一种基于UPLC-Q/TOF-MS的车前子产地鉴别方法与流程

本发明涉及中药检测，具体涉及一种基于uplc-q/tof-ms的车前子产地鉴别方法。

背景技术：

1、车前子（plantaginis semen）为车前科植物车前（

plantago asiatica l.）或平车前（

plantago depressa willd.）的干燥成熟种子，具有清热利尿、渗湿止泻、明目、祛痰等功效。江西产车前子（俗称“凤眼车前”）为道地药材，栽培历史悠久，产量占全国70%以上，其质量优于东北、四川、湖南等产地的车前子。由于价格差异，市场上存在用非道地药材冒充道地药材或者在道地药材中掺杂非道地药材的现象。

2、目前，车前子的质量评价主要依赖于外观性状及《中国药典》规定的指标成分（如京尼平苷酸、毛蕊花糖苷）的含量测定，然而不同产地的车前子外观差异细微，这使得外观性状的鉴别方法依赖于个人经验，主观性强，且无法鉴别道地药材中掺杂非道地药材的情况。而车前子产地覆盖面广，不同产地车前子指标成分主要差异在于含量不同，且不同产地车前子中指标成分的含量并不存在明显阈值，这使得仅依靠单一或少数几个指标成分的检测仍然难以客观确定车前子产地，更加无法鉴别在道地药材中掺杂不同程度非道地药材的情况。现有技术cn116893227a公开了车前子及其炮制品的指纹图谱构建方法，该方法主要侧重于生品与炮制品（盐制、炒制）的区分，仍然无法解决不同产地车前子以及道地药材中掺杂不同程度非道地药材的鉴别。

3、基于此，建立一种能够全面、快速、准确鉴别不同产地车前子产地并能检测掺杂情况的方法，对于保障临床用药安全及维护市场秩序具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种基于uplc-q/tof-ms的车前子产地鉴别方法，该方法能够有效用于不同产地车前子的鉴别及掺杂检测。

2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种基于uplc-q/tof-ms的车前子产地鉴别方法，包括以下步骤：

4、s1、取不同产地车前子样品分别制备供试品溶液，制备含有桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车前子苷、7-羟基香豆素、木犀草苷、毛蕊花糖苷、野漆树苷的混合对照品溶液；

5、s2、将s1制备的不同产地车前子供试品溶液和混合对照品溶液，采用超高效液相色谱分离和高分辨质谱检测，采用正离子、负离子mse扫描模式，获得正、负离子模式下的质谱总离子流图，采集的 uplc-q/tof-ms数据利用 unifi portal软件提取化合物信息，根据化合物的保留时间、准确分子离子峰和二级质谱信息，对所检测的供试品溶液成分进行分析及鉴定；

6、s3、将正、负离子模式下采集的不同产地车前子样品质谱数据，分别导入progenesis qi软件，将所有的化合物数据导入ezinfo 3.0软件得到.txt文件，将得到的文件导入simca-p 14.1软件进行主成分分析和正交偏最小二乘-判别分析；

7、s4、分别利用散点得分图和s-plot分析得到江西产车前子和东北产车前子的第i组差异化合物，以及江西产车前子和其他产地产车前子的第ii组差异化合物，通过s-plot图vip>1并结合t检验p<0.05，取江西产车前子和东北产车前子、江西产车前子和其他产地产车前子两组差异性分析结果的交集，确定l-鼠李糖、愈创木基甘油-β-阿魏酸酯、油酸、5,7-二羟基色原酮、芹菜素-7-o-葡萄糖苷、车前子苷作为不同产地车前子鉴别的关键差异性化合物，并建立opls-da鉴别模型；

8、s5、将待测车前子样品按照s1的方法制备供试品溶液，按照s2中超高效液相色谱分离和高分辨质谱检测，获得待测车前子样品正、负离子模式下质谱数据，导入s4建立的opls-da模型中进行鉴定。

