制备动物胎盘生物活性因子的方法与流程

本发明属于生物，涉及从一种从动物胎盘中通过富集血小板来提取生物活性因子的方法，特别是涉及从来源于羊的胎盘中富集血小板进而提取具有生物活性的因子的方法。

背景技术：

1、近十余年来，随着人们对间充质干细胞研究的不断深入，其由干细胞产生的分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。

2、比较常用的干细胞分选技术是的磁珠分选，但常规的分选中，磁珠会随同干细胞一同进行后续的培养，即磁珠并没有从干细胞上脱离下来，这样对于干细胞的后期生产，必定会产生一定的影响，虽然有一些方法，如加入一些菌或者其他物质进行降解，但这样也相当于加入了其他的外源蛋白质等成分，造成对干细胞的二次污染，所以实际上并没有解决上述问题。此外，也有一些对干细胞培养上清液进行提取纯化的报道，但效果依然不佳，例如公告号为cn102600057b的专利公开了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，对得到的细胞培养液采用单一的3000d滤膜进行超滤截留，其去掉了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，实际应用价值较低。

3、使用羊胎盘获得的生物活性因子对于人体健康是有益的。据陆晖文献(陆晖，等，胎盘活性因子对机体机能的影响与应用，南京体育学院学报，1999，13(3):51)记载，羊的胎盘提取物中含有的bfgf、egf(表皮细胞生长因子)能促进纤维细胞的分裂，使细胞富有弹性；hasf(透明质酸刺激因子)能促进细胞产生透明质酸，保持皮肤湿润，防止出现干燥、皲裂等；sod(超氧化物岐化酶)能清除细胞内的过剩氧自由基，加强细胞的新陈代谢作用，防止细胞出现老化。同时，大量的氨基酸，维他命能有效地补充人体所需的营养，提高机体的免疫能力，可以说是一种得天独厚的健康产品资源。此外，研究人员通过对羊胎盘活性因子(paf)和tf(转移因子)的研究，发现羊胎盘活性因子的许多特性如制备方法、紫外吸收光谱、氨基酸成分及免疫调节作用基本与人的paf和tf相似。给予小鼠注射羊胎盘活细胞素，15天后发觉小鼠的外周血白细胞数和免疫器官(脾脏、胸腺)的重量均明显高于对照组。另外还观察了注射羊胎盘活细胞素的小鼠，其在水下生存和运动的时间也显著长于对照组。由于羊的paf与人的paf相似，且羊胎盘活性因子在提高机体的免疫能力、增强机体的防御力和抵抗力、提高细胞酶活性、促进细胞新陈代谢方面又有独到功效，而其来源又更为方便，成本又更低，这对提高人类免疫功能、增强营养、美容保健、运动训练是相当有益的。

4、本技术博雅研究团队的中国专利公告号cn107550841b(201710937158.5)公开了胎盘生物活性因子制备的产品及其制法。具体地说，包括从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，其包括以下步骤：(1)血小板富集；(2)血小板裂解物制备，根据血小板浓度将步骤(1)富集的血小板样本稀释；依次经化学裂解和物理裂解，得裂解物；(3)浓缩液制备，将“血小板富集”步骤中第二步离心后上清进行浓缩所得；(4)胎盘生物活性因子制备，将上述裂解液和浓缩液充分混合获得；(5)胎盘生物活性因子冻干与保存。该发明方法制得的胎盘生物活性因子具有某些优良的性能。然而，该发明方法需要采用人类的胎盘作为初始物，资源获取成本较高，由动物源性胎盘制备生物活性因子成了一种更为经济易行的选择。

5、cn107865777a(201711088412.5)公开了一种载外源性表皮生长因子的羊膜面膜及其制备方法，分离健康动物(绵羊、山羊、鹿)胎盘的羊膜，经加工制成羊膜基膜，后把羊膜基膜浸渍于含有外源性表皮生长因子的溶液中，以提高羊膜中表皮生长因子的含量，再将载外源性表皮生长因子的羊膜基膜与纤维蛋白胶膜或其它面膜载帖物帖合，成为载外源性表皮细胞生长因子的羊膜面膜。羊膜中的生长因子具有促进表皮细胞增殖、移行与分化的作用，且具有剂量相关性，据信该发明通过添加外源性生长因子，使羊膜有更多的生长因子释放于作用部位，并因缓释作用而延长释放时间，从而改善其对局部表皮细胞生长的促进作用；该发明的羊膜面膜天然绿色，无毒、无刺激性，可生物降解，绿色无污染，生态效应良好。

