一种检测还原性谷胱甘肽的方法与流程

本发明属于分析化学和生物检测，具体涉及一种基于邻苯二甲醛（opa）柱前衍生化的高效液相色谱-荧光检测法，用于生物样品中还原性谷胱甘肽（gsh）的定量检测。

背景技术：

1、还原性谷胱甘肽（glutathione，gsh）是生物体内含量最丰富的低分子量三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，具有明显的抗氧化、延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等重要作用。在动物内脏组织中，还原性谷胱甘肽的含量水平与组织的氧化应激状态密切相关，准确测定内脏组织中gsh含量对于评估机体氧化还原状态、研究相关疾病的发病机制和药物干预效果具有重要的科学意义。

2、高效液相色谱法（hplc）是目前检测生物样品中gsh含量最常用的分析方法。由于gsh本身紫外吸收弱（摩尔吸光系数低）、缺乏天然荧光特性，直接检测灵敏度不足，通常需要采用柱前衍生化技术将gsh转化为具有高荧光响应的衍生物后再进行检测。

3、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，opa）是一种经典的柱前衍生化试剂，其分子中含有两个相邻的醛基，在碱性条件下能与含有伯氨基和巯基的化合物发生特异性反应，生成具有强荧光特性的异吲哚（isoindole）衍生物。opa衍生化反应具有反应速度快（秒级）、条件温和（室温）、荧光量子产率高、检测灵敏度高等优点，被广泛应用于氨基酸、多肽及谷胱甘肽等生物活性物质的检测。

4、目前，采用opa柱前衍生化法检测gsh时，现有技术普遍使用2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol，2-me）作为衍生化反应中的巯基添加剂。在该反应体系中，gsh提供伯氨基（α-氨基），2-巯基乙醇提供巯基（-sh），两者与opa共同形成三元异吲哚荧光产物。然而，2-巯基乙醇存在严重的技术缺陷：（1）剧毒性强。2-巯基乙醇为无色挥发性液体，具有强烈的刺激性恶臭气味。根据毒理学数据，2-巯基乙醇的大鼠经口ld50约为190 mg/kg，属于急性毒性类别2（剧毒）。长期接触可对实验人员的呼吸系统、皮肤和黏膜造成严重损害，其挥发性蒸气可对实验室环境造成持续污染。（2）操作危险性高。2-巯基乙醇的蒸气压高（2 mmhgat 20°c），易挥发，操作时即使在通风橱中也可能因泄漏导致实验室异味弥漫。其恶臭气味可引发实验人员头痛、恶心、呕吐等不适症状，严重影响实验操作的连续性和准确性。（3）试剂管制严格。由于2-巯基乙醇的剧毒性和环境危害性，其购买、运输、储存和使用均受到严格的化学品管制，需要提供特殊许可证明，增加了实验成本和操作复杂度。（4）替代试剂同样存在缺陷。部分研究尝试采用3-巯基丙酸（3-mpa）替代2-巯基乙醇，但3-巯基丙酸的急性毒性更强（大鼠经口ld50约96 mg/kg），且具有强腐蚀性（皮肤腐蚀类别1b），对眼部可造成不可逆损伤，安全性更差。n-乙酰-l-半胱氨酸（nac）虽然毒性较低，但其分子结构同时含有氨基和巯基，在opa衍生化体系中可能与gsh产生竞争反应，干扰检测的特异性和准确性。

5、2-氨基乙醇（乙醇胺，ethanolamine）是一种常见的有机化合物，室温下为无色透明的粘稠液体，与水、乙醇和丙酮等能混溶，具有弱碱性。文献报道，opa与2-氨基乙醇可发生快速反应，生成具有荧光特性的衍生物，该反应已被应用于氨基酸、生物胺等化合物的检测。

6、然而，现有技术中opa与2-氨基乙醇的反应均遵循"待测物提供氨基、2-氨基乙醇作为氨基组分参与或作为色谱分离对象"的传统路径。例如，在氨基酸分析中，opa与氨基酸的氨基及巯基添加剂（如2-巯基乙醇或3-巯基丙酸）反应；在生物胺检测中，opa与生物胺的氨基及巯基添加剂反应。在这些应用中，2-氨基乙醇的角色是作为待测分析物（如乙醇胺本身的检测）或作为色谱行为调节剂，而非作为替代巯基添加剂的反应组分。

7、至关重要的是，利用2-氨基乙醇替代2-巯基乙醇作为opa衍生化反应中的氨基供体，使gsh的巯基参与反应形成三元荧光产物，从而实现gsh检测的技术方案，目前尚未见任何文献或专利报道。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种以2-氨基乙醇替代2-巯基乙醇作为opa柱前衍生化反应中氨基供体的新方法，通过反应路径的创新设计（gsh提供巯基、2-氨基乙醇提供氨基），实现对还原性谷胱甘肽的安全、灵敏、准确检测，从根本上解决现有技术中剧毒试剂危害实验人员健康和实验室环境的技术难题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种检测还原性谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：

