一种分级响应穿越血脑屏障的纳米载药囊泡及其制备方法与应用

本发明属于医药，更具体地，涉及一种分级响应穿越血脑屏障的纳米载药囊泡及其制备方法与应用。

背景技术：

1、脑胶质瘤是一类恶性程度高、预后极差的颅内肿瘤。当前临床治疗仍以手术切除与化疗为主，但由于肿瘤呈浸润性生长，与正常脑组织边界不清，手术难以彻底清除，术后复发率高；化疗药物又缺乏肿瘤靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时会损伤正常组织，带来明显毒副作用。受这些因素影响，患者中位生存期仅为12~18个月，5年生存率不足5%，且治疗相关并发症较为严重。

2、纳米医学的发展为提高药物疗效、降低毒副作用提供了新途径，但其在脑胶质瘤治疗中仍面临关键障碍—血脑屏障（bbb）。bbb由脑毛细血管内皮细胞、紧密连接、基膜和周细胞等构成，可保护中枢神经系统免受有害物质侵害，但也导致几乎所有大分子药物和98%以上小分子药物无法有效入脑。此外，纳米药物在脑胶质瘤内分布不均也进一步影响疗效。脑胶质瘤存在血流灌注不均、淋巴管缺失、细胞外基质致密及间质高压等特殊肿瘤微环境，且晚期肿瘤中心坏死、无血管分布，导致纳米药物多滞留于肿瘤外周，难以深入内部。为了加速药物释放并向肿瘤深部渗透，通常采用声动力治疗。而声动力治疗的疗效与空化效应的程度密切相关，若想要实现有效空化，则需使用微米级大囊泡，但微米级大囊泡易被网状内皮系统快速清除，降低血脑屏障的效率。若采用高功率聚焦超声强化空化效应，则易引发脑血管损伤、破裂出血，甚至导致蛋白外渗、脑水肿及炎症等严重副作用。

3、公开号为cn114452404a的现有技术公开了一种具备锚定和电荷翻转功能的囊泡及其制备和应用。该囊泡通过一系列聚合、氨解、酰胺化、脱保护等反应制备得到，具备优异的锚定和电荷翻转功能。该囊泡链接的锚定肽apoe可使囊泡高效锚定到颅内毛细血管内皮表面，在bbb表面的gtt作用下，其表面的特异性链段会被切断，暴露出氨基，电荷显著增高，促进了amt介导的内吞作用，使囊泡可高效穿越bbb；且该囊泡对ph与酶双敏感，可在肿瘤部位的微酸环境中膨胀到500nm以上，增强在超声作用下的空化效应，促进药物向肿瘤深处渗透。然而，该技术方案通过膨胀方式虽然可以实现囊泡尺寸的增大，但最终囊泡的尺寸仍处于纳米级别，导致空化效应有限，仍有待进一步提高。

4、因此，亟需开发一种可跨越血脑屏障且能利用微米级大囊泡实现有效空化的技术。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于针对现有技术的不足或缺陷，提供一种纳米载药囊泡的制备方法。

2、本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的纳米载药囊泡。该纳米载药囊泡在超声作用下，发生自组装团簇与膜融合，形成微米级的囊泡，增强超声空化效应，从而实现药物加速释放与向肿瘤深部渗透，提高疗效。

3、本发明的另一目的在于提供上述纳米载药囊泡在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

4、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案实现：

5、一种纳米载药囊泡的制备方法，包括如下步骤：

6、s1.在超声条件下，将含有聚合物dspe-peg-beaga2、聚合物dspe-peg-n3、抗癌药物和脂质体原料的溶液与含有声敏剂的溶液混合，形成乳液；

7、s2.在超声条件下，将步骤s1制得的乳液滴加入水中，诱导自组装形成基础囊泡，再将所述基础囊泡与apoe-dbco和聚合物4-arm-peg-phe-dbco孵育，即得所述纳米载药囊泡；

