油红O染色工作液、其制备方法、试剂盒及应用与流程

本申请涉及细胞脂质染色，尤其涉及一种油红o染色工作液、其制备方法、试剂盒及应用。

背景技术：

1、皮肤皮脂分泌过多是导致油性皮肤、痤疮等问题的关键因素。人永生化皮脂腺细胞系（如sz95细胞）是体外研究皮脂合成调控的常用模型。在评估细胞脂质含量时，油红o染色法因成本低廉、操作简便而被广泛应用。

2、然而，现有油红o染色技术在实际操作中仍存在不足。为充分溶解油红o染料，传统染色液通常含有高体积比（≥50%）的有机溶剂（尤其是乙醇）。在染色操作过程中，乙醇快速挥发导致染色液局部过饱和，油红o染料易在细胞培养板壁上析出形成结晶，不仅造成非特异性背景着色，还导致酶标仪吸光度读数波动大，严重影响定量重复性。为改善上述结晶问题，现有技术曾尝试向染色液中添加助溶剂或表面活性剂，但多聚焦于单一组分的调整，且效果不佳。

技术实现思路

1、本申请提供了一种油红o染色工作液、其制备方法、试剂盒及应用，旨在解决现有油红o染色液因有机溶剂挥发导致染料析出结晶、非特异性背景吸附严重，进而影响吸光度定量准确性的问题。

2、为解决上述问题，本申请第一方面提供了一种油红o染色工作液，所述油红o染色工作液包括油红o储备液和稀释液；

3、所述油红o储备液包括油红o、乙醇和水杨酸；

4、所述稀释液包括水、乙醇、丙二醇和吐温20。

5、在一些实施方式中，所述油红o储备液和所述稀释液独立存放，所述工作液由所述油红o储备液与所述稀释液在使用前混合制得。

6、在一些实施方式中，所述油红o储备液与所述稀释液的体积比为（2.5~3.5）:（1.5~2.5）。

7、在一些实施方式中，所述油红o储备液与所述稀释液的体积比为3:2。

8、在一些实施方式中，在所述油红o储备液中，所述油红o和所述水杨酸溶于乙醇，所述油红o的质量体积百分浓度为0.4%~0.6%，所述水杨酸的质量体积百分浓度为0.04%~0.06%。

9、在一些实施方式中，在所述稀释液中，所述水的体积百分含量为30.0%~40.0%，所述乙醇的体积百分含量为55.0%~65.0%，所述丙二醇的体积百分含量为1.0%~8.0%，所述吐温20的体积百分含量为0.5%~2.0%。

10、在一些实施例中，所述稀释液还包括水杨酸；在所述稀释液中，所述水的体积百分含量为35%，所述乙醇的体积百分含量为58%，所述丙二醇的体积百分含量为5%，所述吐温20的体积百分含量为1.5%，余量为所述水杨酸。

11、本申请第二方面还提供了一种如上所述的油红o染色工作液的制备方法，油红o染色工作液的制备方法包括以下步骤：

12、制备所述油红o储备液：将所述油红o与所述水杨酸溶于所述乙醇；

13、制备所述稀释液：将所述水、所述乙醇、所述丙二醇和所述吐温20混合；

14、将所述油红o储备液与所述稀释液按比例混匀，过滤，得到所述油红o染色工作液。

15、本申请第三方面还提供了一种基于人皮脂腺细胞的控油功效评价试剂盒，基于人皮脂腺细胞的控油功效评价试剂盒包括如上所述的油红o染色工作液。

16、在一些实施方式中，所述基于人皮脂腺细胞的控油功效评价试剂盒还包括200μm~400μm的油酸钠和脱水液，所述脱水液包括8%~12%的乙醇、0.5%~1.0%的吐温20和6%~10%的丙二醇。

