检测唾液中D-丙氨酸和/或D-脯氨酸的方法、试剂盒及其应用

本发明属于生物传感与手性分析，具体涉及一种基于d-氨基酸氧化酶（daao）催化-金纳米棒（aunrs）蚀刻级联反应检测唾液中d-丙氨酸和/或d-脯氨酸的方法、试剂盒及其在制备胃部疾病和/或食管癌诊断产品中的应用。

背景技术：

1、胃部疾病是影响全球居民健康的重大公共卫生问题，涵盖从浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎到消化性胃溃疡等良性病变，以及胃腺癌和胃食管结合部癌等恶性疾病。这些疾病遵循明确的逐步进展规律，但高度相似的临床症状常导致诊断延迟或误诊。在多种风险因素（主要是幽门螺杆菌感染、膳食刺激物暴露及慢性炎症损伤）的协同作用下，正常胃黏膜的组织学状态会逐渐发生病理进展：从非萎缩性胃炎开始，进展为萎缩性胃炎，进一步发展为以肠上皮化生和异型增生为代表的癌前病变，最终可能演变为肠型胃癌。与此同时，长期未愈合的胃溃疡和慢性萎缩性炎症不仅显著增加胃癌发病风险，还通过共同的病理机制提高食管癌的发生概率。

2、鉴于胃癌发生过程存在公认的多步骤进展机制，对出现常见胃部症状的患者进行癌前病变筛查，对于胃癌的早期预防和及时临床干预具有重要意义。目前，胃镜检查结合病理活检仍是胃部疾病临床诊断的金标准。然而，这些检查方法具有侵入性，给患者带来显著不适，且医疗费用高、等待病理报告时间长，导致患者依从性不佳，难以用于大规模人群筛查和术后随访监测。因此，开发新型、操作简便、无创的诊断技术，作为胃镜检查和病理活检的补充辅助手段，具有重要的临床意义。

3、现有研究表明，健康个体唾液中游离氨基酸主要以l构型存在，d-氨基酸（d-aas）维持在极低水平；而胃癌患者唾液中d-氨基酸的浓度显著升高。具体而言，健康个体唾液中d-丙氨酸（d-ala）浓度为0～25.3μm，d-脯氨酸（d-pro）浓度为0～11.3μm；而胃癌患者唾液中d-ala浓度可达126.3～285.3μm，d-pro浓度可达46.1～114.5μm。因此，唾液中d-氨基酸的定量分析对于胃部疾病的非侵入性鉴别诊断具有重要价值。

4、目前，d-氨基酸的检测主要依赖高效液相色谱法（hplc）、毛细管电泳（ce）、圆二色谱（cd）和质谱法（ms）等常规分析技术。hplc和ce方法需要使用手性固定相或柱前衍生化处理以实现对映体分离，操作流程复杂；cd法利用d-氨基酸固有的手性光学信号，但信号强度极弱；质谱法虽具有卓越的检测灵敏度，但需与色谱分离系统联用，仪器成本高昂，操作门槛高。此外，生物样本（如唾液和血清）中含有大量非目标成分，包括蛋白质、电解质及代谢物，传统检测方法抵抗干扰的能力有限，容易导致检测结果失真。因此，开发一种具有高选择性和高灵敏度的唾液中d-氨基酸的检测方法具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有高选择性和高灵敏度，适用于唾液中d-丙氨酸和/或d-脯氨酸检测的检测方法及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、本发明提供了一种检测唾液中d-丙氨酸和/或d-脯氨酸的方法，包括以下步骤：

4、（1）唾液样品预处理：对待测唾液样品进行预处理，除去唾液样品中的蛋白质；

5、（2）取步骤（1）预处理的唾液样品，加入d-氨基酸氧化酶溶液，孵育反应，使唾液样品中的d-丙氨酸和d-脯氨酸发生催化氧化，原位生成h2o2；

6、（3）取步骤（2）反应结束溶液，加入feso4、edta、盐酸溶液以及金纳米棒，使步骤（2）生成的h2o2发生fenton反应产生羟基自由基，蚀刻金纳米棒；

7、（4）采集步骤（3）中金纳米棒在400～950nm范围内的全波长光谱数据，获得所述金纳米棒在不同波长下的吸光度值；

8、（5）使用偏最小二乘法回归模型对步骤（4）采集的全波长光谱数据进行分析，根据分析结果确定唾液样品中d-丙氨酸和/或d-脯氨酸的含量；所述偏最小二乘法回归模型通过以下方法预先建立：配制d-丙氨酸和d-脯氨酸的混合标准品系列，按照步骤（2）至（4）处理采集获取各混合标准品的全波长光谱数据，以全波长光谱数据为自变量x，以d-脯氨酸和d-丙氨酸的参考浓度为因变量y，建立偏最小二乘回归模型。

