素蛋白以备后用。第二步，准备丝素甘油混合溶液。称取丝素蛋白重新溶解，以配成3% (w/v)的丝素蛋白溶液。分别加入不同质量的甘油以配成0~15% (w/w)的混合溶液（5%浓度时吸水能力最强）。根据报道的文献，在每10 ml浓度为11% (w/v)丝素蛋白溶液中分别添加0~200 μl的交联剂乙二醇二缩水甘油醚（egde），优选吸水能力最强的100 μl。根据文献与本技术中所使用的丝素蛋白浓度比，计算等比缩小后所需添加的egde体积。在常温下混合后，每10 ml混合溶液加入7 μl的四甲基乙二胺以催化反应，反应进行10 min。第三步，使用定向冷冻铸造技术进行径向冷冻。准备特制的圆柱形模具，使用快速导热的金属铜制作圆管（在本技术所给出的实施例中，我们制作了内径为3 cm、外径为4.6 cm、高为4 cm的圆管），底部使用厚为1 cm的隔热材料聚偏二氟乙烯（pvdf）进行隔热。在泡沫箱中倒入液氮，使液面高度略大于1 cm。往模具中倒入混合溶液，并立即将模具置入液氮中，等待冰晶从圆管壁向中心生长完全，将模具放入-80℃冰箱固定至少15 min。第四步，将模具放入冷冻干燥机冻干2~3 d，脱模后获得具有规则径向排列导液结构的丝素止血海绵。

4、（2）具有高凝血活性的蛋白冠（caco3@csf/ca2+-p）颗粒制备：按照和上述过程同样的步骤制备三元溶液溶解的丝素蛋白以备后用。第一步，根据报道的文献，将等体积的0.33 m cacl2和0.33 m na2co3混合30 s，将溶液静置10 min，然后用去离子水洗涤3次，并真空干燥合成caco3骨架。第二步，按照我们先前的技术，在caco3颗粒表面沉积多层壳聚糖（cs）/丝素蛋白（sf）膜（csf）。具体来说，预先制备0.5 mg·ml-1 cs溶液(0.1 m nacl, ph 5.5)和1 mg·ml-1 sf溶液(0.1 m nacl, ph 5.5)。其中在溶解cs前可加入500 μl醋酸促溶。酸碱性的调节均使用稀盐酸与浓naoh溶液。将caco3(2 wt%)浸入cs溶液中15 min，以2000 rpm离心1 min，用nacl溶液(0.1 m, ph 5.5)洗涤3次，然后浸入sf溶液中15 min，并以2000rpm离心收集1 min，用nacl溶液(0.1 m, ph 5.5)洗涤3次。这个过程重复1~5次，优选4次，凝血时间最短。其中，最后两次过程中的离心操作，均调节转速为1000 rpm。最后用去离子水洗涤三次并冻干得到类血小板前驱体caco3@csf。第三步，负载钙离子（ca2+）。将caco3@csf颗粒(50 mg)在cacl2溶液(0.6 m)中孵育3 h（37℃恒温振荡器中），用去离子水洗涤2次，冷冻后进行冷冻干燥，得到类血小板caco3@csf/ca2+。第四步，原位生成凝血酶。通过以3000 rpm的速度离心猪血10 min获得贫血小板血浆。贫血小板血浆存放在-80℃中直至使用。然后，在25℃下将caco3@csf/ca2+(0.1 g)混合在用0.9% nacl生理盐水稀释后的贫血小板血浆(400 μl, 50% (v/v))中3~5 min，直至不溶的絮状沉淀物生成。将所得沉淀物冻干以获得凝血酶递送平台——蛋白冠caco3@csf/ca2+-p颗粒。

5、（3）质子化氨甲环酸的制备：按照我们先前的技术，制备0.5 m氨甲环酸水溶液，用盐酸调节ph至4.0。经冷冻干燥得粉末状质子化氨甲环酸（txa-nh3+）。

6、（4）具有规则径向排列导液结构的负载高凝血活性蛋白冠颗粒的止血海绵的制备：先将caco3@csf/ca2+-p颗粒与txa-nh3+粉末进行摩尔比为1:1的物理混合。将径向海绵置入装有混合粉末的容器中轻摇5 min，通过静电吸附在海绵表面负载含有高凝血活性蛋白冠的混合颗粒。

7、根据本发明的第二方面，本发明提供上述具有规则径向排列导液结构的负载高凝血活性蛋白冠颗粒的止血海绵的使用方法。

8、上述具有规则径向排列导液结构的负载高凝血活性蛋白冠颗粒的止血海绵的使用方法，其特征在于：根据开颅手术中常见的缺损大小，预先裁割止血海绵，使其具有适合3~80 mm尺寸缺损的直径。大尺寸的海绵使用大尺寸的模具制作，小尺寸的海绵可使用小模具，或裁割得到。具体来说，在制备过程的第四阶段——负载蛋白冠颗粒步骤之前，将脱模径向海绵切割为厚度为1.5 cm的薄片，以适应人颅骨厚度，以免太厚压迫到脑神经或脑组织。将径向海绵薄片逐一浸入液氮3 s，取出9 s后立即使用不同尺寸直径的圆心割刀进行切割，以获得可适配不同缺损尺寸的径向海绵。负载含有高凝血活性蛋白冠的混合颗粒之后便可储存备用。术中，在钻孔部位出血时，可夹取止血海绵放于出血部位，海绵快速吸血导液收缩的同时，凝血酶颗粒激发凝血级联反应，进行快速止血。而混合颗粒相互反应自体消融，防止颗粒残留或迁移至其他部位。止血完成后，将海绵夹出，以便继续下一步操作。

9、有益效果：

10、本发明提供一种具有规则径向排列的“微渠”导液结构的负载高凝血活性蛋白冠颗粒的丝素甘油止血海绵，旨在通过物理引流与凝血激活双效协同机制解决颅骨缺损止血难题。当该材料应用于颅骨缺损出血时，拥有径向“微渠”导液结构的海绵从与之贴合的颅骨缺损界面吸收血液。由于其拥有狭小孔隙这一形态结构，毛细现象在此发生。同时，根据yong-laplace方程，周围大中心小的梯度孔道结构拥有比竖直孔道更优越的毛细能力，进而有更大的牵引力引导血液快速向海绵中心流动。在这个过程中，由于孔道的不断变窄，直径约为6-9 μm的红细胞受两侧层片阻挡，被截留在海绵圆周的一定区域，并不断堆积，在增大红细胞密度的同时形成血肿。不仅能够固定骨折碎片，防止因骨折碎片移动而损伤局部血管、脑膜及脑组织，进而引发严重并发症；而且有助于促进骨骼的愈合。血液中的水分则在海绵较大的吸水能力与毛细作用下源源不断地被引流至海绵的圆心区域。负载的蛋白冠颗粒接触到血液后被逐一激活，释放出凝血酶，诱发凝血级联反应，实现快速止血。综上所述，本技术将毛细能力诱发的物理引流与凝血酶激发的凝血级联反应相结合，拟构建一种具有快速止血、形成一定量血肿功能的具有规则径向排列“微渠”导液结构的负载高凝血活性蛋白冠颗粒的丝素止血海绵，通过物理、生物双机制协同发挥作用，为临床中的颅骨缺损止血难题提供了一种新的研究思路。