9、进一步地，s1中供试品溶液的制备方法为，取不同产地车前子样品粉碎，过筛，精密称定，加入70%甲醇水溶液，超声提取，放冷后补足减失的重量，离心，取上清液过滤，制得供试品溶液。

10、进一步地，超声提取为在功率500w，频率40khz下提取30min。

11、进一步地，s1中车前子样品包括江西产车前子、黑龙江产车前子、辽宁产车前子、四川产车前子、河北产车前子、陕西产车前子、安徽产车前子和江苏产车前子。

12、进一步地，s2中，超高效液相色谱分离采用的色谱条件为：

13、色谱柱：waters acquity uplc beh c18色谱柱；

14、流动相a：甲醇；

15、流动相b：0.1%甲酸水溶液；

16、梯度洗脱程序：0～1min，8%a；1～10min，8%～50%a；10～25min，50%～95%a；25～28min，95%a；

17、柱温：40℃；

18、流速：0.3ml/min；

19、进样量：2μl。

20、进一步地，s2中，所采用的质谱检测条件为：电喷雾离子源采用正、负离子两种模式进行mse扫描。

21、进一步地，正离子模式下，毛细管电压为3.0kv，离子源温度为110℃，脱溶剂温度为450℃；负离子模式下，毛细管电压为2.5kv，离子源温度为100℃，脱溶剂温度为350℃；源漂移值为80v，锥孔电压为40v，采样锥电压为40v；锥孔气流量为50l/h，脱溶剂气流量为800l/h；低碰撞能量为6v，高碰撞能量设为15v～45v；质量扫描范围为50～1200m/z，扫描时间为0.5秒；使用亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正，正离子模式校正离子为m/z556.2771，负离子模式校正离子为m/z554.2615。

22、进一步地，s4中第i组差异化合物分别为：l-鼠李糖、桃叶珊瑚苷、愈创木基甘油-β-阿魏酸酯、油酸、5,7-二羟基色原酮、6-羟基木犀草素、芹菜素-7-o-葡萄糖苷、红景天苷、圣草酚-7-o-β-d-葡萄糖苷、乌苏酸和车前子苷。

23、进一步地，s4中第ii组差异化合物分别为：l-鼠李糖、愈创木基甘油-β-阿魏酸酯、油酸、5,7-二羟基色原酮、芹菜素-7-o-葡萄糖苷、山梨醇和车前子苷。

24、进一步地，s5中鉴定方法为，利用opls-da模型中聚类热图分析，江西产地组、东北产地组和其他产地组分别聚为三类，根据聚类结果直接判断产地，当待测样品在opls-da模型得分图中偏离江西组聚类区域、东北组聚类区域和其他地区聚类区域，则判定为存在掺杂。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

26、1. 本技术提供的一种基于uplc-q/tof-ms的车前子产地鉴别方法，以甲醇水溶液为提取溶剂，经超声辅助提取制备供试品溶液，采用waters acquity uplc beh c18色谱柱，甲醇/0.1%甲酸水进行梯度洗脱，通过正、负离子两种模式进行mse扫描，能够同时采集到几万个成分信息，利用自建的车前子化学成分数据库检索，鉴别得到车前子的化学成分数据表，通过将车前子不同产地进行分组，并结合多元统计学方法建立opls-da模型结合s-polt图和t检验，筛选出两组差异化合物，再取两组差异化合物分析结果的交集最终得到具有极强产地指向性的6种关键差异性化合物，并据此建立opls-da鉴别模型。

27、2. 该方法结合了非靶向代谢组学和多元统计分析，避免了人为选择指标的主观性，该鉴别方法具备检测可信度高和快速的优势，能够有效鉴别江西产车前子、东北产地车前子和其他产地的非道地车前子药材，同时还能够检测江西产车前子中掺杂的少量其他产地车前子的情况，掺杂量达10%以上即可被模型识别，解决了目前市场中江西道地车前子药材中少量掺杂其他产地车前子的难点问题。通过本技术提供的方法能够有效用于不同产地车前子的鉴别及掺杂检测，为车前子药材的质量控制提供了有力的技术支撑。