一种可激活血脑屏障穿透型大环靶向蛋白降解嵌合体及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种可激活血脑屏障穿透型大环靶向蛋白降解嵌合体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、靶向蛋白降解技术，特别是蛋白降解靶向嵌合体（protacs），为突破传统小分子抑制剂的局限性提供了颠覆性新思路。protacs可招募e3泛素连接酶至目标靶点蛋白，通过邻近效应诱导靶蛋白泛素化修饰，进而经由蛋白酶体途径实现靶蛋白降解，能够彻底清除致病蛋白，而非仅占据蛋白活性位点。然而，protacs应用于中枢神经系统疾病的临床转化仍受多重因素严重制约：（1）分子量大、细胞膜穿透性差；（2）对病理性蛋白亚型选择性不足；（3）血脑屏障（bbb）穿透效率低，尤其在衰老大脑中递送效能大幅衰减。

2、细胞穿膜肽（cpps）作为药物递送载体具有潜在前景，但存在缺乏细胞类型特异性、高浓度毒性、血液清除速度快等问题。传统环化策略虽可增强稳定性，但靶向性未达到预期。更为关键的是，现有基于阳离子细胞穿透肽的bbb穿透策略，因非特异性膜吸附特性及潜在神经毒性，严重阻碍了其临床转化。

3、衰老过程中血脑屏障发生显著病理重塑，小窝介导的转胞吞作用呈上调趋势，这为适配衰老bbb转运通路的新型递送系统开发提供了内源性优势。然而，目前主流的受体介导转胞吞递送体系无法有效利用这一病理特征，在阿尔茨海默症（ad）高发的老年个体中递送效能不足。因此，急需开发能够同时适配衰老bbb病理特征、实现高效中枢递送，并可精准选择性降解病理蛋白的新型治疗策略。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种血脑屏障渗透性大环靶向嵌合体及其制备方法和应用，旨在解决现有技术中的至少一个技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提供一种可激活血脑屏障穿透型大环靶向蛋白降解嵌合体，其结构式为ros-vhl-linker1-tp-linker2-ctp-alkf-2；

3、其中，ros为活性氧响应基团，vhl为e3泛素连接酶配体，tp为靶向肽，ctp-alkf-2为血脑屏障穿透性大环肽，linker1为用于连接vhl与tp的连接子，linker2为用于连接tp与ctp-alkf-2的连接子。

4、进一步地，所述ctp-alkf-2的结构式如式1所示：

5、

6、式1。

7、式1结构包含全氟烷基修饰的环状骨架，可高效渗透衰老血脑屏障并靶向神经元。

8、进一步地，所述ros为苯硼酸基团。苯硼酸基团通过三光气与e3泛素连接酶配体中的羟脯氨酸结构域连接形成可逆性屏蔽。

9、进一步地，所述vhl的结构式如式2、式3或式4所示：

10、

11、式2

12、

13、式3

14、

15、式4。

16、进一步地，所述tp为dapk1靶向肽，dapk1靶向肽为源自glun2b亚基的识别肽，氨基酸序列包含kknrklrrqhsy。该肽段特异性结合处于活化构象（即去磷酸化状态）的dapk1，从而实现对病理激活态dapk1的精准靶向降解。

17、进一步地，所述tp的结构式如式5、式6、式7、式8或式9所示：

18、

19、式5

20、

21、式6

22、

23、式7

24、

25、式8

26、

27、式9。

28、进一步地，所述linker2选用6-氨基己酸（ahx）；所述linker1选自以下柔性烷基链连接子、刚性环状连接子中的任意一种：

29、柔性烷基链连接子：c3、c5、c7、c9；

30、刚性环状连接子：顺式环己烷、反式环己烷。

31、研究表明，连接子的立体构型与刚性对匹配功能性三元复合物组装所需的空间距离与取向具有决定性作用。柔性连接子过度柔性的构象不利于e3-连接子-靶蛋白稳定形成；而顺式环己烷连接子易呈现空间扭曲构象，空间位阻增大，破坏靶蛋白与e3泛素连接酶的空间取向匹配。反式环己烷刚性连接子表现出最优的降解活性。

32、进一步地，所述可激活血脑屏障穿透型大环靶向蛋白降解嵌合体的结构式如式10所示：

33、

34、式10。

35、本发明还提供一种上述的可激活血脑屏障穿透型大环靶向蛋白降解嵌合体的制备方法，包括以下步骤：

36、（1）采用标准固相多肽合成法制备出tp-linker2-ctp-alkf-2；

37、（2）将ros修饰在vhl上，然后通过linker1与tp-linker2-ctp-alkf-2偶联。

38、本发明还提供一种上述的可激活血脑屏障穿透型大环靶向蛋白降解嵌合体在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。所述神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症。

39、本发明还提供一种上述的可激活血脑屏障穿透型大环靶向蛋白降解嵌合体在制备药物递送载体中的应用。作为载体时，药物连接在ctp-alkf-2上，所述药物包括但不限于荧光标记物（如cy5）、化疗药物、神经保护剂中的任意一种。

