一种人参皂苷分析及异构体鉴别方法

本发明涉及天然产物分析化学，具体涉及一种人参皂苷分析及异构体鉴别方法。

背景技术：

1、人参皂苷（ginsenosides）是人参属植物（panax spp.）的主要生物活性成分，具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、神经保护及心血管保护等作用。其中，达玛烷型人参皂苷（dammarane-type ginsenosides,dtgs）占人参皂苷的绝大多数，根据苷元结构可分为原人参二醇（protopanaxadiol,ppd）型、原人参三醇（protopanaxatriol,ppt）型、奥克梯隆醇（ocotillol,ot）型和c-17侧链变异（c-17 side-chain varied,c17scv）型四大类。

2、人参皂苷具有高度的结构多样性，存在多种异构体类型，包括：（1）苷元类型异构体；（2）糖基类型异构体（葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等）；（3）糖苷键连接位置异构体（1→2、1→6等）；（4）糖基化位点异构体（c-3、c-6、c-20、c-28位）；（5）双键位置异构体（δ20(21)vsδ20(22)）；以及（6）手性中心构型异构体（r/s构型，尤其是c-20位）。这些异构体在色谱上常常共流出，质谱碎片高度相似，给准确鉴定带来了极大挑战。

3、液相色谱-串联质谱（lc-ms/ms）是目前人参皂苷分析的主要工具。近年来，离子淌度质谱（ion mobility spectrometry-mass spectrometry,ims-ms）通过引入碰撞截面（collision cross section,ccs）作为第三维度信息，显著提升了异构体鉴别能力。waters公司开发的循环离子淌度质谱（cyclic ion mobility spectrometry-massspectrometry,cims-ms）通过延长离子分离路径，实现了远超常规线性离子淌度的分辨率，并支持imsn实验——即对特定离子进行逐步选择、碎裂和再分离。

4、然而，现有技术中常规线性离子淌度（如synapt g2-si、vion im-qtof等）对ccs值极为接近的人参皂苷r/s构型异构体（如20(r)-rg2与20(s)-rg2，ccs差值仅约3-4å²）无法实现基线分离；对于c-20位r/s构型异构体和c-17侧链双键位置异构体（δ20(21)vsδ20(22)），不同碰撞能量下的ms/ms谱图几乎完全相同，仅依靠质谱信息无法区分。差分离子淌度质谱（dms-ms/ms）虽可通过逐步调节气体改性剂浓度实现部分异构体的空间分离，但其分离机制依赖于补偿电压的调节，对r/s构型异构体的区分能力仍然有限。此外，现有技术公开电子诱导裂解（eid）质谱方法虽可区分部分人参皂苷异构体，但其对仪器配置要求特殊，且无法普适性地解决c-20位手性中心的构型判定问题。已建立的ginmil等人参皂苷多维信息库虽然包含ccs预测值，但仅针对完整分子，且预测值与实验值存在显著偏差。具体而言，ginmil基于vion离子淌度高分辨lc-ms平台，通过机器学习（梯度提升机模型）预测保留时间和碰撞截面，涵盖了579种人参皂苷的四维结构信息（m/z、分子式、保留时间、ccs及部分ms/ms碎片），将异构体识别准确率提升至约88%。然而，该数据库的核心在于完整分子的ccs预测，并非针对苷元碎片离子；且预测值与实验实测值之间存在显著偏差，对于r/s构型异构体和双键位置异构体，其预测ccs值无法可靠区分。

5、更重要的是，现有技术尚未建立基于苷元碎片离子的特征ccs库，无法通过ccs信息推断r/s构型。此外，cims多圈分离虽可提高分辨率，但会出现“wrap-around”效应（快离子追上慢离子）。该效应的成因在于：随着循环次数增加，淌度较快的离子在环形路径中逐渐追赶上前一圈的慢离子，导致不同循环圈的离子在到达检测器时发生时间上的重叠。这一效应限制了多圈分离的有效圈数，是cims应用中公认的技术难题。目前尚无针对人参皂苷异构体分离中该问题的有效解决方案。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种人参皂苷分析及异构体鉴别方法，以解决现有技术中人参皂苷异构体分离分辨率不足、r/s构型无法通过质谱区分、以及缺乏系统化鉴定策略的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种人参皂苷分析及异构体鉴别方法，包括以下步骤：

4、步骤一：采用循环离子淌度质谱（cims-ms）对含有人参皂苷的样品进行多圈离子淌度分离；

5、步骤二：当多圈分离过程中出现快离子追上慢离子的环绕效应时，采用“top-and-tail”imsn策略，选择性喷射目标离子后继续循环分离，以实现人参皂苷异构体的完全分离。

