一种外泌体电化学发光免疫传感器及其检测方法

本发明涉及外泌体检测，尤其是涉及一种外泌体电化学发光免疫传感器及其检测方法。

背景技术：

1、结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其预后与诊断分期密切相关。由于早期结直肠癌患者通常缺乏特异性临床表现，部分患者确诊时已处于局部晚期或转移阶段，因此，建立无创、灵敏且适于结直肠癌辅助筛查的检测方法具有重要意义。

2、外泌体是细胞分泌的膜性囊泡，粒径通常约为30～150 nm，广泛存在于血液、尿液和细胞培养液等样品中。外泌体携带来源细胞的蛋白质、核酸和脂质等生物信息。肿瘤细胞来源外泌体的数量及其表面标志物可反映肿瘤发生发展状态，因而外泌体是液体活检领域的重要检测对象。

3、现有外泌体检测方法包括酶联免疫吸附测定、流式细胞术和表面等离子体共振等。酶联免疫吸附测定在低丰度外泌体分析中灵敏度有限；常规流式细胞术对小尺寸外泌体的分辨能力不足，且仪器和操作要求较高；表面等离子体共振虽然能够实现实时检测，但仪器成本较高，并容易受到复杂样品中非特异性吸附的影响。因此，需要开发灵敏度高、操作方便并具有良好抗干扰能力的外泌体检测方法。

4、电化学发光兼有电化学可控性和光学检测低背景的优点。鲁米诺-溶解氧电化学发光体系能够以溶解氧作为共反应物，不需要额外加入过氧化氢等强氧化剂，具有体系简单和生物样品兼容性较好的优点。然而，在近中性条件下，溶解氧还原生成活性氧物种的效率较低，鲁米诺氧化动力学也受到限制，导致其电化学发光强度不足，制约了该体系在低丰度外泌体检测中的应用。因而，在近中性条件下，鲁米诺-溶解氧电化学发光过程至少涉及溶解氧还原生成活性氧物种以及鲁米诺阳极氧化两个反应步骤。仅提高其中一个反应步骤，通常难以获得稳定而显著的信号增强。

5、pd具有良好的导电性、电子传输能力和氧还原催化活性；co3o4具有co2+/co3+可变价态，可参与活性氧生成及氧化还原循环。将pd与co3o4复合，有望同时提高溶解氧还原和鲁米诺氧化效率。但是，复合纳米材料在常规电极表面容易发生团聚和脱落，造成催化活性位点减少和检测信号稳定性下降。因此，亟需提供一种具有明确空间分区的传感界面：稳定负载能够同时促进溶解氧还原和鲁米诺氧化的复合催化组分，并设置外泌体免疫识别层，在检测液配制和检测过程中不加入过氧化氢。该界面还应使外泌体结合引起的孔口阻塞和界面阻抗变化能够转换为可定量的电化学发光信号变化。垂直有序介孔二氧化硅薄膜（vertically-ordered mesoporous silica film,vmsf）作为一种新型纳米结构材料，凭借其高度有序、垂直排列的纳米通道结构，以及独特的尺寸筛分效应、电荷选择性、高比表面积和易修饰性，为构建高性能ecl生物传感提供了理想界面。vmsf具有孔径均一、孔道垂直且高度有序的特点，将其修饰在电极表面可赋予电极优异的防玷污、抗干扰性能，实现复杂样品的直接分析。然而，传统界面材料组装时普遍存在信号分子易泄漏、抗生物污染能力不足和痕量目标物信号放大能力有限等问题。虽然垂直介孔二氧化硅薄膜的制备及其表面官能化属于本领域已知技术，vmsf及其内部限域催化剂在电化学发光领域已有报道，但将其应用于外泌体等大尺寸生物靶标(粒径通常在30-150nm，远大于vmsf约2-3nm的孔径)的检测时，面临着巨大的技术瓶颈。如何将其纳米限域功能与pd/co3o4复合催化及外泌体免疫检测有机结合，并建立不外加过氧化氢的高灵敏电化学发光检测方法，仍是需要解决的技术问题。此外，现有增强电极与外泌体免疫识别界面往往相互独立，难以形成稳定、完整的外泌体定量检测体系，制约了该技术在临床实际应用中的推广。

