联合检测试剂纸条、试剂卡、试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物检测，并具体涉及一种联合检测试剂纸条、试剂卡、试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、胰岛素原在胰岛β细胞中被酶促裂解为等摩尔浓度的胰岛素（insulin）（a链和b链）和c肽分子。胰岛素是维持血糖浓度稳定的关键激素，对生长发育有重要意义；c肽浓度与外源胰岛素无关，不受胰岛素治疗诱导的胰岛素自身抗体干扰，能够有效且广泛评估胰岛β细胞功能。另外胰岛素在血液中半衰期较短约为3-5min，c肽的半衰期约为20-30min，因此胰岛素和c肽的及时准确测定对胰岛功能评估有重要意义。

2、目前胰岛素（ins）和c肽的的测试方法主要有免疫检测技术有酶联免疫法（elisa）、化学发光免疫分析法（clia）、荧光免疫层析单项检测法等。

3、酶联免疫法（elisa）多为半定量检测，无法为临床判读提供准确定量值，无法有效指导临床评估及治疗。化学发光免疫（clia）法由于无放射性污染、灵敏度高等优点被广泛应用于血液成分检测，但检测样本类型单一，大多用于血清血浆样本检测，无法测试全血样本；该类产品配套仪器大型，无法适配床旁检测、基层医疗及家用医疗需求；且化学发光法暂无法实现多项目联合检测，其检测时间长、检测效率较低。常规荧光免疫层析单项检测方法无法实现多项目联合检测，在末梢血多项检测时需要血液样本量较大，对婴儿等群体体验感不足，且检测时间多为15-20min；且胰岛素和c肽是由胰岛素原经过酶切释放，两者与胰岛素原分子结构高度同源，胰岛素原容易对胰岛素及c肽测定带来干扰，造成检测结果假阳性或假阴性偏高，影响检测结果准确性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种联合检测试剂纸条、试剂卡、试剂盒及其制备方法和应用。本发明通过针对不同项目选用双抗体分别做包被抗体、标记抗体，实现多项目联合检测，减少检测样本的使用量，降低胰岛素原干扰，提高检测准确性，具有良好检测性能。

2、本发明第一方面提供了一种联合检测试剂纸条，所述联合检测试剂纸条包括底板和依次搭接设置在所述底板上的样品处理垫、标记结合垫、分析膜和吸水纸；

3、所述标记结合垫上含有标记物标记的胰岛素第一检测抗体、标记物标记的c肽第一检测抗体和标记物标记的第一质控物，所述标记物包括时间分辨荧光微球；

4、所述分析膜上间隔设置有胰岛素检测线、c肽检测线和质控线；

5、所述胰岛素检测线包被有胰岛素第二检测抗体；所述c肽检测线包被有c肽第二检测抗体；所述质控线包被有能够与所述标记物标记的第一质控物特异性结合的第二质控物。

6、本发明的联合检测试剂纸条为胰岛素、c肽联合检测试剂纸条。

7、在一个可选的实施方式中，所述胰岛素第二检测抗体识别胰岛素分子的二硫键空间构象表位，且所述c肽第二检测抗体识别c肽分子中游离羧基端表位；

8、或者，所述胰岛素第一检测抗体识别胰岛素分子的二硫键空间构象表位，且所述c肽第一检测抗体识别c肽分子中游离羧基端表位。

9、在一个可选的实施方式中，所述质控线、c肽检测线和胰岛素检测线依次间隔设置在所述分析膜上。

10、在一个可选的实施方式中，所述样品处理垫的基膜材质包括聚酯纤维素膜；

11、在一个可选的实施方式中，所述标记结合垫的基膜材质包括玻璃纤维素膜；

12、在一个可选的实施方式中，所述分析膜包括的基膜材质包括硝酸纤维素膜；

13、在一个可选的实施方式中，所述吸水纸的基膜材质包括植物纤维。

14、在一个可选的实施方式中，所述时间分辨荧光微球的平均粒径为200nm-300nm；

15、在一个可选的实施方式中，所述第一质控物、第二质控物各自独立的选自鸡igy、羊抗鸡igy、生物素、亲和素、兔igg、羊抗兔igg、dnp-bsa、鼠抗dnp单克隆抗体中的至少一种；