8、所述聚合物dspe-peg-beaga2的结构通式为：

9、，其中，n为6~10的正整数，m为35~55的正整数；

10、所述聚合物4-arm-peg-phe-dbco的结构通式为：

11、，其中，a为10~15的正整数。

12、本发明通过将聚合物dspe-peg-beaga2、聚合物4-arm-peg-phe-dbco加载在纳米囊泡表面上。在apoe肽的靶向作用下，将纳米囊泡靶向并锚定在bbb的表面上，再通过bbb表面的γ-谷氨酰转移酶（ggt）作用，聚合物dspe-peg-beaga2发生酶响应并释放伯胺，提升表面正电性，促进了amt介导的内吞作用，使纳米囊泡可高效穿越bbb，不易被网状内皮系统清除。同时，聚合物4-arm-peg-phe-dbco还可以限制纳米囊泡在穿越血脑屏障时与bcecs膜融合而降低穿透效率。当穿越bbb后，纳米囊泡在肿瘤组织部位聚集，聚合物4-arm-peg-phe-dbco触发酸响应并发生断键，在聚合物dspe-peg2k-beaga2剩余链段的作用下，纳米囊泡发生组装团簇并触发纳米囊泡之间的膜融合，成为微米级的大囊泡，进而可以在超声作用下实现空化效应，促进药物向肿瘤深处渗透。

13、在囊泡膜融合过程中，聚合物dspe-peg-beaga2中的dspe链段具有关键性作用，其含有磷脂基团，与脂质体的相容性良好，从而可以提高囊泡膜融合程度，进而使囊泡可以通过膜融合成为微米级的大囊泡。若将聚合物dspe-peg-beaga2中的dspe链段替换为其他不合适的链段，如聚乙二醇衍生物(如mpeg-oh)、无规聚醚或pdhd基团等，这类链段缺乏长链疏水尾部，无法有效插入脂质体膜的疏水双层中，仅能通过微弱的范德华力吸附于膜表面。这种浅层吸附不足以提供足够的膜扰动能和曲率形变能，导致膜融合程度有限，无法驱动囊泡成为微米级的大囊泡。

14、在囊泡膜融合过程中，聚合物4-arm-peg-phe-dbco同样具发挥着关键作用。针对脑胶质瘤的微酸性肿瘤微环境，本发明采用ph响应设计。这不仅响应更稳定，还能使聚合物4-arm-peg-phe-dbco上的酰胺键在微酸条件下快速断裂，从而切除限制膜流动性的peg长链，解除膜融合的抑制，驱动囊泡迅速完成膜融合，最终生长为微米级的大囊泡。若采用其他响应方式（如酶响应或ros响应），往往因触发解锁的稳定性不足，导致限制膜融合的基团脱落不完全，膜融合程度受限，最终难以使囊泡达到所需的微米级尺寸。

15、优选地，所述纳米载药囊泡的平均粒径为50~200nm。

16、优选地，所述聚合物dspe-peg-beaga2、聚合物dspe-peg-n3、脂质体原料和抗癌药物之间的质量比为2.5~3：1.5~2：36~45：1。

17、本发明中，所述脂质体原料可以选用本领域常见的脂质体原料，例如是：卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂乙醇胺、二棕桐酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆酰磷酸乙醇胺、二硬脂疏磷脂酰乙醇胺、二棕桐酰磷脂酰甘油或二油磷脂酰甘油中的一种或几种。优选地，所述脂质体原料为卵磷脂、胆固醇和磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。更优选地，所述脂质体原料为卵磷脂、胆固醇和磷脂酰乙醇胺。

18、优选地，所述卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺的质量比为1~3：1~2：1。

19、优选地，所述聚合物dspe-peg-n3中n3基团与所述apoe-dbco中dbco基团与所述聚合物4-arm-peg-phe-dbco中dbco基团的摩尔比为8：3~5：1~3。

20、本发明中，所述“dspe-peg-n3”可以来源于市售产品，也可以自制，制备方法不作特别限制，能够制备得到所述dspe-peg-n3均可。优选地，所述dspe-peg-n3中peg链段的聚合度为77，即所述dspe-peg-n3为dspe-peg3.4k-n3。

21、本发明中，所述“apoe-dbco”指的是将载脂蛋白e（apoe）肽段与二苯并环辛炔（dbco）基团进行化学偶联的产物。所述apoe-dbco可以来源于市售产品，也可以自制，制备方法不作特别限制，能够制备得到所述apoe-dbco均可。

22、本发明中，所述抗癌药物可以选用本领域常见用于治疗脑胶质瘤的抗癌药物，例如是：地西他滨、替莫唑胺或洛莫司汀中的一种。

23、优选地，所述含有聚合物dspe-peg-beaga2、聚合物dspe-peg-n3、抗癌药物和脂质体原料的溶液中的溶剂为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、三氯甲烷或甲醇中的一种或几种。优选为三氯甲烷和甲醇的混合溶液。进一步优选地，所述三氯甲烷与甲醇的体积比为1：1。

