一种持续进展性肺纤维化动物模型的构建方法和应用与流程

本发明属于生物医药及实验动物模型，涉及一种高稳定性且贴近临床病理特征的肺纤维化动物模型，具体涉及一种持续进展性肺纤维化动物模型的构建方法和应用。

背景技术：

1、特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，ipf）是一种慢性、进行性、致死性的间质性肺疾病，其病因和发病机制尚不明确。ipf通常起病隐匿，主要表现为干咳和劳力性呼吸困难，患者肺功能呈限制性通气障碍及弥散功能减退，病情逐渐加重，中位生存期仅2.5~3.5年。目前全球范围内仅有吡非尼酮和尼达尼布被批准用于治疗ipf，抗肺纤维化药物治疗手段仍亟待开发。

2、建立合适的动物模型是研究ipf发病机制和筛选抗纤维化药物的关键前提。目前，博来霉素（bleomycin，blm）诱导的肺纤维化动物模型是国际公认的ipf临床前研究金标准。博来霉素是一种来源于轮枝链霉菌的化疗药物，其通过诱导dna断裂和脂质过氧化引发肺组织损伤，最终导致严重的炎症反应和肺纤维化。最常用的建模方式为单次气管内滴注博来霉素。

3、然而，单次气管滴注博来霉素模型存在若干公认的局限性，严重制约了其在药物研发中的应用价值。第一，纤维化具有自限性和可逆性。单次博来霉素给药后，小鼠肺纤维化约在第21~28天达到高峰，此后纤维化表型开始自发消退，无需任何干预。有研究指出，这一自愈倾向已被广泛批评为该模型的主要局限，尤其是将其作为ipf/寻常性间质性肺炎（uip）模型时尤为突出。从病理学角度看，博来霉素诱导的纤维化改变存在自限性和可逆性，缺少间质性肺炎进行性和不可逆性的特征。尽管部分研究显示纤维化的消退可能发生在第42天至第112天之间，但小鼠最终能够自行修复博来霉素所致的纤维化损伤已为学界公认。这一自愈特性使得该模型无法用于评估中长期抗纤维化药物的疗效。第二，临床病理贴合度差。单次大剂量博来霉素气管给药触发的是急性肺损伤和中性粒细胞驱动的强烈炎症反应，炎症期持续约7~10天，至第14天左右转为纤维化反应。而人类ipf则是隐匿起病、反复微损伤导致的慢性进行性纤维化疾病，炎症反应在病程中并不占主导。有学者指出，很难想象单次损伤模型能够充分反映人类肺部疾病中发生的持续性病理过程。因此，单次博来霉素模型与人类ipf的发病机制存在本质差异。第三，死亡率高且模型均一性差。气管滴注操作本身对动物造成机械损伤和窒息风险，药物在肺部分布不均常导致模型个体差异大。研究显示，博来霉素诱导的肺纤维化模型中动物死亡率随剂量升高而显著增加，高剂量组死亡率尤为突出。不同给药途径（气管灌注、尾静脉注射、雾化吸入等）所导致的纤维化病变部位及病理特点亦不一致。

4、为克服上述局限，近年来研究者尝试了多种改进方案。例如，采用多次重复气管滴注博来霉素以模拟反复损伤过程。然而，重复气管滴注模型仍未能完全复现uip的病理特征，且其病程周期与人类ipf的长期病理进程相比仍有显著差距。此外，有研究采用皮下植入微量渗透泵持续输注博来霉素的方式诱导肺纤维化。但该方案诱导的肺部病变通常较为轻微且局限于胸膜下区域，肺部病变难以分析，提高博来霉素剂量虽可增加病变严重程度但在伦理上存在争议。此外，二氧化硅吸入或气管内滴注可诱导矽肺样肺纤维化模型，但其建模周期长、肺叶病变分布不均匀，且建立的模型与矽肺/石棉肺更为相似，缺乏间质性肺炎的典型特征。

5、综上所述，目前已有的肺纤维化动物模型均存在不同程度的缺陷：单次博来霉素气管滴注模型易自愈、临床贴合度差、死亡率高；重复给药模型操作复杂且仍无法完全模拟人类ipf的慢性病程；单纯皮下微量泵博来霉素输注模型肺部病变轻微；二氧化硅模型则更接近职业性尘肺而非ipf。因此，本领域亟需一种能够模拟人类ipf慢性病程、纤维化表型持久不自愈、模型均一且死亡率低的新型肺纤维化动物模型构建方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种持续进展性肺纤维化动物模型的构建方法和应用，该方法采用“体内微量渗透泵持续皮下输注低剂量博来霉素”联合“体外动式吸入低浓度二氧化硅气溶胶”的双因素复合诱导方案，具有纤维化表型持续进展不自愈、病理特征高度贴近人类ipf的慢性病程、动物死亡率低且模型均一性高等优势，同时该模型在抗纤维化药物筛选和药效学评价中具有良好的敏感性和长达28天的给药干预窗口，能够满足抗纤维化药物研发的多种实验需求。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种持续进展性肺纤维化动物模型的构建方法，包括以下步骤：