4、（1）样品预处理：取生物样品（内脏组织）20mg-0.2g，加入1-10ml蛋白沉淀剂，于低温条件下研磨破碎或涡旋混匀，离心后收集上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；

5、（2）邻苯二甲醛（opa）衍生液的配制（试剂a）：精密称取opa适量，加甲醇溶解，配制成浓度为1-5mg/ml的opa甲醇溶液，备用；

6、（3）2-氨基乙醇-硼砂缓冲液的配制（试剂b）：精密称取十水合四硼酸钠适量，加超纯水溶解，配制成0.05-0.2 mol/l的硼砂缓冲液；精密量取2-氨基乙醇适量，加入上述硼砂缓冲液中，使2-氨基乙醇的终浓度为5-20μl/ml，混匀，备用；

7、（4）衍生化反应：精密量取供试品溶液100-500 μl，置于1.5 ml棕色离心管中，加入200-500 μl试剂b（2-氨基乙醇-硼砂缓冲液），涡旋混匀5 s，立即加入100-300 μl试剂a（opa衍生液），涡旋混匀10 s，室温（25°c）避光反应2-15分钟，得到衍生化供试品溶液；

8、（5）标准曲线制备：取还原性谷胱甘肽对照品配制系列浓度的对照品溶液，按步骤（4）进行衍生化反应，得到衍生化对照品溶液；

9、（6）色谱检测：将步骤（4）所得衍生化供试品溶液和步骤（5）所得衍生化对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，采用荧光检测器检测，以保留时间定性，以峰面积定量，根据标准曲线计算供试品溶液中还原性谷胱甘肽的含量。

10、进一步地，样品预处理为取内脏组织0.1g，加入5ml的蛋白沉淀剂，于低温研磨仪破碎，离心，收集上清液，经微孔滤膜过滤，得到供试品预处理溶液。

11、进一步地，步骤（2）中所述每毫升甲醇中加入2mg邻苯二甲醛试剂，摇匀，即得opa衍生液。

12、进一步地，步骤（3）中所述每毫升0.1mol/l的十水合四硼酸钠溶液中加入10ul的2-氨基乙醇试剂，即得2-氨基乙醇溶液。

13、进一步地，步骤（3）中硼砂缓冲液的ph值为9.0-9.5。

14、进一步地，步骤（4）中样品衍生剂的顺序为，样品预处理好后，先加2-氨基乙醇溶液200μl，再加opa衍生液500μl进行衍生。

15、进一步地，步骤（5）中所述系列浓度的对照品溶液包含4～6个浓度点，浓度范围为3～90μg/ml；以对照品浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。

16、进一步地，步骤（6）中所述高效液相色谱的条件为：色谱柱为c18色谱柱；流动相为甲醇（a）与0.05mol/l的乙酸钠（b），采用等度洗脱；流速0.8～1.2 ml/min；柱温25～35℃；荧光检测器的激发波长为330～345 nm，发射波长为420～460 nm；进样量为5～20 μl。

17、进一步地，步骤（6）中流动相的洗脱梯度为：0-2min，90-85%b；2-6min，85-83%b；6-7min，83%b；7-9min，83-90%b；9-15min，10%b；16-20min，90%b。

18、进一步地，步骤（6）中c18色谱柱为agilent 5 tc-c18，规格为250mm×4.6mm，5μm。

19、进一步地，步骤（6）中流速为1.0 ml/min；柱温为30℃；荧光检测器的激发波长为340nm；发射波长为450nm；进样量为10 μl。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、（1）安全性显著提高：本发明以低毒性的2-氨基乙醇替代高毒性的2-巯基乙醇。2-氨基乙醇的大鼠经口ld50约为1720 mg/kg，属于急性毒性类别4（低毒），毒性仅为2-巯基乙醇的约1/9。2-氨基乙醇无强烈刺激性气味，挥发性低，操作过程中不会对实验人员造成健康危害，也不会污染实验室环境，体现了绿色分析化学的理念。

22、（2）检测效果优良：采用2-氨基乙醇作为氨基供体，gsh与opa仍能快速反应生成稳定的荧光衍生物。本发明方法线性关系良好（r>0.999），灵敏度高（检出限可达0.05 μg/ml），回收率和精密度均满足生物样品分析的要求，与使用2-巯基乙醇的传统方法相比检测性能相当。

23、（3）操作简便、成本低廉：2-氨基乙醇为常见化工原料，价格低廉、来源广泛，不受特殊管制，购买和使用方便。试剂配制简单，无需特殊设备，适合常规实验室推广。

24、（4）方法稳定可靠：通过"分别配制、分开保存、依次加入"的试剂管理策略，有效避免了opa与2-氨基乙醇预先混合导致的试剂失效问题。衍生化产物在15小时内稳定，方法重现性好。