17、本申请还提供了如上所述的油红o染色工作液在基于人皮脂腺细胞的控油功效评价方法中的应用。

18、在一些实施方式中，所述基于人皮脂腺细胞的控油功效评价方法包括以下步骤：

19、细胞诱导：将人皮脂腺细胞接种培养至贴壁后，更换为含有200μm~400μm油酸钠的培养基，诱导培养，以模拟高脂环境刺激脂质合成；

20、细胞处理：弃所述培养基，用多聚甲醛固定人皮脂腺细胞；随后，采用脱水液处理细胞；

21、染色与定量：弃所述脱水液，加入所述油红o染色工作液，避光染色；弃所述油红o染色工作液，用纯水轻柔漂洗；加入无水乙醇震荡萃取，转移萃取液至96孔板，用酶标仪于510nm波长测定吸光度，以此相对定量细胞脂质含量；

22、其中，所述脱水液包括8%~12%的乙醇、0.5%~1.0%的吐温20和6%~10%的丙二醇。

23、本申请油红o染色工作液引入水杨酸，利用丙二醇、吐温20与水杨酸三者的协同作用，显著提升了染色液的综合性能。丙二醇有效降低体系中有机溶剂（乙醇）的挥发速率，延缓染色过程中因溶剂快速蒸发导致的染料过饱和；吐温20作为非离子型表面活性剂，增强油红o在水-醇混合体系中的溶解度和胶体分散性；水杨酸则进一步抑制油红o染料分子的聚集与重结晶。三者协同配合，使油红o染色工作液在染色操作期间始终保持高度均一的胶体稳定状态，极大减少了染料在细胞培养板壁上的结晶残留。

24、本申请油红o染色工作液的染色背景洁净，定量准确性高。由于板壁结晶残留显著减少，非特异性背景吸附得到有效抑制，使得基于酶标仪吸光度（510 nm波长）的脂质定量方法背景噪音低、信噪比高。本申请油红o染色工作液的定量重复性和线性相关性显著优于传统高乙醇体系油红o染色液，有效克服了现有技术中因背景干扰导致的吸光度读数波动大、定量不准的缺陷。

25、本申请油红o染色工作液适用于高通量控油活性物质筛选。本申请油红o染色工作液成本低廉，配合基于油酸钠诱导的人皮脂腺细胞模型及优化的染色前脱水处理步骤，可实现对控油活性物质的高效、准确评估，具有良好的工业应用前景。

1. 一种油红o染色工作液，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的油红o染色工作液，其特征在于，所述油红o储备液和所述稀释液独立存放，所述工作液由所述油红o储备液与所述稀释液在使用前混合制得。

3.根据权利要求1所述的油红o染色工作液，其特征在于，所述油红o储备液与所述稀释液的体积比为（2.5~3.5）:（1.5~2.5）。

4.根据权利要求1所述的油红o染色工作液，其特征在于，在所述油红o储备液中，所述油红o和所述水杨酸溶于乙醇，所述油红o的质量体积百分浓度为0.4%~0.6%，所述水杨酸的质量体积百分浓度为0.04%~0.06%。

5.根据权利要求1所述的油红o染色工作液，其特征在于，在所述稀释液中，所述水的体积百分含量为30.0%~40.0%，所述乙醇的体积百分含量为55.0%~65.0%，所述丙二醇的体积百分含量为1.0%~8.0%，所述吐温20的体积百分含量为0.5%~2.0%。

6.一种根据权利要求1~5任一项所述的油红o染色工作液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.一种基于人皮脂腺细胞的控油功效评价试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~5任一项所述的油红o染色工作液。

8.根据权利要求7所述的基于人皮脂腺细胞的控油功效评价试剂盒，其特征在于，还包括200μm~400μm的油酸钠和脱水液，所述脱水液包括8%~12%的乙醇、0.5%~1.0%的吐温20和6%~10%的丙二醇。

9.权利要求1~5任一项所述的油红o染色工作液在基于人皮脂腺细胞的控油功效评价方法中的应用。

10.根据权利要求9所述的油红o染色工作液在基于人皮脂腺细胞的控油功效评价方法中的应用，其特征在于，所述基于人皮脂腺细胞的控油功效评价方法包括以下步骤：