一种测定尿液中8-异前列腺素F2α含量的试剂盒及其制备方法与流程

本公开涉及免疫检测领域，具体涉及一种测定尿液中8-异前列腺素f2α含量的试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、衰老氧化应激是机体在病理或外界刺激下，活性氧（reactive oxygen species，ros）等自由基的生成速率超出自身抗氧化防御系统的清除能力，导致氧化还原平衡失调的病理状态。由于体内超氧阴离子、羟自由基等高活性氧物种半衰期极短、浓度极低，无法直接对其进行原位定量检测。目前临床上通常通过检测dna氧化产物（如8-ohdg）、蛋白质羰基化产物或脂质过氧化终末产物来间接反映体内氧化损伤水平。其中，细胞膜磷脂中的花生四烯酸经自由基非酶促过氧化途径生成的f2-异前列腺素（f2-isoprostanes），尤其是8-异前列腺素f2α（8-iso-pgf2α），因不依赖环氧化酶途径合成、在体液中长期稳定存在，且与氧化应激程度呈良好量效关系，被广泛公认为评价体内氧化应激损伤的“金标准”生物标志物。尿液中8-iso-pgf2α的无创采集及稳定表达特性，使其成为氧化应激相关疾病筛查及流行病学研究中的重要检测指标。

2、目前尿液中8-异前列腺素f2α的定量分析方法主要有酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，elisa）、气相色谱-质谱联用（gc-ms）及液相色谱-串联质谱法（lc-ms/ms）。lc-ms/ms法虽具较高的灵敏度和选择性，但因尿液基质复杂、共存结构类似物多，通常需经固相萃取或液液萃取净化浓缩等繁琐的前处理步骤，操作繁复且易引入人为误差，同时还存在基质效应干扰定量结果。市售elisa试剂盒操作相对简便，但易受抗体交叉反应影响，灵敏度及批间重现性欠佳，与质谱法检测结果一致性较差。

3、化学发光免疫检测技术（chemiluminescence immunoassay，clia）结合了高灵敏度的化学发光测定与高特异性的免疫反应，具有灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定等优点。将磁微粒分离技术与化学发光法相结合，利用磁微粒的大比表面积和均一性，可进一步提高反应效率和特异性，降低非特异性结合，实现自动化检测。

4、因此，亟需开发一种灵敏度高、特异性好、操作简便快捷且适合临床自动化检测的尿液8-异前列腺素f2α定量方法。

技术实现思路

1、本公开旨在提供一种快速、准确、便捷测定尿液中8-异前列腺素f2α含量的试剂盒及其制备方法。

2、为实现上述技术目的，本公开采取的技术方案为：

3、第一方面，本公开提供一种用于检测尿液中8-异前列腺素f2α含量的试剂盒，包括链霉亲和素磁珠标记的抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的8-异前列腺素f2α抗原、分析缓冲液、校准品及质控品。

4、在一些实施方案中，所述链霉亲和素磁珠标记的抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体的制备方法为：

5、将抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体溶于pbs缓冲液；

6、将所述抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体与生物素按一定比例混合，室温避光反应30分钟；

7、通过透析或脱盐柱去除游离生物素，得到生物素标记的抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体；

8、取商品化链霉亲和素标记的顺磁纳米颗粒，充分振荡混匀后，磁分离洗涤；

9、将上述制备的生物素标记的抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体加入洗涤后的链霉亲和素磁珠中，混匀，孵育，使生物素标记抗体与链霉亲和素磁珠充分结合；

10、孵育结束后，加入含0.1% bsa的磷酸盐缓冲液重悬磁珠，用含0.1% bsa的磷酸盐缓冲液将连接后的磁珠重悬至所需浓度，得到所述链霉亲和素磁珠标记的抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体。

11、在优选的实施方案中，所述pbs缓冲液的ph为7.4。

12、在优选的实施方案中，所述抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体的浓度为1 mg/ml。

13、在一些实施方案中，所述抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体与生物素的摩尔比为1:20。

14、在一些实施方案中，所述孵育时间为30分钟。

15、在一些实施方案中，所述碱性磷酸酶标记的8-异前列腺素f2α抗原的制备方法为：

16、将碱性磷酸酶加入活化剂进行活化；

17、将活化的碱性磷酸酶与8-异前列腺素f2α抗原按一定比例混合，室温反应2h，过滤层析纯化酶标抗原；

18、用含1% bsa的磷酸盐缓冲液稀释至工作浓度，得到所述碱性磷酸酶标记的8-异前列腺素f2α抗原。

19、在一些实施方案中，将活化的碱性磷酸酶与8-异前列腺素f2α抗原按1:1.2的摩尔比混合。

20、在一些实施方案中，所述分析缓冲液包含50 mm tris、0.15 m nacl、0.1% tween-20、1% bsa和10%小牛血清。

21、在一些实施方案中，制备所述分析缓冲液包括以下步骤：

22、用含有tris的缓冲液制备，用滤膜过滤后制备得到。

23、在优选的实施方案中，所述滤膜的孔径为0.22 μm。

24、在一些实施方案中，用校准品缓冲液将8-异前列腺素f2α标准品梯度稀释至系列浓度，分装冻干或液体保存，作为校准品和质控品。

25、第二方面，本公开提供了本公开第一方面所述的试剂盒的应用，所述试剂盒用于尿液中8-异前列腺素f2α含量的检测。

26、本公开具有如下优点：

27、与现有技术相比，本公开提供了一种测定灵敏度高、结果准确、操作简便且抗干扰能力强的用于检测尿液中8-异前列腺素f2α含量的试剂盒及其制备方法，为临床及科研领域提供一种更优的检测方案。

1.一种用于检测尿液中8-异前列腺素f2α含量的试剂盒，其特征在于，包括链霉亲和素磁珠标记的抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的8-异前列腺素f2α抗原、分析缓冲液、校准品及质控品。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁珠标记的抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体的制备方法为：

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗8-异前列腺素f2α多克隆抗体与生物素的摩尔比为1:20。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述孵育时间为30分钟。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的8-异前列腺素f2α抗原的制备方法为：

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，将活化的碱性磷酸酶与8-异前列腺素f2α抗原按1:1.2的摩尔比混合。

7. 根据权利要求1-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液包含50 mmtris、0.15 m nacl、0.1% tween-20、1% bsa和10%小牛血清。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，制备所述分析缓冲液包括以下步骤：

9.根据权利要求1-8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，用校准品缓冲液将8-异前列腺素f2α标准品梯度稀释至系列浓度，分装冻干或液体保存，作为校准品和质控品。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于尿液中8-异前列腺素f2α含量的检测。