6、cn111973489a(202010913497.1)公开了一种羊胎素冻干粉及其制备方法，所述的冻干粉包括a相组分和b相组分，所述的a相组分包括：燕麦β-葡聚糖、蛹虫草提取物和透明质酸钠；所述的b相组分包括：寡肽-1、寡肽-3、水解羊胎盘提取物和血清白蛋白，该发明制备过程中通过严格控制各个步骤的温度与时间，以及各种组分，尤其是寡肽-1、寡肽-3和水解胎盘(羊)提取物等组分通过控制各组分之间的含量以及配比，使制备过程中冻干粉的挂壁现象降低至2%以内，大大降低产品生产损耗，提升冻干粉的品质，制备得到的冻干粉在保持保湿的基础上，明显提高了产品的因子生物活性，可以有效健康皮脂膜，激活细胞再生，让肌肤组织代谢正常。

7、cn119391627a(202411768566.9)公开了一种羊源羊水外泌体的制备方法和应用。该制备方法具体包括以下步骤：羊水提取、离心分离、批处理法离子交换层析、批处理法疏水层析；其中，所述批处理法离子交换层析为利用细胞膜结构所带的负电荷性质，将外泌体以及羊水中带负电荷的蛋白以及核酸进行富集；所述批处理法疏水层析为利用细胞膜结构的疏水性质，将亲水性物质分离。该申请的目的是要能够从大量的羊水中收集到微量的外泌体，通过采用批量吸附的方法，高效地富集外泌体。这种方法具有温和的特性，对囊泡的损伤极小，并且无需进行超速离心，一次就可以处理几百升的外泌体原液。该外泌体中含有丰富的生长因子，且胎盘生长因子的含量最多。

8、cn109939062a(201910244294.5)公开了一种羊胚胎或羊胎盘提取物和制备方法，制备方法包括：将羊胚胎或羊胎盘洗净、切碎，用提取溶剂提取，并于0-40℃搅拌匀浆3-6h，再调ph值为4.9-5.0，最后离心，取上清并调节上清液ph值为6.3-6.4，然后于55-65℃热处理8-12min；重复匀浆，离心和热处理过程1-2次，将处理后的物质离心，取上清，灭活，并调节ph值至7.0-7.4，用超滤膜包处理，除菌制得。通过该方法提取的羊胚胎或羊胎盘提取物，包含多种蛋白生长因子，可促进皮下组织生长代谢，从而激活了皮肤局部微环境，使得皮肤自我生长修复加强，将其加入化妆品中具有明显的美白提亮、润颜抗衰老的作用。

9、cn103463131b(201310434286.x)公开了一种羊胎盘转移因子溶液的制备方法，包括以下步骤：将处理过的羊胎盘与ph为2.5-3.5的纯化水按照质量比为1：(1-3)的比例混合，置于缝隙为8-9μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用盐酸调节匀浆液ph为2.5-3.5，再进行研磨，得羊胎盘匀浆；加热羊胎盘匀浆至78-82℃，保温时间≥10min，冷却后用naoh调节羊胎盘匀浆ph为6.5-6.8，然后在4000-6000r/min下离心30-45min，取上清液；用6000道尔顿的超滤膜对上清液进行超滤，得羊胎盘转移因子溶液。该发明方法简单便捷，可直接从羊胎盘中提取大量的转移因子，并且能够在常温下保存，给使用和运输节约大量的时间和金钱。

10、然而，这些文献方法在使用羊胎盘制备生物活性因子方面均存在这样或那样的不足，仍然具有需要改进的方面。因此，本领域技术人员仍然期待有新的方法获得生物活性因子，尤其是通过使用动物例如羊的胎盘获得生物活性因子。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种以有效的性能来从胎盘例如羊胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法。已经出人意料的发现，使用本发明方法可以实现本发明一个或多个方面的有益效果并制取活性因子。本发明基于此发现而得以完成。

2、为此，本发明第一方面提供了一种从羊胎盘中富集血小板和提取活性因子制备羊胎盘活性因子混合液的方法，其包括以下步骤：

3、1)将羊胎盘用0.9%氯化钠注射液冲洗胎盘组织表面，沥干、剪碎，充分挤压胎盘碎块并收集胎盘血，将该胎盘血经无菌的300目滤网过滤；

4、2)在离心管中将胎盘血以500-2000g离心10-15min，再次以2400-5000g离心10-20min，分取沉淀和上清液；将上清液用蛋白浓缩管浓缩2-10倍，得到上清浓缩液；