4、步骤1）对实验动物皮下植入缓释微量渗透泵，所述微量渗透泵内装载有博来霉素溶液，以恒定速率持续皮下输注博来霉素，持续给药第一预设时间；

5、步骤2）在所述步骤1）开始后的第7天起，将所述实验动物置于动式吸入染毒装置中，间歇性吸入二氧化硅气溶胶，持续第二预设时间；

6、步骤3）第28天撤除所述微量渗透泵或等待泵内药物自然耗尽，继续饲养至第56天，获得持续进展性肺纤维化动物模型。

7、优选地，步骤1）所述博来霉素的每日摄入剂量为1.0~2.0 mg/kg体重。

8、优选地，所述博来霉素的每日摄入剂量为1.5 mg/kg体重。

9、优选地，步骤1）所述缓释微量渗透泵为alzet 1004型微量渗透泵，容量为100 μl；所述恒定速率为0.11 μl/h，所述第一预设时间为28天。

10、优选地，步骤2）所述二氧化硅气溶胶的浓度为15±2 mg/m3，所述二氧化硅的粒径小于5 μm。

11、优选地，步骤2）所述间歇性吸入的频率为每周吸入3次，每次吸入2 h；所述第二预设时间为3周。

12、优选地，所述实验动物为c57bl/6小鼠或sd大鼠。

13、优选地，所述方法构建的肺纤维化动物模型在造模第28天至第56天期间纤维化持续进展，不自愈消退。

14、上述方法构建的持续进展性肺纤维化动物模型在筛选或评价抗肺纤维化药物中的用途。

15、本发明的有益效果如下：

16、（1）本发明通过皮下微量渗透泵持续输注低剂量博来霉素，模拟了体内无创性的持续微损伤过程，有效规避了急性大剂量给药所引发的剧烈炎症反应，更符合人类ipf隐匿起病的临床特征。同时，联合间歇性二氧化硅气溶胶吸入，进一步激活了肺泡巨噬细胞的长期慢性应答，使模型动物的病理表型从单纯的药物性损伤转向慢性进行性纤维化。经he染色和masson染色验证，本发明模型在肺泡壁增厚、肺泡结构破坏及胶原纤维沉积等方面均呈现典型的人类ipf病理学特征，肺功能检测结果显示动态顺应性大幅下降、用力肺活量呈限制性降低、吸气阻力显著升高，与人类ipf患者“限制性通气功能障碍及肺顺应性减低”的临床表现高度一致。

17、（2）本发明构建的动物模型在第28天至第56天期间，肺纤维化呈持续进展态势，胶原沉积面积随时间推移进一步增加，肺泡结构逐步消失并融合成大片纤维化蜂窝肺，纤维化评分维持在7.8分以上，未出现任何自愈或消退趋势。这一持久稳定的纤维化表型为抗纤维化药物的中长期疗效评价提供了充足的时间窗口，给药窗口期长达28天，克服了传统模型因纤维化自发消退而无法用于长期药物评估的缺陷。

18、（3）本发明完全避免了气管内滴注操作对动物造成的机械损伤和窒息风险，博来霉素通过微量渗透泵以恒定速率持续释放，药物在体内分布均匀，个体间差异小。全病程56天内动物死亡率低于5%，显著优于传统方法，保证了模型构建的高成功率和实验结果的可靠性，具有良好的可重复性和规模化应用前景。

19、（4）本发明所需实验操作简便易行，微量泵皮下植入为常规外科小手术，二氧化硅气溶胶吸入采用动式吸入染毒柜即可完成，无需复杂的呼吸机辅助通气设备或显微注射装置，普通动物实验技术人员经过短期培训即可掌握全部操作流程，具有良好的技术可推广性。

20、（5）本发明模型对临床一线抗纤维化药物尼达尼布表现出良好的剂量依赖性治疗反应，给药后模型动物的肺组织羟脯氨酸含量显著下降，肺功能恶化得到有效遏制，病理纤维化评分显著降低。说明本发明构建的模型能够灵敏反映抗纤维化药物的体内治疗效果，可为抗肺纤维化先导化合物的药效学筛选和临床前药效评价提供可靠的技术平台。

21、（6）本发明模型因死亡率低、成模率高、均一性好，每组所需动物数量显著少于传统方法，在获得可靠统计学结论的前提下能够有效减少实验动物的使用总量，符合实验动物伦理的3r原则（替代、减少、优化），具有良好的伦理合规性。同时，模型动物在全病程中未出现传统方法所见的急性窒息、严重感染等剧烈痛苦，符合动物福利要求。

22、（7）本发明模型可在纤维化已完全确立的第28天作为药物干预起点，也可根据研究需要在第7至第28天之间的任一设置开始预防性或治疗性给药，实验设计灵活度大。例如，需要研究药物对早期纤维化进程的阻断作用时，可从第7天即开始给药；需要评估药物对已确立纤维化的逆转作用时，可从第28天开始给药，能够满足不同研究目的的多场景需求。