用于消除生物素干扰的树枝状介孔纳米陷阱、其制备方法及应用

本发明属于免疫分析，具体而言属于一种用于消除免疫分析中游离生物素干扰的热响应分子印迹树枝状介孔纳米陷阱、制备方法及应用。

背景技术：

1、链霉亲和素-生物素体系因其超高亲和力（结合常数

kd值介于10-14到10-15 m之间），广泛用于免疫分析中的固相捕获、标记与信号放大，是现代自动化免疫分析平台中最重要的分子连接体系之一。然而，正是由于分析流程高度依赖于链霉亲和素与生物素之间的亲和相互作用，若样品中存在游离生物素将极易引发干扰。游离生物素会与生物素化分子竞争结合链霉亲和素，导致检测信号假性升高或降低，最终对临床诊断及治疗决策产生不良影响。而生物素作为一种水溶性维生素，广泛存在于食品、保健品及治疗性药物中，常用于治疗脱发、改善皮肤以及调节血糖。随着生物素摄入量的增加，人体循环系统中的游离生物素水平会显著升高，从而使基于链霉亲和素-生物素体系的免疫检测面临严重的干扰风险。鉴于这一隐患，美国食品药物监督管理局（fda）监管机构已多次就该问题发出安全警示，要求体外诊断体系评估并控制生物素干扰风险。

2、尽管如此，目前仍缺乏一种能够高效且广泛适用于各类场景的生物素干扰解决方案。现有的应对策略主要存在三大弊端：即生物素去除能力有限、兼容性较差，以及操作过程极易出错。主流的自动化免疫检测平台主要采用两种策略来解决这一问题：一是利用特异性抗体来去除游离生物素；二是预先将链霉亲和素磁珠与生物素化分子进行偶联，以此来减轻干扰。虽然生物素抗体能够特异性地捕获游离生物素，但每个抗体分子仅能以双价形式与生物素结合，这严重限制了其生物素去除能力，从而导致难以高效地去除样本中过量的游离生物素。此外，引入生物素抗体可能会干扰原有的检测化学反应及固相捕获过程，通常需要针对每一个具体检测项目进行试剂优化和性能验证，这使得该方法难以推广为适用于所有检测项目的通用解决方案。同样，预偶联策略也存在兼容性差的问题，当生物素化分子与链霉亲和素的亲和力弱于游离生物素时，预先偶联形成的复合物仍可能被置换，从而再次引发生物素干扰。对于其他免疫分析平台而言，由于缺乏专门的抗干扰策略，临床实验室往往不得不依赖昂贵的链霉亲和素磁珠来进行预处理以分离游离生物素。然而，这种做法不仅增加了检测成本和时间，还引入了额外的分离步骤，从而增加了发生错误的风险。因此，亟需发展一种兼具高容量捕获、广泛适用性、可与现有自动化免疫分析流程兼容且无需额外分离步骤的新型抗生物素干扰策略，从根本上解决游离生物素对免疫分析的干扰问题。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种用于消除免疫分析中游离生物素干扰的热响应分子印迹树枝状介孔纳米陷阱的制备方法，以实现对游离生物素的高容量、高选择性捕获，并在后续免疫分析过程中阻止所捕获的生物素竞争链霉亲和素与生物素化分子的结合。

2、本发明的第二目的在于提供由上述方法制得的热响应分子印迹树枝状介孔纳米陷阱。所述纳米陷阱采用生物素印迹树枝状介孔核心与热响应抗污外层的核-壳结构设计，在室温下可高效“捕获”游离生物素，在免疫分析温度下可将已捕获生物素“锁定”于孔道内部。

3、本发明的第三目的在于提供所述热响应分子印迹树枝状介孔纳米陷阱在基于链霉亲和素-生物素体系的免疫分析中的应用，尤其是在电化学发光免疫分析中的应用。

4、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

5、在一方面，本发明提供了一种分子印迹树枝状介孔纳米陷阱的制备方法，包括：以生物素作为印迹模板，在树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒中构建生物素印迹空腔，并在所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒表面接枝n-异丙基丙烯酰胺（n-isopropylacrylamide，nipam）和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，mpc）。

6、在一些实施方案中，所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒以十六烷基三甲基氯化铵为介孔模板剂、以原硅酸四乙酯为硅源制备。