5、3)将上一步骤所得沉淀加0.9%氯化钠注射液重悬，将其与等体积的激活剂混合，室温静置使血小板激活，离心，分取上清液和沉淀；沉淀进行37°c/-80°c反复冻融三次的物理裂解，每次间隔10~20min；将上清液和物理裂解物充分混匀，得到血小板裂解物；

6、4)将以上两个步骤所得上清浓缩液和血小板裂解物混合，得到羊胎盘活性因子混合液。

7、根据本发明第一方面的方法，所述羊是山羊。

8、根据本发明第一方面的方法，其中在完成步骤4)后，进一步将活性因子混合液分装在小瓶中以-80°c直接冻存。

9、根据本发明第一方面的方法，其中在完成步骤4)后，进一步将活性因子混合液分装在玻璃瓶中，进行冷冻干燥制得羊胎盘生物活性因子冻干粉。

10、根据本发明第一方面的方法，其中在完成步骤4)后，进一步向活性因子混合液中加入海藻糖作为冻干保护剂至浓度1%~5%例如2%使溶解，再分装在玻璃瓶中，进行冷冻干燥制得羊胎盘生物活性因子冻干粉。

11、根据本发明第一方面的方法，其中步骤1)中，将山羊胎盘在无菌操作台上用0.9%氯化钠注射液冲洗胎盘组织表面，沥干10min。

12、根据本发明第一方面的方法，其中步骤2)中，在离心管中将胎盘血以1000g离心15min，再次以3000g离心15min，分取沉淀和上清液。

13、根据本发明第一方面的方法，其中步骤2)中，将上清液用蛋白浓缩管浓缩5倍，得到上清浓缩液。

14、根据本发明第一方面的方法，其中步骤2)中，所用蛋白浓缩管为thermoscientifictm piercetm蛋白浓缩管，材质为聚醚砜膜，截留分子量为10k。

15、根据本发明第一方面的方法，其中步骤3)中，将步骤2)中以50ml胎盘血处理所得沉淀加0.9%氯化钠注射液重悬成5ml，将其与5ml激活剂混合。所述激活剂是包含0.5%~1.5%氯化镁、0.5%~1.5%葡萄糖酸镁、0.01%~0.03%纤维蛋白原、0.5~1µmol/l叶酸的水溶液。

16、根据本发明第一方面的方法，其中步骤3)中，所述激活剂是包含1%氯化镁、1%葡萄糖酸镁、0.02%纤维蛋白原、0.75µmol/l叶酸的水溶液。

17、根据本发明第一方面的方法，其中步骤3)中，所述激活剂是包含0.5%氯化镁、0.5%葡萄糖酸镁、0.02%纤维蛋白原、0.5µmol/l叶酸的水溶液。

18、根据本发明第一方面的方法，其中步骤3)中，所述激活剂是包含1.5%氯化镁、1.5%葡萄糖酸镁、0.02%纤维蛋白原、1µmol/l叶酸的水溶液。

19、根据本发明第一方面的方法，其中步骤3)中，所述激活剂是包含0.5%氯化镁、1.5%葡萄糖酸镁、0.02%纤维蛋白原、1µmol/l叶酸的水溶液。

20、根据本发明第一方面的方法，其中步骤3)中，所述激活剂是包含1.5%氯化镁、0.5%葡萄糖酸镁、0.02%纤维蛋白原、0.5µmol/l叶酸的水溶液。

21、根据本发明第一方面的方法，其中步骤3)中，所述激活剂是包含1%氯化镁、1%葡萄糖酸镁、0.03%纤维蛋白原、0.75µmol/l叶酸的水溶液。

22、根据本发明第一方面的方法，其中步骤3)中，所述激活剂是包含1%氯化镁、1%葡萄糖酸镁、0.01%纤维蛋白原、0.75µmol/l叶酸的水溶液。

23、进一步的，本发明第二方面提供了一种羊胎盘活性因子混合液，其是通过本发明第一方面任一项所述方法制备得到的。

24、进一步的，本发明第二方面提供了一种羊胎盘生物活性因子冻干粉，其是通过本发明第一方面任一项所述方法制备得到羊胎盘活性因子混合液，然后进行冷冻干燥获得的，例如该冻干粉在冷冻干燥前的液体中添加有1%~5%例如2%的海藻糖。

25、本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

26、本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

27、本发明的各个方面呈现一个或者多个方面的优点。