一种艾叶产地的鉴别方法与流程

本发明属于物种鉴别，具体涉及一种艾叶产地的鉴别方法。

背景技术：

1、艾叶作为菊科植物艾（artemisia argyi levl. et vant.）的干燥叶，在我国拥有悠久的应用历史与多个传统产地及习用品系，如浙江宁波的海艾、湖北蕲春的蕲艾以及河南南阳的宛艾。由于不同产地在土壤、温度、降水、日照、海拔及栽培方式等生态环境上的显著差异，这些外界因素会深刻影响植物的初生代谢和次生代谢过程，进而导致艾叶中挥发性成分、黄酮、香豆素、苯丙素、氨基酸、有机酸及脂肪酸等化学物质的种类和相对含量产生明显差异。这种化学成分的异质性不仅直接关系到艾叶的药效物质基础，还会进一步影响其稳定性及最终的临床使用效果。

2、然而，现有的产地鉴别手段主要依赖于产地证明、外观性状、气味以及经验性比较，部分方法虽采用挥发油或单一指标成分的含量测定，或仅利用少量色谱峰进行相似度比较，但这些传统方法均存在明显局限性：产地证明易受流通环节干扰，感官评价受人员经验和样品状态影响较大，而单一成分又极易受到采收期、贮藏条件和加工方式的影响，难以全面反映艾叶的整体代谢状态。

3、现有技术方案通常采用液相色谱技术检测艾叶提取物，再以单个或少数已知成分进行定性或定量比较，但此类方案在实际应用中面临诸多技术瓶颈：首先，检测覆盖面有限，无法同时有效利用初生和次生代谢物的综合信息；其次，缺乏经过严格统计检验的产地差异标志物组合，导致判定结果的可重复性不足；再次，未对仪器漂移、批次效应及内标进行系统控制，难以适用于多批次样品的稳定检测；最后，针对海艾、蕲艾、宛艾相近品系，缺少可操作的两两区分指标。因此，面对当前艾叶产地鉴别技术的诸多不足，迫切需要建立一种以整体代谢指纹和统计筛选标志物为基础，且具备可量化与可复现特性的新型艾叶产地鉴别方法，从而为艾叶的质量控制与精准溯源提供更为科学、全面的技术支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种艾叶产地鉴别方法，解决现有艾叶产地鉴别主观性强、指标单一、重复性不足以及难以区分相近产地品系的问题，提供一种检测覆盖面广、统计依据明确、适于批量质量控制的鉴别方法。

2、本发明的上述目的通过如下方案方式实现：

3、一种艾叶产地的鉴别方法，所述方法包括如下步骤：

4、s1、制备待测艾叶样品的供试品溶液：将待测艾叶样品粉碎，称取艾叶粉末，按料液比 1:8～1:15（g/ml）加入含内标的提取溶剂，涡旋混合 20～60 s，加入研磨珠后以 45～65 hz 研磨 30～90 s，室温超声提取 10～20 min，于 2～8 ℃、10000～15000 r/min离心 8～12 min，取上清液经 0.1-0.5 μm 滤膜过滤，得到供试品溶液；

5、其中，所述提取溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的至少一种；所述内标为 2-氯-l-苯丙氨酸，所述内标在所述提取溶剂中的浓度为 0.5～5 μg/ml；

6、s2、采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪分别在正离子模式和负离子模式下检测所述供试品溶液；

7、超高效液相色谱条件包括：色谱柱为反相 c18 柱，流动相由酸化水相和酸化有机相组成并采用梯度洗脱，柱温为 25～50 ℃，流速为 0.1～0.6 ml/min，进样量为 0.5～5μl；

8、高分辨质谱条件包括：电喷雾离子源，正离子模式和负离子模式的扫描范围均为m/z 50～1200，毛细管电压的绝对值为 2.5～3.5 kv，锥孔电压为 30～50 v，碰撞能量为20～45 ev；

9、并且在所述检测过程中每 8～12 个样品插入 1 个质量控制样品，所述质量控制样品由各供试品溶液等体积混合得到，以所述质量控制样品对保留时间和峰强度进行漂移校正；

10、s3、按照保留时间偏差不超过 ±0.2 min、准分子离子峰的精确质量数偏差不超过 ±5 ppm、且二级碎片离子与对照品或标准数据库中的二级碎片一致的三重判据，鉴定所述待测艾叶样品中是否存在由下述 15 种特征代谢产物组成的组中的特征代谢产物：

11、（i）采用正离子模式检测的 8 种：东莨菪内酯、异荭草素、泽兰黄酮、茵陈色原酮、猫眼草酚、棕矢车菊素、5,7,3'-三羟基-6,4',5'-三甲氧基黄酮和 α-亚麻酸；

12、（ii）采用负离子模式检测的 7 种：秦皮乙素、异夏佛塔苷、异鼠李素、咖啡酸、山奈酚-3-o-芸香糖苷、紫云英苷和芹菜素；

13、s4、将步骤 s3 的鉴定结果转换为“检出/未检出”的二值特征向量，并与预先建立的海艾、蕲艾和宛艾的已知产地特征组合进行比对，按下列规则判定所述待测艾叶样品的产地：

14、当与海艾、蕲艾和宛艾中某一已知产地的匹配率为最高，且所述最高匹配率不低于 85%，且所述最高匹配率与次高匹配率之差不少于 10 个百分点时，判定所述待测艾叶样品的产地为该最高匹配率所对应的已知产地；

