一种兼容多样本类型的N末端脑钠肽前体化学发光免疫检测试剂盒及检测方法与流程

本发明属于体外诊断试剂，具体涉及一种兼容多样本类型的n末端脑钠肽前体化学发光免疫检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、n 末端脑钠肽前体（nt-probnp）是脑钠肽（bnp）激素原分裂后的 n 端片段，由心室肌细胞在心室负荷加重或室壁张力增加时分泌。nt-probnp 半衰期约 120 分钟，远长于bnp 的 20 分钟，在体外稳定性好，已广泛应用于心力衰竭的诊断、分级、预后评估和治疗监测，是国际公认的心力衰竭生物标志物。

2、目前，nt-probnp 的检测主要采用化学发光免疫分析技术，国内外已有多家厂商推出相关检测试剂盒。然而，现有 nt-probnp 化学发光检测试剂盒仅支持血清和血浆样本检测，不支持全血样本。在急诊和危重症场景中，全血检测可省去离心步骤，将样本周转时间从30~45 分钟缩短至 15 分钟以内，对急性心力衰竭的快速诊断具有重要临床价值。但由于全血中红细胞的存在，红细胞的光学阻挡和散射效应会严重影响化学发光信号的检测准确性，使得现有试剂盒难以直接应用于全血样本。

3、此外，现有 nt-probnp 化学发光检测试剂盒在抗干扰能力方面存在不足。异嗜性抗体（hama）可桥接试剂盒中的鼠源捕获抗体和检测抗体，形成假双抗体夹心结构，导致假阳性结果。已有临床病例报告显示，nt-probnp 检测因 hama 干扰出现显著假阳性，浓度可达真实值的10~100 倍。hama 在一般人群中的发生率约 0.5%~2%，在自身免疫疾病患者中可达 15%~40%。类风湿因子（rf）是一种 igm 型自身抗体，可与 igg 的 fc 段结合，在双抗体夹心法中将捕获抗体与检测抗体的 fc 段桥接，同样导致假阳性。rf 在类风湿关节炎患者中阳性率约 70%~80%，在其他自身免疫疾病和老年人群中也有一定比例。

4、溶血也是影响 nt-probnp 检测准确性的常见因素。当样本发生溶血时，释放的血红蛋白是已知的化学发光淬灭剂，可显著降低发光信号强度，导致检测结果偏低。在临床样本采集和处理过程中，溶血发生率约 1%~3%。更为突出的是，上述干扰因素可能相互叠加，在同一患者样本中同时存在红细胞干扰、hama 干扰和 rf 干扰，现有 nt-probnp 检测试剂盒缺乏同时应对多重干扰的综合解决方案。

5、综上所述，现有 nt-probnp 化学发光检测试剂盒存在样本类型单一、抗干扰能力不足的缺陷，限制了其在急诊全血检测和自身免疫疾病患者中的应用。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种兼容多样本类型的n末端脑钠肽前体化学发光免疫检测试剂盒及检测方法。

2、本发明的目的是要提供一种兼容多样本类型且具有多重抗干扰能力的 n 末端脑钠肽前体化学发光免疫检测试剂盒，以提高 nt-probnp 检测在急诊全血样本和自身免疫疾病患者样本中的准确性。

3、本发明第一方面提供一种兼容多样本类型的 n 末端脑钠肽前体化学发光免疫检测试剂盒，包括多功能抗干扰组合物、磁性微球偶联 nt-probnp 捕获抗体、吖啶酯标记nt-probnp 检测抗体、缓冲液体系和发光底物液；

4、多功能抗干扰组合物分散于缓冲液体系中，包括非溶血性红细胞处理组合物和异嗜性抗体/类风湿因子阻断组合物；

5、非溶血性红细胞处理组合物含有 poloxamer 188 和右旋糖酐 40；

6、异嗜性抗体/类风湿因子阻断组合物含有鼠 igg f (ab')2片段、特异性阻断多肽和 peg6000；

7、以缓冲液体系的体积计，poloxamer 188 的浓度为 0.05%~0.5%，右旋糖酐 40 的浓度为 0.5%~3%，鼠 igg f (ab')2片段的浓度为 0.05~0.3 mg/ml，特异性阻断多肽的浓度为 0.01~0.05 mg/ml，peg 6000 的浓度为 0.5%~2%。