40、本发明的设计思路及原理：

41、本发明聚焦ad治疗两大难题：衰老血脑屏障（bbb）递送和病理蛋白亚型选择性降解。现有技术在这两方面均存在显著缺陷。传统策略依赖内源性受体介导转胞吞，但随年龄增长，脑内皮细胞转运机制向小窝介导转运转变，导致老年个体递送效率急剧降低。而ad高发人群正是老年人，形成根本性矛盾。现有protac无法区分病理型与生理稳态型靶蛋白，存在“脱靶降解”风险。dapk1参与突触可塑性等重要生理功能，非选择性降解将带来严重安全隐患。

42、以dapk1靶向肽为例，系统性设计方案：

43、1. bbb穿梭模块：采用“大环化+全氟脂肪族交联修饰”策略。血脑屏障穿透性大环肽具备构象稳定性和膜渗透能力，氟原子的高电负性、强偶极相互作用和两亲性，促进与脂质烷基链结合，触发小窝介导内吞路径。该路径不依赖内源性受体，在衰老个体中仍能高效穿透bbb，解决年龄依赖性递送失效问题。

44、2.靶向配体选择：采用源自glun2b亚基的识别肽，特异性结合去磷酸化活化态dapk1。ad病理状态下dapk1异常激活呈去磷酸化构象；生理稳态型则处于磷酸化抑制状态。该肽通过构象选择性识别，精准靶向病理激活态，不干扰生理稳态型功能。

45、3.连接子优化：系统筛选不同柔性与刚性连接子，发现反式环己烷刚性连接子最优匹配三元复合物组装所需的空间距离与取向。分子动力学模拟证实，该连接子可使protac同时与dapk1及e3连接酶稳定结合，赋予最优降解活性。

46、4.条件性激活设计：利用苯硼酸基团对vhl配体中的羟脯氨酸进行可逆屏蔽。基于ad神经元中特异性升高的ros水平，实现活性protac在病变神经元内的靶向释放，选择性降解致病性dapk1，降低全身非特异性蛋白降解，提升治疗特异性与安全性。激活条件为活性氧（ros）富集的反应环境，优选h2o2浓度≥100 μm的病理微环境，如阿尔茨海默症病变神经元中的高ros微环境。

47、基于上述模块化设计，本发明构建兼具“衰老bbb高效穿透-病理选择性识别-病变微环境条件性激活-多通路病理干预”四大功能的大环靶向嵌合体，为ad治疗提供全新技术方案。

48、本发明的有益效果体现在：

49、（1）突破年龄相关血脑屏障递送瓶颈：现有技术依赖内源性受体介导转胞吞，随年龄增长受体下调导致递送效率下降；本发明采用"大环化+全氟脂肪族交联"设计，触发小窝介导内吞路径，不依赖内源性受体，在衰老个体中仍高效穿透血脑屏障并靶向神经元。实验证实，衰老小鼠脑中积累量是青年小鼠的2.01倍，解决年龄依赖性递送失效问题。

50、（2）实现病理亚型选择性降解：现有protac无法区分病理型与生理稳态型靶蛋白，易扰乱正常功能；本发明采用glun2b构象选择性识别肽，特异性结合去磷酸化活化态dapk1，不结合磷酸化生理稳态型。实验证实，可选择性降解62%活化dapk1，而磷酸化dapk1水平保持不变，实现病理选择性降解。

51、（3）实现病变微环境条件性激活：现有protac在全身循环中即激活，易引发非靶组织降解；本发明在vhl配体引入苯硼酸ros响应基团，仅在ad病变高ros微环境中激活。实验证实，可被100 μm h2o2激活释放活性降解剂，实现病变微环境依赖性激活，降低全身脱靶风险。

52、（4）实现多靶点病理干预：现有aβ单抗仅单一靶向aβ，无法阻断aβ-tau致病级联；本发明通过选择性降解dapk1，同时调控app代谢与tau磷酸化两条通路。实验证实，治疗后app表达、tau磷酸化及aβ42寡聚体沉积均显著下降，海马神经元形态完整性维持，实现单靶点降解-多通路调控效果。

53、（5）兼具优异安全性与认知保护：现有阳离子穿透肽存在神经毒性风险；本发明全氟脂肪族交联环状结构具备构象柔性，适配细胞膜结构避免膜损伤。实验证实，治疗组血液生化指标正常，无关键血液学异常；morris水迷宫和筑巢实验显示空间记忆与自主行为能力明显改善，兼具优异安全性与认知保护效应。

54、（6）制备可控且支持精准表征：采用成熟fmoc固相多肽合成策略，参数明确、可重复性高、便于规模化生产；所有嵌合体结构纯度经hrms和hplc确认，支持cy5荧光标记，满足体外表征与体内示踪需求，为药学研究提供可靠支撑。