6、综上所述，目前亟需开发一种能够将纳米限域效应、高效催化信号放大与特异性免疫识别有机整合的外泌体电化学发光检测方法，以实现对结直肠癌相关外泌体的高灵敏、高特异性及抗干扰检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种外泌体电化学发光免疫传感器及其检测方法，具体而言，提供一种限域co3o4和pd复合催化材料及其制备方法，通过在垂直有序介孔二氧化硅薄膜的开放纳米通道内先形成co3o4催化区域，再在已经含有co3o4的纳米通道内沉积pd，并在两种催化组分沉积完成后进行热处理，使pd与co3o4在2-3nm直径的纳米通道内形成稳定的复合催化区域，从而解决现有双组分催化材料中沉积顺序不可控、有效异质界面不足、催化组分易团聚以及界面稳定性不足的问题。结合空间分离的生物识别界面，实现对外泌体的高灵敏度检测。

2、本发明提供了一种外泌体电化学发光免疫传感器，包括：

3、导电基底；

4、设置于导电基底表面的垂直介孔二氧化硅薄膜(vmsf)，二氧化硅薄膜设有朝向检测溶液开放的纳米通道，纳米通道的直径为2-3nm；

5、共同限域于垂直介孔二氧化硅薄膜纳米通道内、顺序构筑的co3o4和pd复合催化体系，优选先在纳米通道内形成co3o4，再形成pd，co3o4和pd在同一纳米通道体系内形成接触或纳米尺度邻近的复合催化区域,纳米尺度的空间是二氧化硅薄膜纳米通道的直径为2-3nm，在2-3nm的通道内，两种催化组分形成紧密接触或纳米级邻近的复合催化区域；具体来说，通过在垂直有序介孔二氧化硅薄膜的开放纳米通道内先电沉积co3o4，再以已限域的co3o4作为pd后续沉积基础进行pd电沉积，并在两次沉积完成后进行热处理，使pd与co3o4在同一纳米通道内形成稳定的相邻接触界面或异质复合催化区域。

6、以及设置于二氧化硅薄膜外表面的外泌体识别层，外泌体识别层包括外泌体识别抗体和封闭非特异性结合位点的封闭剂，外泌体识别抗体通过设置于垂直介孔二氧化硅薄膜外表面的反应性官能团共价固定，反应性官能团为环氧基；

7、其中，co3o4和pd在不外加过氧化氢的鲁米诺-溶解氧电化学发光体系中，协同催化溶解氧还原和鲁米诺氧化，提高所述免疫传感器的初始电化学发光信号；待测外泌体与外泌体识别抗体结合后，使免疫传感器的电化学发光信号降低，根据电化学发光信号的降低程度检测外泌体。

8、具体来说，现有技术虽然已公开在介孔材料或垂直有序介孔二氧化硅薄膜的纳米通道内引入两种催化组分，但已有方案主要关注两种催化组分的共同存在，或者采用共沉积、物理混合及一般性的依次负载方式，未充分解决两种催化组分在狭窄纳米通道内的沉积位置、接触方式和界面稳定性调控问题。特别是，当pd直接沉积于纳米通道或者与钴氧化物同时沉积时，pd的成核位置和颗粒生长过程不易控制，可能导致pd与钴氧化物之间有效接触界面不足，或者在纳米通道口及薄膜外表面形成较大颗粒。仅使pd和钴氧化物同时存在于垂直有序介孔二氧化硅薄膜中，并不能保证形成具有稳定界面接触的复合催化区域。因此，本发明提供一种能够调控co3o4和pd在垂直有序介孔二氧化硅薄膜纳米通道内的形成顺序和空间分布，并能够稳定二者接触界面的复合催化材料制备方法，以提高催化组分的分散程度、界面利用率及催化稳定性。

