一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物的制作方法

本发明涉及化妆品，具体是一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物。

背景技术：

1、间充质干细胞外泌体与人参外泌体均为纳米级、由脂质双分子层包裹的天然囊泡，携带蛋白质、mirna、生长因子及人参皂苷等活性物质，在抗衰老化妆品领域应用广泛。将其开发为可稳定上市的配方，通常需加入两类两亲性小分子助剂：一类是以吐温80、吐温20为代表的非离子表面活性剂，用于增溶人参皂苷等成分并提升透皮吸收；另一类是广谱防腐剂，用于满足含水配方的微生物安全性要求。

2、上述两类助剂均为两亲性分子，其疏水链段可与外泌体脂质双分子层发生疏水相互作用而插入膜内，导致囊泡失稳、聚集及内容物泄漏降解；而两类助剂各自的配方功能（防腐效力、增溶能力）又均取决于体系中游离态（未被结合）分子的浓度。现有提升外泌体稳定性的思路多集中于优化冻干保护剂、调节配方ph及离子强度等外部环境条件，尚未有一种既能抑制两亲性小分子对外泌体膜的插入损伤、又不损害配方原有防腐及增溶功能的解决方案。

技术实现思路

1、（1）要解决的技术问题

2、本发明的目的在于提供一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，以解决两亲性分子助剂的疏水链段与外泌体脂质双分子层发生相互作用损伤外泌体膜的问题，在不降低体系中两亲性助剂游离态浓度的前提下，提高外泌体膜自身对两亲性分子插入的抵抗能力。

3、（2）技术方案

4、为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，按重量份数计包括以下组分：

5、间充质干细胞外泌体0.05~0.5份、人参外泌体0.05~0.5份、透明质酸基偶联物0.02~0.2份、四臂聚乙二醇基偶联物0.005~0.05份、吐温80 0.5~3.0份、广谱防腐剂0.5~1.0份、透明质酸钠0.1~0.5份、甘油1.0~5.0份、海藻糖2.0~8.0份、甘露醇0.5~3.0份、去离子水补足至100份；

6、其中，所述透明质酸基偶联物由透明质酸分别与维生素e琥珀酸酯的氨基化衍生物、甲氧基聚乙二醇胺反应后进一步与乙二胺缩合，再与二亚乙基三胺五乙酸二酸酐反应制得；

7、所述四臂聚乙二醇基偶联物由四臂聚乙二醇胺与β-谷甾醇半琥珀酸酯经缩合接枝反应制得；所述四臂聚乙二醇胺的两条臂与β-谷甾醇半琥珀酸酯发生接枝反应，另两条臂未参与接枝反应、仍保留未反应的末端氨基。

8、进一步地，所述四臂聚乙二醇胺的分子量为2000~5000da。

9、进一步地，所述透明质酸基偶联物的制备方法包括以下步骤：

10、s11.将生育酚琥珀酸酯溶于无水dmf，加入edc·hcl和nhs室温活化2~4h，再加入过量乙二胺反应12~24h，经旋蒸、重结晶纯化，得到维生素e琥珀酸酯的氨基化衍生物；

11、s12.将透明质酸溶于ph 5.0~6.0的mes缓冲液，加入edc·hcl和nhs活化，与维生素e琥珀酸酯的氨基化衍生物室温反应12~24h，得到反应液1；

12、s13.在反应液1中，加入edc·hcl、nhs活化后，与分子量2000~5000 da的甲氧基聚乙二醇胺室温反应12~24h，得到反应液2；

13、s14.在反应液2中，加入edc·hcl、nhs活化后，与过量乙二胺反应，以无水丙酮沉淀，离心，沉淀真空干燥后转入无水dmso中溶解，再加入三乙胺维持弱碱性反应环境，随后加入二亚乙基三胺五乙酸二酸酐，室温反应2~4h，反应结束后加入乙酸酐对残留氨基进行乙酰化封端，得到反应液3；

14、s15.将反应液3经截留分子量10~14kda的透析纯化，冻干，得到所述透明质酸基偶联物。

15、进一步地，所述四臂聚乙二醇基偶联物的制备方法包括以下步骤：

16、s21.将β-谷甾醇与琥珀酸酐在吡啶催化、氮气保护下反应，减压旋蒸后用二氯甲烷溶解，洗涤干燥，经重结晶纯化，得到β-谷甾醇半琥珀酸酯；

17、s22.将β-谷甾醇半琥珀酸酯溶于无水二氯甲烷中，加入edc·hcl、nhs活化后与四臂聚乙二醇胺反应，反应完成后经反相色谱分离，收集双取代组分对应馏分，减压浓缩、真空干燥，得到所述四臂聚乙二醇基偶联物。

18、进一步地，所述广谱防腐剂为苯氧乙醇与乙基己基甘油的复配体系。

19、进一步地，所述苯氧乙醇与乙基己基甘油的质量比为4~10:1。

20、进一步地，所述间充质干细胞外泌体和人参外泌体的粒径均为30~150nm。

21、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

22、1.本发明通过透明质酸基偶联物与四臂聚乙二醇基偶联物协同增强外泌体膜对配方中两亲性助剂插入损伤的抵抗能力，由于二者的作用位点均在外泌体膜自身、不依赖捕获或降低体系中游离两亲性助剂浓度实现保护，因而能够在提升外泌体膜稳定性的同时，兼顾配方原有的防腐效力与人参皂苷增溶能力，协调解决了外泌体膜稳定性与配方功能性之间的矛盾。

23、2.本发明所述组合物为水相配方，其中海藻糖、甘露醇作为渗透压调节剂与低温保护剂，配合甘油、透明质酸钠共同维持体系渗透压稳定并降低冷藏、冷冻运输过程中因冰晶形成对间充质干细胞外泌体、人参外泌体及两种改性偶联物造成的机械损伤，有利于延长产品在贮存、运输过程中的稳定性，提高产品的实际生产与应用可行性。

1.一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，其特征在于，按重量份数计包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，其特征在于，所述四臂聚乙二醇胺的分子量为2000~5000da。

3.根据权利要求1所述的一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，其特征在于，所述透明质酸基偶联物的制备方法包括以下步骤：

4.根据权利要求1所述的一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，其特征在于，所述四臂聚乙二醇基偶联物的制备方法包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，其特征在于，所述广谱防腐剂为苯氧乙醇与乙基己基甘油的复配体系。

6.根据权利要求5所述的一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，其特征在于，所述苯氧乙醇与乙基己基甘油的质量比为4~10:1。

7.根据权利要求1所述的一种含间充质干细胞外泌体与人参外泌体的抗衰老组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体和人参外泌体的粒径均为30~150nm。