16、在一个可选的实施方式中，所述胰岛素第一检测抗体包括鼠抗人胰岛素单克隆抗体，所述c肽第一检测抗体包括鼠抗人c肽单克隆抗体。

17、在一个可选的实施方式中，所述胰岛素第二检测抗体包括具有识别靶向胰岛素分子的二硫键空间构象表位功能的鼠抗人胰岛素单克隆抗体，且所述c肽第二检测抗体包括具有识别c肽分子中游离羧基端表位功能的鼠抗人c肽单克隆抗体；或者，所述胰岛素第一检测抗体包括具有识别靶向胰岛素分子的二硫键空间构象表位功能的鼠抗人胰岛素单克隆抗体，且所述c肽第一检测抗体包括具有识别c肽分子中游离羧基端表位功能的鼠抗人c肽单克隆抗体；

18、在一个可选的实施方式中，所述样品处理垫上含有抗红细胞抗体；

19、在一些可选的实施方式中，所述样品处理垫上还含有表面活性剂。

20、在一些可选的实施方式中，所述表面活性剂包括s9、吐温20、吐温80、brij35、tx305、np40中的至少一种。

21、本发明第二方面提供一种上述联合检测试剂纸条的制备方法，包括如下步骤：

22、采用样品垫工作液处理聚酯纤维素膜制得样品处理垫；

23、采用含有标记物标记的胰岛素第一检测抗体、标记物标记的c肽第一检测抗体和标记物标记的第一质控物的标记结合垫工作液处理玻璃纤维素膜制得标记结合垫；所述标记物包括时间分辨荧光微球；

24、在硝酸纤维素膜上，依次使用含第二质控物的溶液划出质控线、使用含胰岛素第二检测抗体的溶液划出胰岛素检测线、使用含c肽第二检测抗体的溶液划出c肽检测线，制得分析膜；所述质控线、c肽检测线和胰岛素检测线间隔设置；所述第二质控物可与所述标记物标记的第一质控物特异性结合；

25、将样品处理垫、标记结合垫、分析膜和吸水纸依次搭接设置在底板上，得到所述的联合检测试剂纸条。

26、在一个可选的实施方式中，所述胰岛素第二检测抗体识别靶向胰岛素分子的二硫键空间构象表位；所述c肽第二检测抗体识别c肽分子中游离羧基端表位；

27、或者，在另一个可选的实施方式中，所述胰岛素第一检测抗体识别胰岛素分子的二硫键空间构象表位，且所述c肽第一检测抗体识别c肽分子中游离羧基端表位；

28、在一个可选的实施方式中，所述样品垫工作液中包括抗红细胞抗体，所述样品垫工作液中抗红细胞抗体的质量浓度为0.1-0.2mg/ml；

29、在一个可选的实施方式中，所述样品垫工作液中还包括样品垫基础工作液，按质量百分比计，其组分包括：0.2-2%表面活性剂、5-20%糖和余量的摩尔浓度为0.01-0.08m的tris-hcl缓冲液；

30、在一个可选的实施方式中，所述含第二质控物的溶液中第二质控物的质量浓度为0.1-0.5mg/ml，所述含胰岛素第二检测抗体的溶液中胰岛素第二检测抗体的质量浓度为0.2-1mg/ml，所述含c肽第二检测抗体的溶液中c肽第二检测抗体的质量浓度为0.1-0.5mg/ml；

31、在一个可选的实施方式中，所述标记物标记的胰岛素第一检测抗体通过将胰岛素第一检测抗体偶联在时间分辨荧光微球上得到；在一个可选的实施方式中，所述标记物标记的胰岛素第一检测抗体存储在储存缓冲溶液；储存缓冲溶液，按质量百分比计，包括0.5-2% bsa、0.5-2%海藻糖和余量的pbs缓冲溶液；

