一种β2糖蛋白I抗原包被磁珠的制备方法及其应用与流程

本发明属于医学检测，具体涉及一种β2糖蛋白i抗原包被磁珠的制备方法及其应用。

背景技术：

1、抗磷脂抗体（apls）是一组以磷脂和/或磷脂结合蛋白为靶抗原的自身抗体总称。apls主要存在于抗磷脂综合征（aps）等自身免疫病患者中，是 aps 最具特征的实验室指标。apls 亦是血栓形成和病理妊娠的危险因素。同时，apls可见于恶性肿瘤、感染性疾病、某些药物使用后，甚至部分健康人群中亦可出现。其中狼疮抗凝物（la）、抗心磷脂（acl）抗体、抗β2 糖蛋白ⅰ（β2 gpⅰ）抗体作为aps分类标准中的实验室指标，目前临床上广泛应用，亦成为临床实验室最为常见的自身抗体检测项目之一。

2、β2 糖蛋白 i( β2 -glycoproein i, β2gp i)又称载脂蛋白 h, 是由 326个氨基酸组成的相对分子质量约为 50 kd的血浆单链糖蛋白, 由di到dv五个结构域组成，通过四个连接区相互连接。学界普遍认为，当β2gpi在血液中循环时会形成闭合构象—此时di和dv紧密结合形成环状结构。然而当其与暴露带负电荷磷脂的细胞或脂多糖（lps）结合时，这种闭合构象会被打开，形成di与dv间距超过100埃的伸长结构。根据该模型，抗di抗体的结合应仅发生在β2gpi与细胞或lps结合时，而在溶液中由于邻近dv导致di无法接触溶剂，因此不会发生结合。但suresh kumar等人采用单颗粒负染色电子显微镜（ns-em）和尺寸排阻色谱法（sec）对市售人血浆纯化β2gpi及hek293细胞重组β2gpi进行了分析。此外，还运用单分子福斯特共振能量转移技术（smfret）和微流控扩散尺寸分析法（mds）对重组β2gpi展开检测。结果表明，无论来源或纯化方法如何，β2gpi均呈现细长形态，且该形态可被识别di状态下β2gpi中g40-r43表位的典型抗磷脂抗体弱结合。研究还发现，当将β2gpi添加至人体样本时，其不会形成环状结构。

3、传统上，酶联免疫荧光法（elisa）等固相检测技术一直是抗β2 糖蛋白ⅰ（β2 gpⅰ）检测的主流手段。然而，随着临床实验室对β2 gpⅰ检测需求的持续增长，该领域亟需实现检测自动化这一重大技术空白，从而催生了新型检测方法的研发。为此，基于抗原包被微珠的半固相系统等替代方案应运而生。

4、专利cn 115856307 a公开了一种抗磷脂综合征相关蛋白包被磁珠的方法及其应用，该方法采用了生物素-链霉亲和素检测系统，该系统采用的纳米磁性材料制作成本较高，且链霉亲和素(sa)标记的纳米磁性材料在存储和使用过程中sa基团容易脱落可能存在稳定性的问题，影响检测结果的可靠性，并且生物素干扰是亲和素生物素检测系统检测中普遍存在的问题，采用亲和素生物素系统进行免疫检测时，如果待测样本中存如果存在高浓度的游离生物素，将与生物素化抗体竞争结合亲和素的结合位点，进而影响检测结果。

5、专利cn 115754272 a公开了包被磁珠的制备方法及其制备的磁珠与应用，该方法采用了通过研究的最佳变构条件，在不引入其他物质的情况下将变构过程和包被过程合二为一。但suresh kumar等人等离子体或极端溶液条件下的研究，挑战了先前认为在平衡状态下会在闭合和开放形式之间切换的观点。

