一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体及其制备方法和应用

本发明涉及植物外泌体，具体涉及一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、血脑屏障是中枢神经系统的一个重要保护机制，它严格控制特定营养物质进入大脑，并限制有害生物分子的通过。然而，这种屏障也阻止了绝大数药物，尤其是生物大分子药物进入大脑，成为治疗中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病和脑肿瘤）的重大挑战。

2、外泌体是一种天然的纳米级囊泡，近年来在药物递送领域备受关注。其独特的生物学特性使其具有穿越血脑屏障的能力。与合成载体相比，外泌体触发免疫反应的可能性较低，具有良好的生物相容性和低免疫原性。这种特性使得外泌体能够安全、有效地将药物递送至大脑。然而目前研究主要集中在动物源外泌体，相比之下，植物外泌体的研究仍然处于起步阶段。

3、黄精是一种药食两用的多年生草本植物，其根茎具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效。它含有多糖、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、木脂素、维生素、脂肪、蛋白质以及多种氨基酸等成分。黄精在中医中被广泛应用于增强免疫力、抗疲劳、抗衰老、降血糖、降血脂、保护肝脏、杀菌抗炎等。

4、本发明首次从黄精中提取外泌体，所获得的黄精外泌体不仅能够保持黄精天然的药用特性和生物活性，还可以高效负载多肽穿越血脑屏障。这些优势使负载多肽的黄精外泌体在治疗中枢神经系统疾病方面具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体及其制备方法和应用，以解决现有技术的不足。

2、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，包括以下步骤：

4、（1）从新鲜黄精中提取黄精外泌体，得到纯化后的黄精外泌体；

5、（2）将多肽与纯化的黄精外泌体共孵育，得到所述高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体。

6、进一步地，步骤（1）是将新鲜黄精根茎清洗干净，去须去皮后切成小块，再加入pbs缓冲液榨汁，过滤滤渣后，得到黄精粗提滤液；黄精粗提滤液经多次差速离心后，取上清液经微孔滤膜过滤后得到黄精精提滤液；黄精精提滤液经过超速离心后，弃去上清，用pbs缓冲液重悬沉淀，得到粗提黄精外泌体；粗提黄精外泌体经不同浓度梯度的蔗糖溶液分离后，得到纯化后的黄精外泌体。

7、更进一步地，所述多次差速离心的梯度分别为：1000～1200 g，10～20 min；3000～3500 g，30～40 min；10000～12000 g，30～40 min；多次差速离心的温度控制在2～6℃。

8、更进一步地，所述微孔滤膜的孔径为0.22 μm。

9、更进一步地，所述超速离心的速度为100000～150000 g，时间为60～90 min，温度控制在2～6℃。

10、更进一步地，蔗糖溶液用pbs缓冲液配制，其浓度梯度分别为：第一梯度6～8%（w/v），第二梯度30～35%（w/v），第三梯度45～50%（w/v），第四梯度55～60%（w/v）；将第二梯度和第三梯度之间的液体吸出，加入pbs缓冲液，在2～6℃、100000～150000 g离心60～90min，弃去上清后，用pbs缓冲液重悬沉淀，即得到纯化后的黄精外泌体。

11、进一步地，步骤（2）所述多肽包括核桃源多肽，所述核桃源多肽的氨基酸序列选自twlplpr。

12、进一步地，步骤（2）将多肽用磷酸缓冲液配制成多肽溶液；纯化后的黄精外泌体用磷酸缓冲液调整外泌体蛋白浓度，按多肽溶液浓度为50 μm、纯化后的黄精外泌体的外泌体蛋白浓度为100 μg/ml计，将多肽溶液与纯化后的黄精外泌体按体积比1:3～1:6混合，在25～40℃、100～150 rpm条件下孵育60～90 min；将孵育后的混合液在2～6℃、100000～150000 g离心60～90 min，弃去上清后，沉淀即为所述高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体，用pbs缓冲液或生理盐水重悬。

13、上述制备方法制备的高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体。

14、上述制备方法制备的高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体在穿透血脑屏障递送多肽改善学习记忆力中的应用。

15、本发明的有益效果：

16、本发明方法制备得到的黄精外泌体，囊泡结构完整，将其负载多肽，包封率高，达91.23%。本发明方法制备得到的负载多肽的黄精外泌体具有更强抗氧化能力（dpph自由基清除率达79.59%，abts自由基清除率达94.48%，orac值达2204.78 µmol te/g，均显著高于游离多肽），并更易穿透血脑屏障（相比游离多肽，其跨血脑屏障累计转运率提高了约27倍）。一方面，黄精外泌体高效递送多肽，使多肽更好发挥改善学习记忆力的作用，另一方面，黄精外泌体和多肽协同作用，共同增强了改善学习记忆力的效果。本发明为功能因子递送系统在中枢神经系统疾病中的应用提供了新思路，具有广阔的应用前景。

1.一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（1）是将新鲜黄精根茎清洗干净，去须去皮后切成小块，再加入pbs缓冲液榨汁，过滤滤渣后，得到黄精粗提滤液；黄精粗提滤液经多次差速离心后，取上清液经微孔滤膜过滤后得到黄精精提滤液；黄精精提滤液经过超速离心后，弃去上清，用pbs缓冲液重悬沉淀，得到粗提黄精外泌体；粗提黄精外泌体经不同浓度梯度的蔗糖溶液分离后，得到纯化后的黄精外泌体。

3.根据权利要求2所述一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，其特征在于，所述多次差速离心的梯度分别为：1000～1200 g，10～20 min；3000～3500 g，30～40 min；10000～12000 g，30～40 min；多次差速离心的温度控制在2～6℃。

4.根据权利要求2所述一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.22 μm。

5.根据权利要求2所述一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，其特征在于，所述超速离心的速度为100000～150000 g，时间为60～90 min，温度控制在2～6℃。

6.根据权利要求2所述一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，其特征在于，蔗糖溶液用pbs缓冲液配制，其浓度梯度分别为：第一梯度6～8%（w/v），第二梯度30～35%（w/v），第三梯度45～50%（w/v），第四梯度55～60%（w/v）；将第二梯度和第三梯度之间的液体吸出，加入pbs缓冲液，在2～6℃、100000～150000 g离心60～90 min，弃去上清后，用pbs缓冲液重悬沉淀，即得到纯化后的黄精外泌体。

7.根据权利要求1所述一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述多肽包括核桃源多肽，所述核桃源多肽的氨基酸序列选自twlplpr。

8.根据权利要求1所述一种高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体的制备方法，其特征在于，步骤（2）将多肽用磷酸缓冲液配制成多肽溶液；纯化后的黄精外泌体用磷酸缓冲液调整外泌体蛋白浓度，按多肽溶液浓度为50 μm、纯化后的黄精外泌体的外泌体蛋白浓度为100 μg/ml计，将多肽溶液与纯化后的黄精外泌体按体积比1:3～1:6混合，在25～40℃、100～150 rpm条件下孵育60～90 min；将孵育后的混合液在2～6℃、100000～150000 g离心60～90 min，弃去上清后，沉淀即为所述高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体，用pbs缓冲液或生理盐水重悬。

9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备的高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体。

10.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备的高效穿透血脑屏障的负载多肽的黄精外泌体在穿透血脑屏障递送多肽改善学习记忆力中的应用。