15、当所述最高匹配率低于 85%，或所述最高匹配率与次高匹配率之差少于 10 个百分点时，判定所述待测艾叶样品为待定样品；

16、其中，所述匹配率＝所述待测艾叶样品与某一已知产地特征组合中“检出/未检出”结果相同的特征代谢产物数量÷该已知产地特征组合中特征代谢产物的总数×100%。

17、在上述的鉴别方法中，s2 中，所述酸化水相为 0.05～0.2 v/v% 的甲酸水溶液或1～10 mmol/l 的甲酸铵水溶液；所述酸化有机相为 0.05～0.2 v/v% 的甲酸乙腈溶液；所述反相 c18 柱的填料粒径为 1.6～2.0 μm、柱长为 50～100 mm、内径为 2.1 mm。

18、在上述的鉴别方法中，s2 中，所述梯度洗脱的程序为：0～1 min，2%～5% b；1～3min，5%～13% b；3～5 min，13%～20% b；5～6 min，20%～25% b；6～9 min，25%～27% b；9～11 min，27%～28% b；11～16 min，28%～40% b；16～21 min，40%～80% b；21～25 min，80%～100% b；25～28 min，100%→2% b；28～30 min，2% b；其中 a 为所述酸化水相，b 为所述酸化有机相。

19、在上述的鉴别方法中，步骤s2 中，所述高分辨质谱为四极杆-飞行时间质谱或静电场轨道阱质谱，分辨率不低于 30000 fwhm。

20、在上述的鉴别方法中，所述检测满足系统适用性判据：以所述质量控制样品连续进样 3 针计，所述内标峰面积的相对标准偏差不大于 10%，各特征代谢产物保留时间的相对标准偏差不大于 1%，且 15 种特征代谢产物的检出完整度为 100%；当不满足所述系统适用性判据时，重新制备供试品溶液并重新检测。

21、在上述的鉴别方法中，s3 之前还包括数据处理步骤：对 s2 采集的原始数据进行峰检测、峰过滤和峰对齐，得到代谢产物定量列表；基于所述质量控制样品进行支持向量回归漂移校正；采用公共数据库对代谢产物进行注释；采用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析建立产地判别模型，并以 vip>1.0 且 t 检验 p<0.05 为条件筛选差异代谢产物，所述对照品或标准数据库中的二级碎片信息包括 hmdb、lipidmaps、kegg 和 chebi 数据库中至少一种的二级碎片信息。

22、在上述的鉴别方法中，s4 中，用于区分蕲艾与海艾的特征代谢产物组合由 11 种特征代谢产物组成，即：采用正离子模式检测的东莨菪内酯、异荭草素、泽兰黄酮、茵陈色原酮、猫眼草酚、棕矢车菊素、5,7,3'-三羟基-6,4',5'-三甲氧基黄酮和 α-亚麻酸，以及采用负离子模式检测的秦皮乙素、异夏佛塔苷和异鼠李素。

23、在上述的鉴别方法中，s4 中，用于区分宛艾与海艾的特征代谢产物组合由 10 种特征代谢产物组成，即：采用正离子模式检测的异荭草素、泽兰黄酮、猫眼草酚和 α-亚麻酸，以及采用负离子模式检测的秦皮乙素、咖啡酸、山奈酚-3-o-芸香糖苷、紫云英苷、异鼠李素和芹菜素。

24、在上述的鉴别方法中，s4 中，用于区分蕲艾与宛艾的特征代谢产物组合由 9 种特征代谢产物组成，即：采用正离子模式检测的东莨菪内酯、茵陈色原酮、棕矢车菊素和 5,7,3'-三羟基-6,4',5'-三甲氧基黄酮，以及采用负离子模式检测的咖啡酸、异夏佛塔苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷、紫云英苷和芹菜素。

25、在上述的鉴别方法中，所述海艾为产于浙江省宁波市的艾叶，所述蕲艾为产于湖北省蕲春县的艾叶，所述宛艾为产于河南省南阳市的艾叶；所述已知产地特征组合按如下方式建立：分别取不少于 6 个批次的各已知产地艾叶，制备供试品溶液并检测，判据鉴定所述 15 种特征代谢产物，以各特征代谢产物在各已知产地中的"检出/未检出"结果建立该已知产地的特征组合。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、1. 本发明以液质联用同时获取正、负离子模式下的整体代谢指纹，覆盖初生代谢物和次生代谢物，减少对单一成分的依赖。

28、2. 本发明通过pca和opls-da相结合识别组间与组内差异，并以vip和p值双重标准筛选标志物，判定依据客观、可量化。

29、3. 本发明采用内标、质量控制样品和漂移校正，降低仪器波动、批次差异及基质效应对结果的影响，提高重复性。

30、4. 本发明针对海艾-蕲艾、海艾-宛艾及蕲艾-宛艾分别提供互补的差异代谢物组合，能够对相近产地品系进行有针对性的区分。

31、5. 本发明样品前处理和色谱质谱条件可标准化，单批检测周期短，适合药材收购、流通和生产过程中的批量质量控制。

32、6. 本发明方法输出的是基于代谢特征的产地判定结果，可与药效、质量等级和追溯信息关联，为艾叶品质评价和用药安全提供技术支撑。