6、专利cn 115754272 a公开了包被磁珠的制备方法及其制备的磁珠与应用，其在包被的同时能够实现蛋白的变构，该理论来源于文献《抗糖蛋白1抗体检测结果差异化的研究进展》（医疗装备2023年1月第36卷第02期），引用了agar等人的研究结果—在正常人血浆中纯化出来的为闭环状态，在高盐ph（1.15 m nacl，ph=11.5）的条件下，其由闭环状态变为鱼钩状构象；在低盐低ph（150 mm nacl，ph=3.4）条件下，其由鱼钩状重新变为环状构象。但通过查阅文献，2023年suresh kumar等人发表的《structuralanalyses of  -glycoprotein i: is there a circular conformation? 》，该文章中第1节研究结论—比较了采用不同方法制备和纯化的多种制剂。通过单颗粒负染色电子显微镜（ns-em）和尺寸排阻色谱（sec）分析了从人血浆中纯化市售制剂，以及在hek293细胞中制备重组。此外，还使用单分子forster共振能量转移（smfret）和微流体扩散尺寸分析（mds）对重组进行了分析。结果表明，无论来源和纯化方法如何，均呈细长形态，且典型抗磷脂抗体对中di区g40-r43表位的识别较弱。研究还显示，当β2gpi被加入血浆或置于极端溶液条件下时，不会转变为环状结构。这挑战了先前认为其在平衡状态下会切换闭合与开放形式的观点。这些发现阐明了的结构特性，对于理解抗磷脂血症（aps）的发病机制以及开发aps诊断和治疗手段具有重要意义，也从而推翻了专利cn 115754272 a的理论基础。

技术实现思路

1、综上所述，为克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种β2糖蛋白i抗原包被磁珠的制备方法及其应用，其通过控制包被过程中磁珠与抗原的在体系中的浓度，在合适的缓冲体系、盐离子及ph条件下，包被过程不板结，批间重复性好，特异性优。解决了常规的β2gpi抗原包被磁珠过程容易聚集，包被批间差大，检测试剂准确性差的技术问题。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种β2糖蛋白i抗原包被磁珠的制备方法,包括如下的步骤：

3、步骤1，对羧基磁珠进行化学活化处理；

4、步骤2，对活化后的羧基磁珠进行洗涤；

5、步骤3，将β2gpi抗原和经过洗涤的羧基磁珠进行混合偶联；

6、步骤4，对完成偶联的磁珠进行封闭处理；

7、步骤5，对封闭后的磁珠进行洗涤和超声分散；

8、步骤6，将分散后的磁珠重悬并置于特定温度下保存，即可得到β2gpi抗原偶联磁珠。

9、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下进一步改进：

10、进一步，步骤1具体为：选用粒径为 1.5μm 的羧基磁珠，将其与活化缓冲液混合进行活化；活化缓冲液为mes缓冲液、edc和nhs的混合液，其中mes缓冲液浓度为 50mm～100mm、ph为5.0～6.0，edc与nhs的浓度均为 8mg/ml～12mg/ml，活化过程控制温度在 22℃～28℃，时间为 30min；edc、nhs与羧基磁珠的质量比为 0.1:1～0.5:1。

11、其中，edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，nhs为n-羟基琥珀酰亚胺。

12、进一步，步骤2具体为：使用偶联缓冲液对经过活化的羧基磁珠洗涤2～3次，偶联缓冲液的参数为：nahco3浓度为100mm～500mm，氯化钠浓度为150mm～500mm，ph为7.5～8.5。

13、β2gpi抗原等电点在5.1～6.1之间，本发明偶联缓冲液的nahco3浓度为100mm～500mm，氯化钠浓度为150mm～500mm，ph为7.5～8.5。ph设定在7.5～8.5的范围之内，ph低会引起非特异性聚集，由于带正电的蛋白（等电点pi高于反应ph）会和带负电的颗粒或蛋白作用，从而引起非特异性吸附；ph高，比如ph 10 ，可以减小非特异性作用，但同时会抑制蛋白结合。