6、步骤三：通过优化离子阱区碰撞能量使人参皂苷在离子源后产生苷元碎片离子，测定所述苷元碎片离子的碰撞截面（ccs）值；

7、步骤四：将步骤三测得的苷元碎片离子ccs值与同源苷元特征ccs库进行比对，所述同源苷元特征ccs库包含不同构型（r型和s型）的达玛烷型人参皂苷苷元碎片离子的特征ccs值，从而确定人参皂苷的r/s构型；

8、步骤五：整合色谱保留时间、精确质量数、串联质谱（ms/ms）碎片离子信息（包括质荷比m/z）、完整分子ccs值以及苷元碎片ccs值，对人参皂苷进行多维鉴定。

9、优选地，步骤一中所述多圈离子淌度分离的循环次数为15~45次，离子淌度分离参数为：每仓推送次数为2，仓数为200，循环行波速度为375m/s，行波静态高度为15v。

10、优选地，步骤三中所述离子阱区碰撞能量为80~120ev，优选110ev，所述苷元碎片离子包括：原人参二醇（ppd）型苷元离子质荷比（m/z）459.4；原人参三醇（ppt）型苷元离子m/z 475.4；

11、所述c-17侧链变异型苷元碎片离子依据c-17侧链修饰类型的不同呈现差异化断裂行为。对于c-17侧链羟基重排型人参皂苷，如伪人参皂苷rg2(e)，其苷元离子m/z 475.4在碰撞诱导解离过程中进一步丢失c3h6o产生m/z 417.3碎片，且该类型不产生m/z 391.3碎片；对于c-17侧链脱水成烯型人参皂苷，如人参皂苷f4，其苷元离子为m/z 457.4。上述两种c17scv亚型可通过是否存在m/z 417.3碎片以及苷元离子质量差异进行区分，并进一步结合完整分子ccs值判定δ20(22)与δ20(21)双键位置。

12、优选地，步骤四中所述同源苷元特征ccs库中，ppd型苷元碎片离子的特征ccs值为：s构型224.0-225.0å2，r构型226.0-228.0å2；ppt型苷元碎片离子的特征ccs值为：s构型225.0-227.0å2，r构型227.5-229.0å2。

13、优选地，步骤五中所述ms/ms碎片离子信息用于区分以下异构体类型：

14、苷元类型异构体，依据特征苷元离子m/z进行区分；

15、糖类型异构体，依据特征糖链碎片离子m/z 205.07、221.07或191.05进行区分；

16、糖苷键连接位置异构体，依据特征二糖碎片离子m/z 323.08或293.08进行区分；

17、糖基化位点异构体，依据特征碎片离子的相对丰度比进行区分，糖基化位点异构体的鉴别基于相同碰撞能量下特征碎片离子对相对丰度比的系统性差异；以原人参二醇型人参皂苷为例，c-3位糖基化的人参皂苷ck与c-20位糖基化的20(s)-人参皂苷rh2在40ev碰撞能量下均产生m/z 459.4苷元离子与m/z621.4脱糖碎片离子，二者m/z 459.4与m/z621.4的丰度比分别为1.6与0.51；20(s)-人参皂苷rh2在60ev下进一步产生m/z 537.3特征碎片而人参皂苷ck无此碎片；以原人参三醇型人参皂苷为例，c-20位糖基化的人参皂苷f1相较于c-6位糖基化的人参皂苷rh1，其c-20位糖苷键断裂碎片丰度显著偏高；糖苷键断裂敏感性遵循c-20位高于c-6位、c-6位高于c-3位的顺序，该顺序在40ev碰撞能量下已呈现可辨识差异；对于多位点糖基化模式，20(s)-人参皂苷rg3的c-3位二糖链在40ev下保持完整而人参皂苷f2的c-20位单糖键已断裂，二者m/z 621.4与m/z 783.5的丰度比存在显著差异，且随碰撞能量升高呈现差异化演变规律；通过测定上述特征碎片离子对的相对丰度比及高碰撞能量下的特征碎片，可实现c-3、c-6、c-20位糖基化位点异构体的鉴别；