8、作为上述试剂盒的进一步优化方案，以缓冲液体系的体积计，poloxamer 188 的浓度为 0.1%~0.3%，右旋糖酐 40 的浓度为 1%~2%。

9、作为上述试剂盒的进一步优化方案，以缓冲液体系的体积计，鼠 igg f (ab')2片段的浓度为 0.1~0.2 mg/ml，特异性阻断多肽的浓度为 0.015~0.03 mg/ml，peg 6000 的浓度为 0.8%~1.5%。

10、作为上述试剂盒的进一步优化方案，特异性阻断多肽含有 glu-leu-leu-gly 重复单元。

11、作为上述试剂盒的进一步优化方案，磁性微球偶联 nt-probnp 捕获抗体中，磁性微球为羧基磁性微球，粒径为 1~2.8 μm，经 edc/nhs 活化后偶联 nt-probnp 捕获抗体，偶联量为 20~60 μg 抗体 /mg 磁珠。

12、作为上述试剂盒的进一步优化方案，捕获抗体识别 nt-probnp 中段表位，检测抗体识别 nt-probnp 末端表位，捕获抗体与检测抗体分别识别 nt-probnp 的不同表位。

13、作为上述试剂盒的进一步优化方案，吖啶酯标记 nt-probnp 检测抗体中，吖啶酯为 nsp-dmae-nhs，吖啶酯与抗体的标记摩尔比为 10:1~25:1，标记率为 2~6 mol 吖啶酯/mol抗体。

14、作为上述试剂盒的进一步优化方案，缓冲液体系含有 50~100 mmol/l tris-hcl（ph 7.4~8.0）、150 mmol/l nacl、0.05%~0.1% tween-20、0.1%~0.5% casein 和0.05%proclin 300。

15、作为上述试剂盒的进一步优化方案，发光底物液包括预激发液和激发液；预激发液为含 0.1% h2o2的 0.1 mol/l hno3溶液；激发液为含 0.1 mol/l naoh 和 0.1% tritonx-100 的溶液。

16、本发明第二方面提供一种采用上述试剂盒检测 n 末端脑钠肽前体的方法，包括以下步骤：

17、步骤 1、取待测样本，待测样本为血清、血浆或全血中的一种；

18、步骤 2、向待测样本中加入含多功能抗干扰组合物的缓冲液，孵育 2~5 分钟，得到抗干扰预处理后的样本；

19、步骤 3、向抗干扰预处理后的样本中加入磁性微球偶联 nt-probnp 捕获抗体和吖啶酯标记 nt-probnp 检测抗体，37℃孵育 15~20 分钟，形成免疫反应复合物；

20、步骤 4、磁分离，弃去上清液，洗涤；

21、步骤 5、加入发光底物液，读取化学发光信号强度；

22、步骤 6、根据校准曲线将化学发光信号强度转换为 nt-probnp 浓度值。

23、作为进一步的优化方案，待测样本为全血时，无需离心处理，直接加入反应体系。

24、作为进一步的优化方案，步骤 2 中，含多功能抗干扰组合物的缓冲液的加入量为100~200 μl，待测样本的加入量为10~50 μl。

25、作为进一步的优化方案，步骤 3 中，磁性微球偶联 nt-probnp 捕获抗体的加入量为 20~50 μl，吖啶酯标记 nt-probnp 检测抗体的加入量为 20~50 μl。

26、作为进一步的优化方案，步骤 4 中，磁分离时间为 2~3 分钟，用含 0.05%tween-20 的 pbs 洗涤 2~3 次，每次 1 ml。

27、有益效果

28、与现有技术相比，本发明提供的 n 末端脑钠肽前体化学发光免疫检测试剂盒，通过多功能抗干扰组合物中非溶血性红细胞处理组合物与异嗜性抗体/类风湿因子阻断组合物的协同配合，在保持化学发光免疫分析检测性能的同时，实现了血清、血浆和全血三种样本类型的兼容检测，并有效提升了试剂盒在异嗜性抗体干扰、类风湿因子干扰和溶血干扰条件下的检测准确性，兼具多样本类型兼容和多重抗干扰的特点，适用于急诊快速检测和自身免疫疾病患者的 nt-probnp 定量检测。