24、本发明中，所述声敏剂可以选用本领域常见的声敏剂，例如是：irgd-ild、血卟啉或吲哚菁绿（icg）中的一种。优选地，所述声敏剂为irgd-ild。

25、优选地，步骤s1中，所述乳液还包括超声造影剂。加入超声造影剂后，所述纳米载药囊泡可应用于mr成像。

26、本发明中，所述超声造影剂可以选用本领域常见的超声造影剂，例如是：五氟丁烷、全氟丙烷、全氟己烷中的一种。优选地，所述超声造影剂为五氟丁烷。

27、优选地，所述聚合物dspe-peg-beaga2通过如下步骤制备而得：

28、s11.将dspe-peg-nh2与n,n'-二芴甲氧羰基-d-赖氨酸发生酰胺化反应，得到dspe-peg-lys-fmoc；

29、s12.脱去dspe-peg-lys-fmoc中fmoc保护基团，得到dspe-peg-lys，再与n-芴甲氧羰基-l-2-氨基丁酸发生酰胺化反应，得到dspe-peg-(abu-fmoc)2；

30、s13.脱去dspe-peg-(abu-fmoc)2中fmoc保护基团，得到dspe-peg-abu2，再与boc-glu发生酰胺化反应，得到dspe-peg-(abu-glu-boc)2；

31、s14.脱去dspe-peg-(abu-glu-boc)2中boc保护基团，得到所述聚合物dspe-peg-beaga2。

32、优选地，步骤s11中，所述dspe-peg-nh2中peg链段的聚合度为40~50。

33、更优选地，步骤s11中，所述dspe-peg-nh2中peg链段的聚合度为45，即所述dspe-peg-nh2为dspe-peg2k-nh2。

34、优选地，步骤s11中，所述dspe-peg-nh2与n,n'-二芴甲氧羰基-d-赖氨酸的摩尔比为1：2~4。

35、优选地，步骤s11中，所述酰胺化反应的时间为20~24h。

36、优选地，步骤s11中，所述酰胺化反应后，还需要进行后处理。所述后处理为：将反应液转移至透析袋中，分别用甲醇和超纯水透析6~8h，将透析后的产物冷冻干燥。

37、进一步优选地，步骤s11中，所述酰胺化反应为：将dspe-peg-nh2和n,n'-二芴甲氧羰基-d-赖氨酸溶解于有机溶剂中，加入活化剂和稳定剂，搅拌反应。

38、本发明所述酰胺化反应中，所述活化剂可选自本领域熟知可用于酰胺化反应的活化剂，优选为edc。本领域技术人员熟知，在酰胺化反应中，所述活化剂的常规用量为羧基底物摩尔量的1.0~1.5倍。

39、本发明所述酰胺化反应中，所述稳定剂可选自本领域熟知可用于酰胺化反应的稳定剂，优选为nhs。本领域技术人员熟知，在酰胺化反应中，所述稳定剂的常规用量为羧基底物摩尔量的1.0~1.5倍。

40、本发明所述酰胺化反应中，所述有机溶剂可以选用本领域常见的有机溶剂，例如是：二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺中的一种或几种。优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷和二甲基亚砜。进一步优选地，所述二氯甲烷与二甲基亚砜的体积比为5：2。

41、优选地，步骤s11的反应方程式如下所示：

42、。

43、优选地，步骤s12中，所述脱去dspe-peg-lys-fmoc中fmoc保护基团的方法为：将dspe-peg-lys-fmoc的fmoc溶解于有机溶剂中，加入哌啶反应20~30min，即得dspe-peg-lys。

44、进一步优选地，所述反应完成后，还需要进行后处理。所述后处理为：将反应液转移至透析袋中，分别用甲醇和超纯水透析6~8h，将透析后的产物冷冻干燥。

45、进一步优选地，所述有机溶剂包括二甲基亚砜。

46、进一步优选地，所述哌啶在有机溶剂中的体积占比为15~25%。最优选地，为20%。

47、进一步优选地，所述反应的时间为30min。

48、优选地，步骤s12中，所述dspe-peg-lys与n-芴甲氧羰基-l-2-氨基丁酸的摩尔比为1：2~4。

49、优选地，步骤s12中，所述酰胺化反应的时间为20~24h。

50、优选地，步骤s12中，所述酰胺化反应后，还需要进行后处理。所述后处理为：将反应液转移至透析袋中，分别用甲醇和超纯水透析6~8h，将透析后的产物冷冻干燥。

51、进一步优选地，步骤s12中，所述酰胺化反应为：将dspe-peg-lys与n-芴甲氧羰基-l-2-氨基丁酸（fmoc-abu-oh）溶解于有机溶剂中，加入活化剂和稳定剂，搅拌反应。