18、双键位置异构体，依据完整分子的ccs值差异进行区分，其中δ20(22)双键构型的ccs值大于δ20(21)双键构型。

19、优选地，所述人参皂苷为达玛烷型人参皂苷，包括ppd型、ppt型、ot型和c17scv型。

20、优选地，步骤一之前还包括色谱分离步骤，采用超高效液相色谱（uplc）进行分离，色谱柱为acquity hss t3柱（1.8μm,100×2.1mm），柱温40℃，流动相为含0.1%甲酸的水溶液（a相）和乙腈（b相），流速0.3ml/min，梯度洗脱程序为：0–1.5min 95%a，1.5–3min 95→75%a，3–6min 75→73%a，6–9min 73→67.5%a，9–12min 67.5→64%a，12–18min 64→53%a，18–22min 53→0%a，22–24min 0%a，24–25min 0→95%a，25–29min 95%a平衡。

21、优选地，所述cims-ms在负离子模式下操作，毛细管电压2.0kv，锥孔电压40v，源温度120℃，脱溶剂温度400℃，锥孔气流50l/h，脱溶剂气流800l/h，氮气作为碰撞气和离子淌度气，数据采集范围m/z50–2000。

22、优选地，所述方法用于人参属植物提取物中人参皂苷的系统鉴定，可同时鉴定ppd型、ppt型、ot型、c17scv型及齐墩果酸型人参皂苷及其异构体。

23、本发明还提供一种同源苷元特征ccs库的构建方法，包括以下步骤：

24、步骤一：选取已知r/s构型的达玛烷型人参皂苷标准品；

25、步骤二：采用cims-ms，在优化离子阱区碰撞能量条件下产生苷元碎片离子；

26、步骤三：测定各标准品产生的苷元碎片离子的ccs值，建立不同构型（r型和s型）、不同苷元类型（ppd型和ppt型）的苷元碎片离子特征ccs数据库；

27、步骤四：验证所述特征ccs值的稳定性：日内精密度相对标准偏差（rsd）＜0.1%，日间精密度rsd＜0.3%，跨仪器相对偏差＜3.5%，且在不同化合物来源的同一类型苷元碎片中保持稳定。

28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

29、1、本发明采用cims多圈分离技术，成功实现了常规线性离子淌度无法分离的r/s构型异构体（如20(r)-rg2与20(s)-rg2）的基线分离；同时，通过“top-and-tail”imsn策略有效解决了多圈分离中的wrap-around效应，避免了快离子追上慢离子导致的峰重叠问题；相比于现有技术中ginmil数据库仅能实现约88%的异构体识别准确率，且对r/s构型异构体和双键位置异构体的区分能力有限，本发明通过cims多圈分离与“top-and-tail”策略的结合，实现了对上述难分离异构体的基线分离，显著提升了鉴定准确性；

30、2、本发明提出“同源苷元特征ccs库”策略：通过在高能碰撞（110ev）下产生苷元碎片离子，测定其ccs值；实验发现，ppd型苷元的s构型ccs约为224.4å2（实验平均值，范围224.0-225.0å2）、r构型约为226.2å2（实验平均值，范围226.0-228.0å2）；ppt型苷元的s构型ccs约为225.8å2（实验平均值，范围225.0-227.0å2）、r构型约为228.2å2（实验平均值，范围227.5-229.0å2）；该ccs值在不同来源的同一类型苷元中保持稳定（rsd＜0.5%），可作为“分子指纹”用于推断完整人参皂苷的r/s构型，解决了ms/ms无法区分r/s构型异构体的长期技术难题；实验验证表明，该特征ccs值具有良好的跨化合物稳定性：来自不同人参皂苷标准品（如20(s)-rg3、f2、rd、rc、rb2、rb3等）的ppd型苷元碎片，其ccs值均在224.4±0.3å2范围内（rsd＜0.5%）；来自不同ppt型标准品（如f1、20(s)-rh1、f5、20(s)-rg2等）的ppt型苷元碎片，其ccs值均在225.8±0.3å2范围内（rsd＜0.5%），证明了该特征ccs值作为“分子指纹”的可靠性和普适性；

31、3、本发明整合lc保留时间、精确质量数、ms/ms碎片、完整分子ccs值、苷元碎片ccs值五维信息，构建了从粗提物到单体鉴定的完整策略；该方法已成功从人参提取物中鉴定101种人参皂苷，涵盖ppd、ppt、ot、c17scv及齐墩果酸型，显著提高了鉴定准确性和可靠性；

32、4、本发明中ccs测定具有极高的精密度（日内rsd＜0.1%，日间rsd＜0.3%），且在不同实验室、不同仪器间具有良好的可比性（相对偏差＜3.5%）；基质效应评估表明，人参提取基质对ccs值影响可忽略，方法适用于复杂生物样品分析。