一种用于评估高原急性缺氧致持续认知损伤的生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学，尤其涉及一种用于评估高原急性缺氧致持续认知损伤的生物标志物及其应用。

背景技术：

1、飞行人员在高原环境作业时，面临低氧、低气压等极端环境，易于诱发空间定向障碍。其中，空间认知损伤导致的飞行事故或事故征候严重威胁飞行安全。且急性严重缺氧损伤后，即使脱离缺氧环境，脑认知功能也难以完全恢复正常，呈现出一种“认知损伤持续状态”，其原因在于，海马作为对缺氧高度敏感、高代谢且易于受累的脑区，在边缘系统与内嗅皮层共同参与空间认知，其结构、功能状态异常与学习认知改变息息相关。大脑是对缺氧最为敏感的器官，其重量仅占体重的2%，却消耗全身20%的氧气与25%的葡萄糖。海马组织作为负责空间信息编码、感觉整合及目标指向性行为的核心脑区，在急性缺氧环境下极易发生损伤，并且这种损伤往往具有隐匿性，飞行人员容易低估自身认知能力的下降。现有研究证实，海拔每增高1000米，劳动能力降低约10%，且即使驻留时间延长，精细操作、学习认知功能也难以恢复至平原水平。

2、传统的乳酸、血氧饱和度检测仅能反映瞬时代谢状态，无法精确示踪中枢神经系统海马空间认知功能的器质性与功能性演变，缺乏能够客观评价急性缺氧后认知损伤“持续状态”的手段。现有的诊断多依赖于行为学量表或心理学测试，受主观因素干扰大，且无法揭示损伤的深层分子机制。在干预方面，由于飞行作业的特殊性，对中枢神经系统调控药物有严格限制，现有的卫生保障手段在“非药物干预”和“精准靶向防护”方面存在明显短板。

3、近年来，乳酸作为信号分子的功能受到广泛关注，缺氧导致的机体能量代谢改变会产生大量乳酸，而乳酸可通过蛋白质乳酰化（lactylation）这一新型翻译后修饰将细胞代谢状态与基因调控紧密联系。然而，尽管已有多项研究报道了乳酰化修饰在肿瘤、炎症等疾病中的作用，但在急性高原缺氧致中枢神经系统认知损伤领域，尤其是针对海马组织空间认知功能的特异性乳酰化修饰位点及其与认知损伤持续状态之间的关系，目前尚无明确结论。此外，星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（anls）和神经元乳酸代谢是维持神经元能量供给的关键途径，但介导该穿梭系统功能状态的核心分子事件及其调控机制迄今未被阐明。因此，寻找一种能够客观、精准、灵敏地反映急性高原缺氧致空间认知损伤“持续状态”的生物标志物，不仅有助于揭示缺氧致认知损伤的分子本质，更可为建立客观的认知损伤评估体系、筛选干预措施提供科学依据，对于保障高原环境暴露人员的作业安全具有重要价值。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供丙酮酸激酶m蛋白第135位赖氨酸残基的乳酰化修饰作为生物标志物在制备用于评估高原急性缺氧致持续认知损伤的产品中的应用，解决了传统检测手段仅能反映瞬时代谢状态、受主观因素干扰大、无法揭示损伤的深层分子机制、缺乏能够可观反映急性缺氧后认知损伤“持续状态”的分子标志物的问题；本发明通过该乳酰化修饰能够客观、精准、灵敏地反映高原急性缺氧暴露后海马相关性空间认知损伤的程度及持续状态，为高原环境暴露人员的认知功能评估、风险预警及药物筛选提供可靠的分子靶标，对于保障飞行安全、优化高原航空卫生保障方案具有重要的应用价值。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种用于评估高原急性缺氧致持续认知损伤的生物标志物，所述生物标志物为丙酮酸激酶m蛋白第135位赖氨酸残基的乳酰化修饰。

4、根据上述技术手段，本发明通过大量实验发现，急性低压缺氧（海拔6000m暴露7h）后，大鼠的海马组织内丙酮酸激酶m蛋白（pkm）第135位赖氨酸残基的乳酰化修饰（pkm-k135la）水平显著下降，且该下降趋势与空间认知功能障碍（morris水迷宫逃避潜伏期增加、穿越平台次数减少）在时间轴上高度一致，特别是在暴露后第14天仍呈现显著的持续状态。