32、在一个可选的实施方式中，所述标记物标记的c肽第一检测抗体通过将c肽第一检测抗体偶联在时间分辨荧光微球上得到；在一个可选的实施方式中，所述标记物标记的c肽第一检测抗体存储在储存缓冲溶液；储存缓冲溶液，按质量百分比计，包括0.5-2% bsa、0.5-2%海藻糖和余量的pbs缓冲溶液；

33、在一个可选的实施方式中，所述标记物标记的第一质控物通过将第一质控物偶联在时间分辨荧光微球上得到。在一个可选的实施方式中，所述标记物标记的第一质控物存储在储存缓冲溶液；储存缓冲溶液，按质量百分比计，包括0.5-2% bsa、0.5-2%海藻糖和余量的pbs缓冲溶液；

34、本发明第三方面提供一种联合检测试剂卡，所述联合检测试剂卡包括上述的联合检测试剂纸条或上述制备方法制备得到的联合检测试剂纸条。

35、本发明第四方面提供一种联合检测试剂盒，所述联合检测试剂盒包括上述的联合检测试剂纸条或上述的联合检测试剂卡；

36、所述联合检测试剂盒还包括样本稀释液；

37、所述样本稀释液包含缓冲液、表面活性剂、螯合剂；

38、所述表面活性剂包括s9、吐温20、吐温80、brij35、tx305、np40中的至少一种；

39、所述缓冲液包括pbs缓冲液。

40、本发明第四方面提供一种上述联合检测试剂纸条、上述制备方法制备得到的联合检测试剂纸条、上述联合检测试剂卡或上述联合检测试剂盒在定量检测待测样本中胰岛素、c肽含量的应用。

41、在一个可选的实施方式中，所述待测样本包括血液样本。

42、本发明与现有技术相比，具有以下优点：

43、本发明提供的联合检测试纸条，通过针对不同项目选用双抗体分别做包被抗体、标记抗体，实现多项目联合检测，减少检测样本的使用量，降低胰岛素原干扰，提高检测准确性，具有良好检测性能。

44、本发明提供的联合检测试纸条，通过选用靶向胰岛素分子二硫键空间构象特异表位的抗体及识别c 肽切割后暴露出的游离羧基端表位的抗体同时做包被抗体或标记抗体，即双抗体夹心法及荧光免疫层析串联法结合实现c肽、胰岛素多项目联合检测，减少检测样本的使用量，进一步降低胰岛素原干扰，进一步提高检测准确性，是有良好检测性能的胰岛素-c肽联合检测试纸条。

45、本发明采用时间分辨荧光免疫分析技术降低背景干扰；采用荧光免疫层析技术实现试剂常温储存，简化操作的目的。

46、本发明通过筛选特定平均粒径为200nm-300nm的时间分辨荧光微球实现缩短检测时间的目的 (5-8min)，以适用poct快速检测的需求，同时通过调试标记工艺降低位阻效应，实现拓宽项目线性范围、提升低端梯度进而提升试剂灵敏度。

47、本发明样本稀释液中采用edta-2na以及其用量降低全血抗凝剂测试影响，实现不同抗凝剂全血与血清测试结果一致性。

48、本发明采用调试样本稀释液表面活性剂来降低试剂对环境温度的敏感度，以适应不同应用场景需求。

49、本发明采用调试样品垫基础液中不同表面活性剂优化试剂的精密度性能。

50、本发明采用单条试剂条，多个包被检测线串联以及多抗体标记物联合使用的方式，实现单卡、单次混样、单次加样获得两个项目检测结果的目的，样本需求量较少，可适用于静脉血、末梢血等多种应用场景需求。且可即采即测，降低待测物不稳定导致的测试不准确风险。

51、本发明建立的胰岛素-c肽联合检测试剂卡稳定性较优，各项目临床测试与单项测试结果一致，且试剂可实现测试血清、血浆、不同抗凝剂静脉全血及微量血测试，满足多场景应用需求。

52、本发明建立的胰岛素-c肽联合检测试剂卡可实现反应5-8min完成测试，满足poct应用场景快速检测的需求。

53、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。