52、本发明所述酰胺化反应中，所述活化剂可选自本领域熟知可用于酰胺化反应的活化剂，优选为edc。本领域技术人员熟知，在酰胺化反应中，所述活化剂的常规用量为羧基底物摩尔量的1.0~1.5倍。

53、本发明所述酰胺化反应中，所述稳定剂可选自本领域熟知可用于酰胺化反应的稳定剂，优选为nhs。本领域技术人员熟知，在酰胺化反应中，所述稳定剂的常规用量为羧基底物摩尔量的1.0~1.5倍。

54、本发明所述酰胺化反应中，所述有机溶剂可以选用本领域常见的有机溶剂，例如是：二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺中的一种或几种。优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷和二甲基亚砜。

55、优选地，步骤s12的反应方程式如下所示：

56、。

57、优选地，步骤s13中，所述脱去dspe-peg-(abu-fmoc)2中fmoc保护基团的方法为：将dspe-peg-(abu-fmoc)2溶解于有机溶剂中，加入哌啶反应20~30min，即得dspe-peg-abu2。

58、进一步优选地，所述反应完成后，还需要进行后处理。所述后处理为：将反应液转移至透析袋中，分别用甲醇和超纯水透析6~8h，将透析后的产物冷冻干燥。

59、进一步优选地，所述有机溶剂包括二甲基亚砜。

60、进一步优选地，所述哌啶在有机溶剂中的体积占比为15~25%。最优选地，为20%。

61、进一步优选地，所述反应的时间为30min。

62、优选地，步骤s13中，所述dspe-peg-abu2与boc-glu的摩尔比为1：2~4。

63、优选地，步骤s13中，所述酰胺化反应的时间为20~24h。

64、优选地，步骤s13中，所述酰胺化反应后，还需要进行后处理。所述后处理为：将反应液转移至透析袋中，分别用甲醇和超纯水透析6~8h，将透析后的产物冷冻干燥。

65、进一步优选地，步骤s13中，所述酰胺化反应为：将dspe-peg-abu2与boc-glu溶解于有机溶剂中，加入活化剂和稳定剂，搅拌反应。

66、本发明所述酰胺化反应中，所述活化剂可选自本领域熟知可用于酰胺化反应的活化剂，优选为edc。本领域技术人员熟知，在酰胺化反应中，所述活化剂的常规用量为羧基底物摩尔量的1.0~1.5倍。

67、本发明所述酰胺化反应中，所述稳定剂可选自本领域熟知可用于酰胺化反应的稳定剂，优选为nhs。本领域技术人员熟知，在酰胺化反应中，所述稳定剂的常规用量为羧基底物摩尔量的1.0~1.5倍。

68、本发明所述酰胺化反应中，所述有机溶剂可以选用本领域常见的有机溶剂，例如是：二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺中的一种或几种。优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷和二甲基亚砜。

69、优选地，步骤s13的反应方程式如下所示：

70、。

71、优选地，步骤s14中，所述脱去dspe-peg-(abu-glu-boc)2中boc保护基团的方法为：将dspe-peg-(abu-glu-boc)2溶于三氟乙酸（tfa），搅拌反应；随后，将反应液滴加至不良溶剂中，直至沉淀完全析出，收集沉淀并加入有机溶剂重新溶解沉淀，透析、冷冻干燥。

72、进一步优选地，所述反应为30~60min。

73、进一步优选地，所述不良溶剂为乙醚。

74、进一步优选地，收集沉淀还包括洗涤的步骤。

75、进一步优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷。

76、作为一个具体的示范例，步骤s14为：将dspe-peg-(abu-glu-boc)2溶于三氟乙酸（tfa），搅拌反应30~60min；随后，将反应液在搅拌下逐滴滴加至乙醚中，直至沉淀完全析出；洗涤并收集所得沉淀，加入二氯甲烷重新溶解沉淀，并依次用甲醇和超纯水透析6~8h，将透析后的产物冷冻干燥。

