用于细胞靶向的靶向蛋白降解的多价树枝状聚合物缀合的PROTAC

本发明总体上属于用于靶向递送的药物缀合物的领域，具体地为设计为蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimeras, protac）的树枝状聚合物，用于细胞内递送以利用细胞的蛋白质降解机制。相关申请的交叉引用本技术要求2024年1月22日提交的u.s.s.n.63/623,573的优先权，其以整体并入本文。关于联邦资助研究的声明没有。

背景技术：

1、通常使用基于核酸的技术（包括rna干扰（rnai）和crispr/cs9介导的基因敲除技术）在转录水平上实现靶向蛋白质的减少。然而，由于代谢稳定性差、脱靶效应和潜在的免疫原性，基于核酸的分子的更安全且更有效的细胞内递送备受挑战。此外，许多致病蛋白质在该蛋白质上缺乏特定的靶向表面来通过传统的小分子抑制剂或抗体抑制蛋白质功能。

2、蛋白降解靶向嵌合体，即protac，由crews和同事在2001年发现，正成为一种有前景的依赖于靶向蛋白质降解的治疗策略（pettersson et al., drug discov todaytechnol.2019 apr; 31:15-27. doi:10.1016/j.ddtec.2019.01.002）。protac通过利用细胞自身的破坏机制来去除特定的疾病相关蛋白，条件是它们可以被稳定地带入细胞。protac是含有至少两个结合结构域的异双官能分子，其中所述至少两个结合结构域通过含有5-15个原子的间隔子共价连接。protac被设计为同时将一端（邻近诱导调节剂元件）和生物分子例如e3泛素（e3）连接酶（von hippel-lindau或cereblon）结合，同时将另一端（蛋白质结合元件）和目标蛋白质（poi）结合。从机制上讲，在与poi结合后，protac将e3连接酶招募到poi，并引起靶的邻近诱导泛素化，随后其被泛素-蛋白酶体系统（ups）降解。protac经历催化型机制，其中将protac循环使用以靶向另一拷贝的poi。由于其催化性质，protac被称为“可编程的必需激活剂”。protac可以被编程以靶向任何poi。protac的存在对于泛素化转移是必不可少的。protac以催化方式激活三元复合物的形成。

3、e3连接酶例如mdm2、crbn和vhl的小分子配体有利于扩宽潜在的靶范围。protac技术已被广泛应用于包括细胞质蛋白、膜结合核蛋白和跨膜蛋白的许多不同的蛋白质靶。然而，迄今为止，仅报道了有限数量的（约50个）poi-protac。这些主要是蛋白激酶例如bcr-ab1、btk、c-abl、alk、cdk4/cdk6、cdk8、cdk9、pi3k、abl、flt-3、akt1-3、fak、tbk1、sgk3、irak4、egfr、ptk2、mek1、mek2、trkc、jak、plk1、ck2、mcl1、bcl-2/bcl-xl和wee1，核受体例如ar、era、细胞视黄酸结合蛋白（crabp），转录调控因子例如brd4、bet、hdac6、bcl6、prin、mdm2、stat3、smad3、aiolos（ikzf3）、ikaros（ikzf1）、ikzf、prc2（eed、ezh2）和suz12，以及调节蛋白质例如ripk2、sirtuin 2、pcaf/gcn5、fkbp12、parp1和tgf-β。两种化合物目前正在用于治疗前列腺癌和乳腺癌的临床试验中。

4、尽管最近已作出诸多努力，但是由于膜通透性差、药代动力学不佳、向靶位点和靶细胞的递送不足以及体内疗效低，因此基于protac的药物开发仍受到限制。将protac成功递送到靶细胞中、减少脱靶副作用、以及改善高效降解剂构建和连接子设计，是protac向治疗应用转化的主要难点。

5、近年来，双官能药物领域经历了显著的进展，涵盖了例如蛋白降解靶向嵌合体（protac）、溶酶体靶向嵌合体（lysosome targeting chimeras, lytac）、分子胶和rna干扰靶向嵌合体（rna interference-targeting chimeras，riptac）等的治疗形式。这些创新药物类别利用双官能性的力量来实现其治疗效果，充当不同靶分子之间的连接器以促进其在细胞环境中的降解、调节或重新定位。例如，protac发挥作用是通过将e3泛素连接酶招募到靶蛋白处，导致靶蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体降解。参见图6。双官能团总体由和一个“效应物”结合分子连接的一个“靶”结合分子组成；在protac的情况下，其是e3连接酶作为效应物，靶（例如egfr）的小分子结合剂作为靶结合剂。这些双官能团药物在攻克以前不可成药的靶以及克服耐药机制方面具有巨大的前景，从而为新的治疗机会铺平了道路。