9、优选的，co3o4位于纳米通道内作为pd的后续沉积基础，pd沉积于已限域co3o4的纳米通道内，完成两次沉积后进行沉积后热处理，使pd与co3o4在同一纳米通道内形成稳定的相邻接触界面或异质复合催化区域；co3o4由含钴前驱体在+1.5v恒电位下沉积20～30s形成，pd由含pd前驱体在-0.5v恒电位下沉积10～20s形成；优选地，co3o4的沉积时间为25s，pd的沉积时间为15s。除非另有说明，本技术中所述电位均相对于ag/agcl参比电极,内参比溶液为饱和kcl溶液。

10、具体来说，以含有co3o4第一催化区域的电极作为后续沉积基底，在含钯前驱体的电解液中进行第二次电化学沉积，使pd沉积于已经含有co3o4的纳米通道内，并使至少一部分pd负载于co3o4表面或者与co3o4相邻接触。对完成所述第一次电化学沉积和第二次电化学沉积的电极进行热处理，使pd与co3o4之间的接触界面稳定化，在同一纳米通道内形成pd/co3o4复合催化区域，得到限域pd/co3o4复合催化材料。

11、在上述制备过程中，co3o4不仅作为催化组分，还为pd的后续沉积提供成核和锚定基础；垂直有序介孔二氧化硅薄膜的纳米通道则对co3o4和pd的沉积及后续热处理过程进行空间约束，以减少催化颗粒在薄膜外表面的过度生长和团聚。沉积后热处理，是指在co3o4电化学沉积和pd的电化学沉积均完成后，对含有两种沉积组分的垂直有序介孔二氧化硅薄膜修饰电极实施的热处理。所述沉积后热处理不同于垂直有序介孔二氧化硅薄膜制备过程中的薄膜老化处理、模板剂去除处理或基底电极预处理。沉积后热处理用于提高钴氧化物催化区域的稳定性，促进pd与co3o4之间形成稳定的相邻接触界面，并减少催化组分在后续使用过程中的迁移和脱落。垂直有序介孔二氧化硅薄膜的纳米通道在热处理过程中对pd和co3o4进行空间约束，以抑制其过度迁移、颗粒长大和通道外团聚。

12、所形成的pd/co3o4复合催化区域，是指pd和co3o4共同存在于相同的垂直有序介孔二氧化硅薄膜纳米通道内，且至少一部分pd与co3o4相邻接触或直接接触形成界面区域。

13、优选的，co3o4和pd共同限域后的沉积后热处理具体为经过80～120℃热处理30～90min；优选地，热处理温度为100℃，热处理时间为45～60min。

14、优选的，外泌体识别抗体为抗cd63抗体，封闭剂为牛血清白蛋白；抗cd63抗体通过设置于垂直介孔二氧化硅薄膜外表面的反应性官能团共价固定，且反应性官能团为环氧基，利用大尺寸外泌体对孔口的阻塞作用，对孔内催化ecl反应实施纳米尺度门控，进而实现对外泌体的检测。

15、提供一种如上所述的外泌体电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

16、（1）在导电基底表面制备垂直介孔二氧化硅薄膜，垂直介孔二氧化硅薄膜设有朝向检测溶液开放的纳米通道；在导电基底表面制备垂直介孔二氧化硅薄膜后，暂不去除纳米通道内的模板胶束，模板胶束存在时采用环氧硅烷试剂进行硅烷化反应，利用模板胶束占据纳米通道，阻止环氧硅烷试剂进入通道内部，使环氧硅烷仅与vmsf外表面及通道入口区域的硅羟基反应，从而使环氧基主要分布在外表面和通道入口附近，去除模板胶束后，得到纳米通道朝向检测溶液开放、且通道内壁未被环氧基修饰的垂直介孔二氧化硅薄膜；

17、（2）将含钴前驱体在+1.5v恒电位下沉积20～30s，在纳米通道内形成co3o4，再将含pd前驱体在-0.5v恒电位下沉积10～20s，使pd沉积于已限域co3o4的纳米通道内，随后在80～120℃热处理30～90min，得到pd/co3o4复合催化体系；