7、在一些实施方案中，制备所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒时，同步引入作为印迹模板的生物素和功能单体，所述功能单体能够与生物素形成非共价相互作用，并与原硅酸四乙酯共水解缩聚，固定于二氧化硅骨架内，以形成能够特异性识别生物素的印迹位点。

8、在一些实施方案中，所述功能单体包括氨丙基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和三乙氧基-2-噻吩硅烷中的一种或多种，

9、在一些实施方案中，所述功能单体包括（0-4）：（0-4）：（0-5）摩尔比的氨丙基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和三乙氧基-2-噻吩硅烷，

10、在一些实施方案中，氨丙基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷和三乙氧基-2-噻吩硅烷的摩尔比为0：1：4。

11、在一些实施方案中，在制备所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒后，通过分步洗脱去除十六烷基三甲基氯化铵和生物素，得到带有生物素印迹空腔的树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒。

12、在一些实施方案中，在接枝 nipam 和 mpc 之前，采用硅烷偶联剂对所述树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒表面进行改性，以引入可聚合碳碳双键，

13、在一些实施方案中，所述硅烷偶联剂为3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯。

14、在一些实施方案中，所述制备方法，包括：

15、s101、将十六烷基三甲基氯化铵溶液、三乙醇胺与生物素加入水中搅拌溶解；随后加入含原硅酸四乙酯的有机相，并缓慢滴加含功能单体的有机相进行聚合，反应结束后分离并洗涤颗粒；

16、s102、将步骤s101所述颗粒分散于乙醇中，加入3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯，并于室温下反应，反应结束后分离并洗涤颗粒；

17、s103、将步骤s102所述颗粒分散于氯化钠甲醇溶液中去除作为孔模板的十六烷基三甲基氯化铵，再分散于洗脱液中去除作为印迹模板的生物素，结束后分离并洗涤颗粒；

18、s104、将步骤s103所得颗粒与n，n-亚甲基双丙烯酰胺、mpc和nipam共同分散于水中，在无氧环境下加入引发剂引发聚合，反应结束后洗涤并干燥，即得到所述树枝状介孔纳米陷阱。

19、在一些实施方案中，原硅酸四乙酯与所述功能单体的摩尔比例为（9-9.8）：（0.2-1），

20、在一些实施方案中，nipam与mpc的摩尔比例为（8.5-9.5）：（0.5-1.5）。

21、另一方面，本发明提供了上述制备方法获得的分子印迹树枝状介孔纳米陷阱。

22、在一些实施方案中，本发明提供了上述分子印迹树枝状介孔纳米陷阱消除免疫分析中游离生物素干扰的方法，包括：向待测样品中加入上述分子印迹树枝状介孔纳米陷阱，在室温下（如25°c）孵育使样品中的游离生物素进入所述树枝状介孔纳米陷阱并被捕获；随后通过基于链霉亲和素-生物素相互作用的免疫分析体系在高于30°c的温度（如37°c）或低于20°c的温度（如15°c）下对所述待测样品进行检测。

23、在一些实施方案中，所述待测样品为血清、血浆、全血或其它生物液体样品。

24、在一些实施方案中，所述免疫分析体系为化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析或其他依赖链霉亲和素-生物素体系进行固相捕获、标记或信号放大的分析体系。

25、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

26、（1）本发明将分子印迹树枝状介孔材料与热响应门控相结合，不仅能够在样品预处理阶段高效捕获游离生物素，而且能够在后续免疫分析阶段牢固锁定被捕获的生物素从而消除生物素干扰。

27、（2）本发明所采用的树枝状介孔结构可提供较大的比表面积和极高的识别位点，同时其孔径可有效阻挡核酸或蛋白质等大分子的进入，从而避免对免疫检测产生干扰。

28、（3）本发明在材料表面引入mpc，可明显抑制蛋白质吸附和蛋白冠形成，使材料在血清等复杂样品中具有极佳的兼容性。

29、（4）本发明所述树枝状介孔纳米陷阱可在不增加额外分离步骤的情况下直接与自动化免疫分析流程耦合，适用于化学发光、电化学发光及其它依赖链霉亲和素-生物素体系的检测方法，具有良好的临床转化潜力。