一种γ-环糊精复合纳米通道及其制备方法与应用与流程

本发明涉及纳米材料和生物单分子分析，具体涉及一种γ-环糊精复合纳米通道及其制备方法与应用。

背景技术：

1、多肽翻译后修饰是调控蛋白质结构、功能、定位和相互作用的重要方式。常见的翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化，不同翻译后修饰可能会导致多肽的电荷分布、空间构象、疏水性以及分子识别行为发生变化，因此，对多肽翻译后修饰状态进行准确鉴别，对于多肽和蛋白质功能研究具有重要意义。

2、现有多肽翻译后修饰分析技术通常包括质谱分析、酶联免疫分析、色谱分离以及电泳分析，其中，质谱分析具有较高的灵敏度和结构解析能力，但通常需要复杂的样品前处理和专业仪器；酶联免疫依赖于昂贵复杂的设备和繁琐的样品前处理步骤；色谱和电泳方法在复杂样品中的区分能力较弱。

3、为了实现高灵敏度的单分子检测，纳米通道技术应运而生。然而，现有的天然生物纳米通道（如α-溶血素）虽然具备极高的空间分辨率，但其必须依附于脆弱的脂质双分子层膜结构。这导致生物孔对机械震动、温度、ph值及高盐浓度等极端环境因素极为敏感，环境耐受性极差，难以在复杂物理环境下进行长时间连续监测，也极大限制了其在下一代高通量、集成化便携式生物芯片中的工程化应用。

4、相比之下，人工制备的传统无机固态纳米通道具备优异的机械强度、化学稳定性和孔径可调性，且易于规模化集成，但也存在着核心的传感缺陷。一方面，原始固态孔表面缺乏天然的特异性结合位点，难以直接区分形状相似但序列不同的蛋白质异构体或微小的修饰基团。另一方面，在强电场驱动下，由于孔壁与生物分子之间缺乏有效的特异性相互作用，分子往往以极快的速度飞速穿过孔道，导致现有检测系统的带宽难以捕捉到清晰的特征阻断信号。这两大痛点使得传统固态纳米通道在面对仅存在微小氨基酸差异的短肽，或带有极小体积与电荷变化的翻译后修饰肽段时，特异性严重不足，且容易遭受非特异性吸附的干扰导致孔道堵塞和信号失真，无法实现高分辨率的精准鉴别。

5、因此，提供一种在多肽翻译后修饰鉴别方面具有高特异性和高稳定性的纳米通道对于蛋白质研究具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于，如何提高多肽翻译后修饰鉴别的特异性和稳定性。

2、为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种γ-环糊精复合纳米通道，所述γ-环糊精复合纳米通道包括：

3、悬空薄膜：所述悬空薄膜设置有纳米通道；

4、γ-环糊精分子：所述γ-环糊精分子嵌合并固定于所述纳米通道内部；

5、其中，所述纳米通道的孔径为1.8~2.5nm。

6、所述悬空薄膜选自硅氮化硅悬空薄膜、硅基碳化硅悬空薄膜、硅基二氧化硅悬空薄膜中的任意一种。

7、作为优选，所述悬空薄膜的厚度为10~20nm。

8、与目前单分子研究领域常用的α-溶血素等天然生物纳米通道相比，本发明利用坚固的氮化硅、碳化硅或者氮化铝作为基底，彻底解决了生物孔依赖脂双层膜所导致的机械稳定性差、寿命短以及对酸碱/高盐环境耐受性低等固有缺陷。本发明成功将超分子的主客体识别机制集成到高强度的无机基底中，在保持器件极高稳定性的同时，使纳米通道获得了足以高轴向空间分辨率。

9、在本发明提供的技术方案中，采用纳米通道-γ-环糊精分子的排布，通过“孔中孔”结构的亚纳米限域空间，有效引入了主客体特异性相互作用。在本发明提供的γ-环糊精复合纳米通道中，纳米通道的孔径为1.8~2.5nm，这使得纳米通道孔径与γ-环糊精分子的尺寸相适配，γ-环糊精可有效固定于纳米通道内，保证γ-环糊精的稳定。