18、（3）在垂直介孔二氧化硅薄膜外表面引入环氧基(o-vmsf)，通过环氧基与抗cd63抗体氨基之间的开环反应，将抗cd63抗体共价固定于垂直介孔二氧化硅薄膜外表面，再用牛血清白蛋白进行封闭，得到外泌体识别层。

19、提供一种如上所述的外泌体电化学发光免疫传感器的检测方法，包括以下步骤：

20、（1）使电化学发光免疫传感器与待测样品接触，使待测样品中的外泌体与外泌体识别抗体发生特异性结合；

21、（2）洗涤电化学发光免疫传感器，以除去未结合的物质；

22、（3）将洗涤后的电化学发光免疫传感器置于含有鲁米诺和溶解氧、且不外加过氧化氢的检测液中，对电化学发光免疫传感器施加包含阴极电位区间和阳极电位区间的电位程序，其中，阴极电位区间用于促进溶解氧还原并生成活性氧物种，阳极电位区间用于促进鲁米诺氧化；

23、（4）采集电化学发光免疫传感器的电化学发光信号，并根据其相对于外泌体结合前的电化学发光信号降低程度，确定待测样品中的外泌体浓度。

24、优选的，步骤（1）中，待测样品与电化学发光免疫传感器在4～39℃孵育40～80min，优选在37℃孵育60min。

25、优选的，步骤（3）中，检测液为含50～200μm鲁米诺的ph6.5～7.6磷酸盐缓冲液，优选为含100μm鲁米诺的0.01m、ph7.4磷酸盐缓冲液；施加的电位扫描范围为-1.0v～+0.8v。

26、在不外加过氧化氢的鲁米诺-溶解氧体系中，pd主要促进界面电子转移和溶解氧还原，co3o4通过其可变价态促进活性氧物种形成，同时pd和co3o4还协同促进鲁米诺氧化。两种作用共同提高电化学发光信号。

27、当待测样品中存在外泌体时，外泌体与固定于薄膜外表面的抗体发生特异性结合。形成的免疫复合物增大电极界面的空间位阻和电子转移阻力，影响检测物质和电活性物种的界面传输，使电化学发光信号随外泌体浓度升高而降低，由此构成信号降低型外泌体电化学发光免疫传感器。

28、优选的，待测样品为细胞培养上清液、血清、血浆或由其分离获得的外泌体样品；外泌体为结直肠癌细胞来源cd63阳性外泌体或待测对象循环系统中的cd63阳性外泌体，检测范围为102～108particles/ml。

29、优选的，待测样品为稀释后的血清样品，所述方法用于获得所述离体血清样品中cd63阳性外泌体的浓度数据，所述浓度数据用于结直肠癌辅助筛查的体外参考。

30、需要指出的是，现有技术中，垂直有序介孔二氧化硅薄膜的制备、表面官能化以及在其纳米通道内限域单一纳米催化剂或复合纳米催化剂以增强鲁米诺电化学发光，均已有相关研究。然而，上述工作通常仅涉及介孔薄膜制备、催化剂负载或电化学发光增强中的单一或局部方面，尚未在同一传感界面中同时实现孔内复合催化、孔外大尺寸外泌体识别、孔口传质门控以及近中性条件下无外加过氧化氢的电化学发光检测之间的协同匹配。

31、本发明所要解决的技术问题在于：如何构建一种基于垂直有序介孔二氧化硅薄膜的传感界面，在vmsf纳米通道内形成位置和界面可控的pd/co3o4复合催化区域，同时将外泌体识别层设置于纳米通道入口周围的膜外表面，使得粒径远大于vmsf孔径的外泌体不能进入纳米通道，而能够在被抗体特异性捕获后对孔口形成可重复的空间阻挡；并且在不向检测液中预先加入过氧化氢的条件下，将该空间阻挡作用转换为可定量的鲁米诺-溶解氧电化学发光信号变化，从而实现对目标外泌体的检测。