14、当溶液中的电解质浓度升高时，反离子（如、）会与固体表面带相反电荷的基团（如、）发生中和，从而减少分子间的静电排斥力。在蛋白质吸附过程中，盐离子可降低静电引力对非特异性结合的影响。随着电解质浓度增加，溶液中的离子会与蛋白质等大分子表面的同性电荷发生中和，促使分子间疏水作用增强。这种效应会降低蛋白质在固体表面的吸附能力，从而减少非特异性结合。因此可通过调整离子强度可优化反应条件，平衡特异性结合与非特异性结合的比例。本发明‌缓冲液体系中加入一定浓度的盐离子（氯化钠）合理控制电解质浓度可调节抗原抗体反应的强度，减少非特异性吸附。

15、进一步，步骤3具体为：按质量比 1：50～1：200 将β2gpi抗原和洗涤后的羧基磁珠混合，在 22℃～28℃的温度条件下进行偶联反应，反应时间为 1h～5h。

16、β2gpi抗原和磁珠的质量比为1：50～1：200，保证了有足够的磁珠与抗原结合，实现较为充分的包被效果，合适的比例能使抗体与磁珠之间达到较好的平衡，既避免了抗原过量而造成浪费，又防止磁珠过多导致结合不充分或空间位阻等问题，从而提高结合效率，有助于保持最终产品的性能稳定，使其在后续的免疫检测等应用中能发挥出理想的效果，在满足性能要求的前提下，也能对成本进行一定的控制。

17、进一步，步骤1的活化和步骤3的偶联过程中磁珠浓度均保持在2mg/ml～4mg/ml。

18、通过设定羧基磁珠活化偶联过程磁珠浓度为2mg/ml～4mg/ml调节活化过程羧基磁珠表面与活化剂结合量及偶联过程羧基磁珠与β2gpi抗原密度降低反应过程的非特异性聚集及有助于抗原结合位点的暴露。

19、进一步，步骤4具体为：将偶联后的磁珠放入含有1%甘氨酸和1% bsa的 tris缓冲液中，在 22℃～28℃的温度下进行封闭处理，封闭时间为 2h～8h。

20、进一步，步骤5具体为：先用tris缓冲液或磁珠保存缓冲液对封闭后的羧基磁珠洗涤 2～3 次，随后加入磁珠保存缓冲液，将磁珠置于冰浴环境中，使用超声细胞破碎仪超声2min，超声工作参数为：工作 2s，间歇 3s，功率60%；其中磁珠保存缓冲液由如下原料配制而成：50 mm hepes、150mm nacl、2%蔗糖、3%丙二醇、1% bsa、0.15%edta-2na、0.05%emulgenb66以及0.1%防腐剂，并且磁珠保存缓冲液的ph为7.4。

21、利用超声细胞破碎仪进行处理，有助于提高磁珠的分散性和均匀性，从而提升检测的重复性和一致性。

22、进一步，步骤6具体为：超声分散处理后的羧基磁珠再次加入磁珠保存缓冲液，并于2℃～8℃下重悬保存；其中磁珠保存缓冲液由如下原料配制而成：50 mm hepes、150mmnacl、2%蔗糖、3%丙二醇、1% bsa、0.15%edta-2na、0.05%emulgen b66以及0.1%防腐剂，并且磁珠保存缓冲液的ph为7.4。

23、本发明还提供上述制备方法制得的β2gpi抗原偶联磁珠在制备检测试剂盒中的应用。

24、本发明的有益效果是：

25、1.通过特定的反应条件和活化方式，降低非特异性聚集，保证了磁珠包被的稳定性和可靠性，提升了检测特异性和准确性。

26、2.利用超声细胞破碎仪进行处理，有助于提高磁珠的分散性和均匀性，从而提升检测的重复性和一致性。

27、3.方法工艺简单、易于操作，且能够获得性能优良的β2gpi抗原偶联磁珠，为抗β2糖蛋白i型抗体含量检测提供了有力支持，在疾病诊断、医学研究等领域具有广泛的应用前景和重要的实际意义。