10、此外，在本发明提供的γ-环糊精复合纳米通道中，所形成的复合纳米通道的孔径约为0.95nm，这导致每次仅有一条肽链能够穿过γ-环糊精的内腔，不同翻译后修饰状态所导致的分子体积、电荷分布、疏水性和空间构象差异能够转化为可检测的电流阻断幅值和/或电流阻断时间差异，从而提高对多肽翻译后修饰状态的鉴别特异性。同时，多肽在通过纳米通道时可与γ-环糊精空腔及纳米通道内壁发生相互作用，使待测多肽在纳米通道内的停留时间延长，相较于未嵌合γ-环糊精的纳米通道，本发明提供的γ-环糊精复合纳米通道有利于降低待测多肽的通过速度，延长电流阻断事件的持续时间，从而提高电信号的时间分辨率和数据特征的准确性。

11、进一步地，本发明第二方面提供一种第一方面所述γ-环糊精复合纳米通道的制备方法，包括以下步骤：

12、s1：对悬空薄膜进行清洗和亲水化处理；

13、s2：将步骤s1处理后的悬空薄膜组装于流体池中，在悬空薄膜两侧加入电解质缓冲液，通过受控介质击穿在所述悬空薄膜上形成纳米孔道；

14、s3：通过电压脉冲将所述纳米孔道的孔径调控至1.8~2.5nm，形成纳米通道；

15、s4：将流体池一侧的电解质缓冲液替换为含有γ-环糊精的电解质缓冲液，施加偏压使γ-环糊精嵌合于所述纳米通道中，获得γ-环糊精复合纳米通道。

16、作为优选，所述步骤s4中，含有γ-环糊精的电解质缓冲液加入侧为顺式侧，所述偏压为100~300mv。

17、作为优选，所述电解质缓冲液为含有氯化钾、氯化钠、氯化镁中任意一种或多种盐的生物缓冲液。

18、作为优选，所述生物缓冲液选自te缓冲液、hepes缓冲液、pbs缓冲液、mes缓冲液、tris-hcl缓冲液、pipes缓冲液中的任意一种或多种。

19、进一步地，本发明第四方面提供一种多肽翻译后修饰的鉴别方法，包括以下步骤：

20、a1：取权利要求1~3任一所述的γ-环糊精复合纳米通道，将所述γ-环糊精复合纳米通道夹装在液体池中间；

21、a2：将含有待测寡肽的样品溶液加入到液体池的顺式侧，将不含待测寡肽的空白溶液加入到液体池的反式侧；

22、a3：在所述液体池的顺式侧和反式侧施加偏压，同时监测待测样品穿过所述γ-环糊精复合纳米通道产生的电信号特征；

23、a4：根据电信号，鉴别所述待测寡肽的翻译后修饰状态。

24、在本发明提供的技术方案中，γ-环糊精具有疏水性空腔和亲水性外缘，当γ-环糊精分子固定于纳米通道内部时，能够在纳米通道中形成具有分子识别能力的限域区域，对于多肽具有特异性识别能力，复合纳米通道的孔径约为0.95nm，该孔径将使得复合纳米通道每次进允许一条肽链通过，当一条多肽在外加偏压作用下通过所述γ-环糊精复合纳米通道时，其氨基酸侧链、翻译后修饰基团以及整体电荷分布可与γ-环糊精空腔及纳米通道内壁产生不同程度的相互作用从而改变待测多肽在纳米通道中的通过行为，该行为可通过电流阻断幅值和/或电流阻断时间进行体现，因此，通过采集并分析相关电信号，即可对多肽翻译后修饰状态进行鉴别。

25、进一步地，本发明第五方面提供γ-环糊精在制备多肽翻译后修饰鉴别产品中的应用。

26、与现有技术相比，本发明具备的有益效果：本发明提供的γ-环糊精复合纳米通道和γ-环糊精复合纳米通道芯片在寡肽鉴别、多肽翻译后修饰结构区分方面具有特征性强、可靠性好的优点，采用本发明提供的γ-环糊精复合纳米通道或γ-环糊精复合纳米通道芯片，能够实现寡肽序列和多肽翻译后修饰状态的准确鉴别，为蛋白质功能研究提供了重要工具。同时，本发明提供的γ-环糊精复合纳米通道的制备方法简单，商业和科研前景广阔。