5、本发明通过pkm-k135r（丙酮酸激酶m蛋白（pkm）第135位赖氨酸残基的非乳酰化模拟）点突变实验证明，该位点乳酰化修饰的缺失直接导致pkm酶活性显著降低、乳酸合成减少，进而导致海马神经元电活动减弱（动作电位频率和网络爆发显著减少）及突触可塑性相关蛋白（syn1、psd95、bdnf）表达下调。

6、本发明还通过星形胶质细胞-神经元共培养实验证明，pkm-k135la通过调节pkm酶活性驱动“星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（anls）”，该位点乳酰化水平降低会导致神经元能量供应不足，最终导致认知受损。

7、第二方面，本发明提供了丙酮酸激酶m蛋白第135位赖氨酸残基的乳酰化修饰在制备用于评估高原急性缺氧致持续认知损伤的产品中的应用。

8、进一步的，所述产品为检测试剂或检测试剂盒。

9、进一步的，所述持续认知损伤为海马相关性空间认知损伤，所述认知损伤在高原急性缺氧暴露后持续至少14天。

10、第三方面，本发明提供了一种用于评估高原急性缺氧致持续认知损伤的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合丙酮酸激酶m蛋白第135位赖氨酸残基乳酰化修饰的抗体或配体。

11、进一步的，所述试剂盒还包含选自下组的至少一种组分：蛋白裂解液、洗涤缓冲液、封闭液、显色底物、阳性对照品和阴性对照品。

12、第四方面，本发明提供了一种上述的丙酮酸激酶m蛋白第135位赖氨酸残基的乳酰化修饰在制备用于预防或治疗急性高原缺氧致认知损伤的药物中的应用。

13、第五方面，本发明提供了一种药物，所述药物以丙酮酸激酶m蛋白第135位赖氨酸残基乳酰化修饰为靶点。

14、第六方面，本发明提供了一种筛选用于预防或治疗急性高原缺氧致认知损伤药物的方法，包括以下步骤：

15、s1、将待筛选药物与表达丙酮酸激酶m蛋白的细胞接触；

16、s2、检测所述细胞中丙酮酸激酶m蛋白第135位赖氨酸残基的乳酰化修饰水平；

17、s3、以能够提高所述乳酰化修饰水平的待筛选药物作为目标药物。

18、进一步的，所述细胞为海马神经元细胞和/或海马星形胶质细胞。

19、本发明实现的有益效果：

20、1、本发明首次发现并鉴定了丙酮酸激酶m蛋白第135位赖氨酸残基乳酰化修饰（pkm-k135la）与高原急性缺氧致持续认知损伤密切相关，可作为高原急性缺氧致持续性认知损伤的生物标志物，填补了本领域中缺乏客观分子评价指标的空白，且乳酰化修饰作为近年来新发现的翻译后修饰类型，本发明将其首次引入高原缺氧认知损伤的评价体系，拓展了蛋白质翻译后修饰在医学中的应用边界。

21、2、本发明通过morris水迷宫行为学评价与分子检测的平行分析，首次揭示了pkm-k135la水平的变化与空间认知功能障碍在时间轴上高度一致；特别是在高原急性缺氧暴露后14天，pkm-k135la水平仍处于显著下调持续状态，其与行为学上的逃避潜伏期延长、穿越平台次数减少在时间上完全吻合，能够有效区分一过性的认知波动与持续性的认知损伤，为高原作业人员认知功能的长期监测提供了可靠的分子指标。

22、3、本发明通过点突变实验和共培养实验，从分子、细胞、电生理以及行为学多层次的证明了pkm-k135la通过调控anls系统影响神经元功能的因果关系，而非简单的相关性发现，具体的，pkm-k135la下调、pkm酶活性降低、乳酸合成减少、anls受损、神经元能量供应障碍、突触可塑性蛋白下调、最终认知功能障碍。

23、4、本发明通过枸杞多糖（lbp）干预实验证明了提升pkm-k135la水平可有效改善认知损伤，验证了pkm-k135la作为药物筛选靶点的实际应用价值，为高原缺氧认知保护的药物研发提供了筛选平台，具有明确的产业转化前景，应用前景广。

24、5、相对于传统的行为学量表和心理学测试，本发明提供的分子标志物检测更加客观、精准，不受主观因素干扰，有助于实现认知损伤的早期识别和精准干预，降低事故风险，保障人员安全，具有显著的社会效益和经济效益，操作简便，适合产业化推广。