32、因此，本发明采用上述的一种外泌体电化学发光免疫传感器及其检测方法，具有以下有益效果：

33、（1）显著增强电化学发光信号：利用vmsf纳米通道原位限域电沉积co3o4和pd，通过在vmsf纳米通道内先形成co3o4、再沉积pd，及后续热处理，构建孔内pd/co3o4复合催化组分，并通过热处理过程，形成接触或纳米尺度邻近的复合催化区域，显著提高催化剂对ecl的增敏性能。pd的高导电性和氧还原活性与co3o4的co2+/co3+可变价态协同作用，同时提高溶解氧还原为活性氧的效率及鲁米诺氧化动力学，使鲁米诺-溶解氧体系的ecl信号大幅增强；在相同检测条件下，该复合催化组分产生的鲁米诺-溶解氧电化学发光信号高于单独pd或单独co3o4修饰电极。

34、（2）同时促进溶解氧还原和鲁米诺氧化：pd/co3o4复合催化体系不仅提高氧还原反应电流，而且提高鲁米诺氧化电流，从两个关键反应步骤共同增强鲁米诺-溶解氧电化学发光。

35、（3）实现无过氧化氢的简便绿色检测：以溶解氧为共反应物，无需外加过氧化氢，体系简单、生物兼容性好，避免强氧化剂对样品的干扰，操作更安全便捷。pd促进溶解氧还原和界面电子传输，co3o4的co2+/co3+循环参与活性氧转化，二者共同提高鲁米诺-溶解氧体系的初始ecl信号；外泌体在孔口的结合又降低反应物和活性中间体的传质，从而构成“高基线、信号降低型”的检测模式。

36、（4）提高传感器稳定性与重复性：纳米通道的空间限域作用有效防止pd/co3o4团聚和脱落，结合分步电沉积及后续热处理，使催化材料锚定牢固、分布均匀，显著改善了信号稳定性和批次间重复性。无vmsf限域的pd/co3o4/ito电极连续扫描10圈的电化学发光信号相对标准偏差为23%，而pd/co3o4@vmsf/ito电极的相对标准偏差为1%。

37、（5）赋予优异的抗干扰能力：vmsf的尺寸筛分效应和电荷选择性可阻挡复杂生物样品中大分子干扰物，仅允许小分子扩散；外表面共价固定抗cd63抗体并以bsa封闭非特异性位点，进一步降低非特异性吸附，实现复杂样品的直接分析。

38、（6）实现结直肠癌相关外泌体的高灵敏定量检测：催化组分位于纳米通道内部，识别抗体和牛血清白蛋白封闭层位于纳米通道入口所在的薄膜外表面，由此形成孔内催化和孔外免疫识别的空间分区结构。目标外泌体被捕获后增大孔口处的传质阻力和界面电子转移阻力，从而产生可定量的信号降低响应。基于抗cd63抗体特异性捕获外泌体，结合免疫复合物引起的ecl信号降低，检测范围达102～108particles/ml，覆盖宽动态区间，可有效区分结直肠癌患者与健康人血清样品，适用于细胞上清、血清、血浆等多种样本。

39、（7）本发明中孔内催化与孔外识别之间形成了协同配合的功能耦合关系。一方面，将pd/co3o4复合催化剂限域于vmsf纳米通道内，能够在近中性、无外加过氧化氢条件下提供较高的初始鲁米诺-溶解氧电化学发光信号，从而保证外泌体引起的信号变化具有足够的检测灵敏度和信噪比；另一方面，将外泌体识别层设置于纳米通道入口周围的膜外表面，使粒径大于vmsf孔径的外泌体在特异性捕获后对孔口形成空间阻挡，进而有效调控孔内催化反应物和产物的传质过程，产生与外泌体浓度相关的电化学发光信号降低。上述孔内催化区域与孔外识别区域的位置匹配和功能协同，是实现外泌体高灵敏度、无外加过氧化氢电化学发光检测的关键。

40、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。