6、尽管双官能团药物在彻底改变疾病治疗方面具有潜力，但阻碍其临床转化的关键挑战之一是将这些大的、通常是疏水的、高电荷的分子高效且靶向递送到细胞中。由于这些分子的尺寸、易于酶促降解和膜渗透性差，传统的药物递送方法例如口服给药或静脉给药可能不太适合这些分子。而且，由健康细胞的非特异性摄取和从循环中的快速清除可能会导致靶位点处的治疗浓度未达到最佳标准，并增加脱靶效应的风险。为了克服这些递送挑战，研究人员探索了各种策略（包括使用纳米载体、细胞穿膜肽和生物缀合方法）以增强细胞摄取、延长循环时间并最小化脱靶效应。然而，开发稳固、安全和高效的递送系统仍然是双官能团药物临床转化中的一个重大难关，需要进一步的研究和优化以释放其全部的治疗潜力。目前，没有纳米颗粒-双官能团药物或用于双官能药物的控释/药物递送系统处于临床开发中。

7、已经使用例如抗体-protac、叶酸-protac和适配体-protac缀合物的配体，对protac的靶向递送进行了研究。与常规protac相比，这些修饰显示出体外细胞摄取的改善以及体内肿瘤积累和抗肿瘤效力的增加。然而，即使这些修饰也不能完全解决血清稳定性低、protac精确递送到特异性靶组织和高效poi降解的问题。

8、改进连接子设计仍然是降解剂开发中的一个重大挑战。将靶向蛋白质的部分（例如小分子或抗体）和泛素连接酶招募因子转化为单一的功能性降解剂构建体备受挑战。该过程需要有效形成三元复合物且同时保持对蛋白质靶和泛素连接酶两者的强结合亲和力。

9、因此，本发明的目的是提供一个递送平台，用于靶向递送降解剂构建体（例如protac或蛋白质结合剂和泛素连接酶招募因子的组合）且同时保护这些有效载荷免受降解。

技术实现思路

1、已经开发了含有树枝状聚合物（dendrimer）和（i）protac的元件和/或（ii）protac的缀合物。这些缀合物通过增加向炎症部位（例如脑中的炎症部位）的选择性递送以及在该炎症部位处的摄取来提高protac技术的功效。可以选择树枝状聚合物来增加靶向递送，例如使用基于糖的树枝状聚合物或羟基化树枝状聚合物增加向诸如脑的区域内的递送。

2、优选的树枝状聚合物是羟基化pamam（例如第6代羟基pamam）、和/或糖树枝状聚合物（例如第2代葡萄糖树枝状聚合物，由24个葡萄糖分子构成且含有96个表面羟基）。protac包括（一个或多个）邻近诱导调节剂元件和（一个或多个）蛋白质结合元件。邻近诱导调节剂元件和e3泛素（e3）连接酶（von hippel-lindau或cereblon）结合，而蛋白质结合元件和待降解的目标蛋白质结合。

3、在一个实施方案中，缀合物包括通过连接子和protac的元件共价缀合的树枝状聚合物，该连接子优选含有酯键、醚键、酰胺键或它们的组合。在这些实施方案中，每个protac元件独立地和树枝状聚合物共价缀合，并且树枝状聚合物和protac元件之间的键是不可裂解的。连接子可以是可裂解的或不可裂解的。邻近诱导调节剂元件和受体结合元件通过含有5-15个碳原子或其他原子的合适间隔子彼此共价缀合。protac通过合适的间隔子与这些树枝状聚合物缀合。

4、缀合物可用于靶向细胞内递送以实现错误折叠的蛋白质和/或疾病相关蛋白质（优选位于细胞质中的蛋白质）的降解，以使得缀合物可以利用细胞的细胞内蛋白质降解机制。缀合物可以如下方式进行给药：静脉内、口服、皮下、腹膜内、经皮、鼻内或它们的组合，并且可以根据剂量和药代动力学每天一次、每隔一天一次、每周一次或每月一次进行给药。

5、缀合物可以穿入中枢神经系统（包括穿透血脑屏障），因此可用于治疗神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或肌萎缩侧索硬化（als）。此外，可以将缀合物递送到身体内的特定细胞，例如神经元、反应性免疫细胞、反应性小胶质细胞、巨噬细胞、星形胶质细胞、视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞（rpe细胞）。