77、优选地，所述聚合物4-arm-peg-phe-dbco通过如下步骤制备而得：

78、s21.将2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧基-3-呋喃丙酸中的羧基活化为酰氯基，得到2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧基-3-呋喃丙酰氯；

79、s22.将4-arm-peg-oh溶解于溶剂中，加入2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧基-3-呋喃丙酰氯发生酯化反应，分离得到4-arm-peg-cdm；

80、s23.将4-arm-peg-cdm溶解于溶剂中，加入dbco-nh2发生开环反应，分离得到所述聚合物4-arm-peg-phe-dbco。

81、优选地，步骤s21中，所述4-arm-peg-oh中peg链段的聚合度为11~13。

82、更优选地，步骤s21中，所述4-arm-peg-oh中peg链段的聚合度为11，即所述4-arm-peg-oh为4-arm-peg0.5k-oh。

83、优选地，步骤s21中，所述羧基活化为酰氯基的方法为：将2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧基-3-呋喃丙酸和催化剂溶解于有机溶剂中，将草酰氯滴加至体系中，搅拌反应，旋蒸，得到2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧基-3-呋喃丙酰氯。

84、进一步优选地，所述有机溶剂为无水二氯甲烷。

85、进一步优选地，所述催化剂为n,n-二甲基甲酰胺。

86、进一步优选地，所述反应为3~5h。

87、优选地，步骤s22中，所述4-arm-peg-cdm与2,5-二羟基-4-甲基-2,5-二氧基-3-呋喃丙酰氯的摩尔比为1：4~7。

88、优选地，步骤s22中，所述溶剂为二氯甲烷。

89、优选地，步骤s22中，所述酯化反应的催化剂为吡啶。

90、优选地，步骤s22中，所述酯化反应的时间为3~5h。

91、优选地，步骤s22中，所述分离包括如下步骤：加入终止反应剂，分离获得有机相，干燥，抽滤获得滤液，随后在不良溶剂中滴加滤液，直至沉淀完全析出，获得沉淀并干燥。

92、进一步优选地，所述终止反应剂为饱和氯化铵。

93、进一步优选地，所述不良溶剂为无水乙醚。

94、作为一个具体的示范例，步骤s22中所述分离为：加入饱和氯化铵终止反应，分液漏斗分离有机相；在有机相加入过量的na2so4进行干燥，抽滤获得滤液；在无水乙醚中逐滴滴加滤液，直至沉淀完全析出，离心分离获得沉淀，干燥12h以上。

95、优选地，步骤s23中，所述4-arm-peg-cdm与dbco-nh2的摩尔比为1：1~3。

96、优选地，步骤s23中，所述溶剂为二氯甲烷。

97、优选地，步骤s23中，所述开环反应的催化剂为n,n-二甲基甲酰胺。

98、优选地，步骤s23中，所述开环反应时间为24~26h。

99、优选地，步骤s23中，所述分离为包括如下步骤：将反应液滴加至不良溶剂中，直至沉淀完全析出，分离获得沉淀，干燥。

100、优选地，所述聚合物4-arm-peg-phe-dbco的反应方程式如下所示：

101、。

102、优选地，步骤s2中，所述诱导自组装形成基础囊泡后还包括透析纯化的步骤。

103、优选地，步骤s2中，所述混合后还包括低温超滤浓缩的步骤。

104、上述制备方法制备得到的纳米载药囊泡也在本发明的保护范围内。

105、上述纳米载药囊泡在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用也在本发明的保护范围内。

106、优选地，上述纳米载药囊泡在制备超声作用下治疗脑胶质瘤药物中的应用。

107、优选地，上述纳米载药囊泡在制备能膜融合成为微米级的囊泡进而在超声作用下治疗脑胶质瘤药物中的应用。

108、进一步优选地，所述微米级的囊泡的平均粒径为1~2μm。

109、与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

110、本发明制备的纳米囊泡具备优异的锚定、电荷翻转和膜融合功能。加载在纳米囊泡表面的聚合物dspe-peg-beaga2和聚合物4-arm-peg-phe-dbco不仅使纳米囊泡在apoe肽的靶向作用下锚定在bbb的表面并顺利、高效穿越bbb，而且在纳米囊泡穿越bbb之后，聚合物dspe-peg-beaga2的特定链段和聚合物4-arm-peg-phe-dbco的ph响应设计都有利于纳米囊泡会发生自组装团簇并触发膜融合，成为微米级的大囊泡，进而可以在超声作用下实现空化效应，提高疗效。