一种用于丹磺酰氯柱前衍生-HPLC检测牛磺酸的检测试剂、方法及其应用与流程

本发明涉及属于食品检测、生物医药分析、药物质量检测。具体涉及一种基于复合催化体系与专用稳定终止液的丹磺酰氯柱前衍生-hplc快速抗干扰检测复杂基质中牛磺酸的方法。

背景技术：

1、牛磺酸是人体重要的功能性氨基酸，广泛应用于功能食品、保健品、生物医药原料等领域，精准定量检测牛磺酸含量是产品质量控制的关键环节。目前行业主流检测方法为丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法，依据国标gb5009.169-2016执行。该传统方法采用单一碳酸钠碱性缓冲体系进行衍生催化，以单一强酸作为终止试剂，搭配乙腈-乙酸钠缓冲液色谱体系，仅适用于饮料、片剂等简单低干扰基质。现有技术存在诸多固有缺陷：其一，单一碳酸钠缓冲体系催化活性弱，衍生反应完全需要120min，前处理周期长，无法满足实验室高通量批量检测需求；其二，强酸终止体系易破坏dns-牛磺酸衍生物的磺酰胺键，造成衍生物降解，样品放置8h即出现显著峰面积漂移，检测窗口期极短，无法批量预处理与隔夜进样；其三，传统乙腈-乙酸钠流动相对氨基酸衍生物选择性差，在奶粉、血浆等高氨基酸复杂基质中，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸衍生物与目标峰重叠，分离度不足，定量偏高、假阳性风险大；其四，无针对性基质前处理工艺，对蛋白类生物样本、医药原料药检测回收率不稳定，通用性差。

2、因此，为了解决上述问题，需要一种衍生速度快、衍生物稳定性高、抗干扰能力强、多基质通用的牛磺酸hplc检测方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂、方法及其应用，解决传统方法耗时久、稳定性差、干扰严重、基质适配性差的问题。

2、本发明的一种用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂，包括用于柱前衍生反应的复合碱性催化缓冲液和终止液，所述复合碱性催化缓冲液原料包括碳酸钠、硼砂和三乙胺，所述终止液原料包括盐酸甲胺和冰乙酸；

3、进一步，所述复合碱性催化缓冲液中，按摩尔比，碳酸钠：硼砂：三乙胺=8-12：1：4-7；

4、进一步，按摩尔比，碳酸钠：硼砂：三乙胺=10：1：5.7。

5、本发明还公开一种用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂的制备方法，包括以下步骤:

6、s1，复合碱性催化缓冲液的制备：将碳酸钠、硼砂和三乙胺混合后加入超纯水溶解并定容，然后调节ph值至碱性，最后超声脱气；

7、s2，终止液的制备：将盐酸甲胺加超纯水溶解并定容，然后加入冰乙酸调节ph；

8、进一步，步骤s2中，加入冰乙酸调节ph为4.5-5.5。

9、本发明还公开一种基于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

10、a1，差异化样品前处理：针对奶粉、口服液、血浆、牛磺熊去氧胆酸原料药不同基质，采用对应的专属提取、除杂、ph调节工艺，获得澄清待测液；

11、a2，柱前衍生反应：取待测液依次加入复合碱性催化缓冲液、丹磺酰氯衍生液，恒温避光催化衍生，再加入复合终止液稳定终止反应，获得衍生待测液；

12、a3，高效液相色谱检测：采用甲醇-三氟乙酸水溶液离子对流动相体系，匹配c18或pfp色谱柱选择性分离，经紫外/荧光检测器检测，外标法定量得到样品中牛磺酸含量；

13、进一步，步骤a2中，向待测液中依次加入复合碱性催化缓冲液、丹磺酰氯衍生液，混匀后在温度为40-50℃的避光水浴恒温反应10-20min；反应结束后加入终止液，混匀静置；

14、进一步，步骤a1中，差异化样品前处理包括以下步骤：

15、（1）全氨基酸水解奶粉处理：将奶粉加入超纯水超声提取，采用亚铁氰化钾-乙酸锌复合体系沉淀蛋白与大分子杂质，然后经离心、定容、过滤，得到待测液；

16、（2）牛磺酸口服液处理：将口服液样品采用超纯水稀释定容，在高浓度样品稀释过程中加入复合碱性催化缓冲液稳定体系ph，过滤后得到待测液；

17、（3）血浆样品处理：采用三氯乙酸沉淀血浆蛋白，高速离心后取上清液，通过复合碱性催化缓冲液调节ph至7.0-8.0，过滤备用；

18、（4）牛磺熊去氧胆酸原料药处理：采用甲醇-水混合体系溶解样品，加入复合碱性催化缓冲液稳定体系，高速离心取上清，过滤得到待测液。

19、本发明还公开一种用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂在食品、保健品、人体血浆生物样本、医药中间体中牛磺酸定量检测中的应用。

20、本发明的有益效果： 本发明的一种用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂的制备方法，采用碳酸钠-硼砂-三乙胺三元复合催化体系，兼具碱性活化、ph缓冲稳定、亲核加速三重作用，大幅缩短衍生时间，反应时间可由120min缩短至15min以内，检测通量提升一倍以上，适配高通量质检场景；采用ph精准可控的盐酸甲胺-冰乙酸作为终止液，既可消耗残留衍生试剂，又能稳定衍生物的结构；同时采用甲醇-三氟乙酸离子作为对流动相体系，通过离子对流动相结合pfp柱选择性分离，彻底解决多种氨基酸衍生物共流出干扰问题，无假阳性，分离度满足定量要求；再结合复杂基质的前处理工艺，有效消除不同基质的基体效应，方法回收率稳定、重复性好，提高检测方法的通用性与准确度。

1.一种用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂，其特征在于：包括用于柱前衍生反应的复合碱性催化缓冲液和终止液，所述复合碱性催化缓冲液原料包括碳酸钠、硼砂和三乙胺，所述终止液原料包括盐酸甲胺和冰乙酸。

2.根据权利要求1所述的用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂，其特征在于：所述复合碱性催化缓冲液中，按摩尔比，碳酸钠：硼砂：三乙胺=8-12：1：4-7。

3.根据权利要求1所述的用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂，其特征在于：按摩尔比，碳酸钠：硼砂：三乙胺=10：1：5.7。

4.根据权利要求1所述的用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤:

5.根据权利要求4所述的用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤s2中，加入冰乙酸调节ph为4.5-5.5。

6.一种基于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的基于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的方法，其特征在于：步骤a2中，向待测液中依次加入复合碱性催化缓冲液、丹磺酰氯衍生液，混匀后在温度为40-50℃的避光水浴恒温反应10-20min；反应结束后加入终止液，混匀静置。

8.根据利要求6所述的基于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的方法，其特征在于：步骤a1中，差异化样品前处理包括以下步骤：

9.根据权利要求1所述的用于丹磺酰氯柱前衍生-hplc检测牛磺酸的检测试剂在食品、保健品、人体血浆生物样本、医药中间体中牛磺酸定量检测中的应用。