一种金-碳点复合纳米酶及其制备方法和应用与流程

本发明属于纳米酶工程与生物检测，涉及一种金-碳点复合纳米酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、葡萄糖是机体细胞活动的主要能量来源，其浓度水平与机体代谢状态密切相关。血糖浓度异常是糖尿病及其并发症发生发展的重要指标。长期高血糖可引发心脑血管疾病、视网膜病变、肾病及病足等。因此，实现血液中葡萄糖的快速、准确检测对于糖尿病的早期筛查、病情监测及临床诊断具有重要意义。

2、目前，用于检测葡萄糖的分析技术包括比色法、荧光法、表面增强拉曼光谱法、色谱分析法以及电化学法等。其中，比色法因检测过程简单、成本低、响应快速且检测结果可直接通过颜色变化进行判读而受到广泛关注，具有良好的现场检测和即时检测应用前景。现有比色检测体系大多基于葡萄糖氧化酶（gox）催化葡萄糖生成过氧化氢，再利用辣根过氧化物酶（hrp）或类过氧化物酶催化显色底物发生颜色变化，从而实现葡萄糖检测。虽然天然酶具有较高的催化活性和底物特异性，但其存在制备成本高、储存条件苛刻、稳定性差、易失活及难以重复利用等问题，限制了其在实际检测中的应用。

3、近年来，具有酶模拟活性的纳米酶因制备简单、稳定性好、成本低及易于规模化生产等优势而受到广泛关注。然而，现有多数纳米酶仅具备单一酶活性，难以独立完成葡萄糖氧化及显色反应所需的级联催化过程，通常仍需引入天然gox参与反应体系，未能从根本上解决天然酶依赖的问题。

4、因此，开发一种同时具有gox活性和hrp活性的级联纳米酶体系，实现对葡萄糖的无酶或全纳米酶化检测，对于构建低成本、高稳定性、操作简便且灵敏的葡萄糖比色传感平台具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种金-碳点复合纳米酶及其制备方法和应用，实现准确且灵敏地检测血液中的葡萄糖含量。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种制备金-碳点复合纳米酶的方法，所述制备金-碳点复合纳米酶的方法包括：将β-环糊精与纯水混合进行水热反应，得到碳点溶液；将所述碳点溶液与氯金酸溶液以及β-环糊精溶液混合进行水浴加热反应，使用碱性调节剂调节反应体系呈碱性，冷却得到金-碳点复合纳米酶。

4、本发明中以β-环糊精（β-cd）为前驱体碳源，通过一步水热法制备碳点（cds），再经原位生长法成功合成具有葡萄糖氧化酶（gox）样和过氧化物酶（pod）样双重活性的au-cds级联纳米酶，无需添加天然酶，即可独立完成葡萄糖氧化及底物催化显色反应，实现对葡萄糖的快速比色检测。

5、优选地，所述β-环糊精与纯水的质量比为1:(40-60)，例如可以是1:40、1:50或1:60。

6、优选地，所述水热反应的温度为170℃-190℃（例如可以是170℃、180℃或190℃），时间为4-8 h（例如可以是4 h、6 h或8 h）。

7、优选地，所述氯金酸溶液的浓度为0.5-2%（w/v），例如可以是0.5%（w/v）、1%（w/v）或2%（w/v）。

8、优选地，所述β-环糊精溶液中β-环糊精的浓度为5-15 mm，例如可以是5 mm、10 mm或15 mm。

9、优选地，所述氯金酸溶液、β-环糊精溶液、碳点溶液与溶剂纯水的体积比为1:(1-3):(2-10):(40-60)，例如可以是1:1:2:40、2:5:10:100或1:3:10:60。

10、优选地，所述水浴加热反应的温度为55℃-65℃，例如可以是55℃、60℃或65℃。

11、优选地，所述碱性调节剂包括：naoh溶液。

12、优选地，所述naoh溶液的浓度为3-7 m，例如可以是3 m、5 m、6 m或7 m。

13、第二方面，本发明提供一种金-碳点复合纳米酶，所述金-碳点复合纳米酶由第一方面所述的制备金-碳点复合纳米酶的方法制备得到。

14、第三方面，本发明提供第二方面所述的金-碳点复合纳米酶在制备用于检测葡萄糖含量的产品中的应用。

15、优选地，所述产品包括葡萄糖检测试剂盒。

16、第四方面，本发明提供一种检测葡萄糖的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的金-碳点复合纳米酶。

17、第五方面，本发明提供一种检测葡萄糖的方法，所述检测葡萄糖的方法包括以下步骤：

18、（1）将第二方面所述的金-碳点复合纳米酶与待测样品在弱碱性缓冲体系中混合，孵育；

19、（2）向步骤（1）孵育后所得的反应体系中加入显色底物和显色促进剂，进行显色反应，检测反应体系的吸光度值；

20、（3）根据葡萄糖浓度与吸光度值的标准曲线，计算待测样品中葡萄糖的含量。

21、优选地，所述弱碱性缓冲体系的ph为7.8-8.2，例如可以是7.8、8.0或8.2。

22、优选地，所述金-碳点复合纳米酶与待测样品的体积比为1:(1-3)，例如可以是1:1、1:2或1:3。

23、优选地，所述孵育的温度为35℃-45℃（例如可以是35℃、40℃或45℃），时间为1-3h（例如可以是1 h、2 h或3 h）。

24、优选地，所述显色底物包括浓度为30-35 mm的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb），例如可以是30 mm、33 mm或35 mm。

25、优选地，所述显色促进剂包括浓度为15-25 mm的cu2+，例如可以是15 mm、20 mm或25 mm。

26、优选地，所述显色反应的温度为25℃-35℃（例如可以是25℃、30℃或35℃），时间为25-35 min（例如可以是25 min、30 min或35 min）。

27、在本发明的一个实施例中，检测葡萄糖的方法包括：在250 μl pbs缓冲液（ph=8，0.01 m）中加入50 μl金-碳点复合纳米酶溶液和50 μl待测葡萄糖溶液（0-15 mm），敞口置于混匀仪中，40℃反应2 h；随后依次加入10 μl稀释100倍的乙酸、20 μl cu2+（20 mm）和30μl tmb（33 mm），30℃孵育30 min后，测定混合溶液在652 nm处的吸光度值；以葡萄糖浓度对数为横坐标、吸光度值为纵坐标建立标准曲线，在0.05-1mm和1-15 mm范围内线性关系良好，线性方程分别为y=0.57x+0.97（r2=0.96）和y=1.13x+1.04（r2=0.98），检出限为15 μm。

28、在本发明的一个实施例中，待测样品为实际血液样本，将人血清离心后，用pbs缓冲溶液（ph=8，0.01 m）稀释100倍后，再与金-碳点复合纳米酶进行混合反应。

29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

30、（1）本发明以β-环糊精为前驱体制备au-cds复合纳米酶，β-环糊精的主客体识别作用可提高纳米酶与底物之间的亲和力，从而增强催化性能；

31、（2）本发明au-cds纳米复合酶易于合成、同时兼具类hrp和类gox的双酶活性，能够高效催化氧化tmb，通过h2o2自供体系实现对血液中葡萄糖的比色检测；

32、（3）本发明检测葡萄糖的方法与现有的级联催化平台相比，无需引入天然葡萄糖氧化酶等生物酶即可实现葡萄糖的比色检测，具有成本低、稳定性好和操作简便等优点，可用于血液样品中葡萄糖的快速可视化检测，在糖尿病辅助诊断和健康监测领域具有良好的应用前景。