9、进一步地，步骤（1）中的预处理方法包括：向唾液样品中加入三氟乙酸，涡旋混合，澄清后取上清液，用超纯水稀释后直接用于后续检测。在一些实施例中，三氟乙酸的加入量为0.1%，超纯水稀释倍数为3倍。

10、进一步地，步骤（2）中，d-氨基酸氧化酶的加入量、孵育温度、孵育时间、反应体系ph对唾液中d-丙氨酸和d-脯氨酸的催化氧化反应均有不同程度的影响，本发明中，为了确保检测结果的精确性，需要使唾液中d-丙氨酸和d-脯氨酸完全氧化。在一些实施例中，反应体系中加入有ph=7.4的pbs缓冲液，反应体系总体积为204μl时，预处理唾液的加入量为30μl，反应体系中，d-氨基酸氧化酶的浓度为0.3u/ml，孵育温度为37℃，孵育时间为100min时，反应完全。

11、进一步地，步骤（3）中，反应温度、fe2+浓度、盐酸浓度、反应时间对fenton蚀刻反应均有不同程度的影响，本发明中，为了确保检测结果的精确性，需要使步骤（2）中生成的h2o2完全反应生成羟基自由基蚀刻金纳米棒。在一些实施例中，反应体系总体积为300μl，步骤（2）反应结束溶液的加入量为30μl，反应体系中，fe2+浓度为0.5mm，edta浓度为0.5mm，盐酸浓度为0.032m，金纳米棒浓度为0.228mm，反应液温度为25-50℃，反应时间为210min时，反应完全。

12、在一些实施例中，步骤（3）中，所述金纳米棒为种子介导生长法制备的ctab稳定的金纳米棒，长轴为93.56±6.38 nm，短轴为26.28±2.46 nm。

13、进一步地，步骤（4）中，所述全波长光谱数据的采集间隔为1 nm。

14、进一步地，步骤（5）中，所述偏最小二乘法回归模型的建立包括以下步骤：（5.1）以健康人唾液为基质，配制d-脯氨酸和d-丙氨酸不同浓度组合的二元混合标准溶液；（5.2）将各混合标准品经步骤（2）至（4）处理，采集400～950 nm全波长光谱数据；（5.3）以全波长光谱数据为自变量x，以d-脯氨酸和d-丙氨酸的参考浓度为因变量y，建立偏最小二乘回归模型，采用留一交叉验证法确定最优主成分数；（5.4）以预测浓度与实测浓度的线性相关系数r2、交叉验证均方根误差和投影重要性指数评价模型性能。

15、本发明还提供了一种用于检测唾液中d-丙氨酸和/或d-脯氨酸的试剂盒，所述试剂盒包括：

16、（a）d-氨基酸氧化酶；

17、（b）pbs缓冲液，ph=7.4；

18、（c）feso4溶液；

19、（d）金纳米棒；

20、（e）edta溶液；

21、（f）盐酸溶液；

22、（g）tfa。

23、进一步地，所述试剂盒还包括：（h）d-丙氨酸和d-脯氨酸的混合质控品。

24、进一步地，所述金纳米棒为种子介导生长法制备的ctab稳定的金纳米棒，长轴为93.56±6.38 nm，短轴为26.28±2.46 nm。

25、进一步地，所述d-氨基酸氧化酶为冻干粉形式，使用时用ph=7.4的pbs缓冲液复溶至2 u/ml，所述feso4溶液的浓度为5mm，所述edta溶液的浓度为5mm，所述盐酸溶液的浓度为1.6m。

26、本发明还提供了上述试剂盒在制备胃部疾病和/或食管癌诊断产品中的应用。

27、进一步地，所述胃部疾病包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃溃疡；所述应用包括使用所述试剂盒检测获得受试者唾液样品在400～950nm范围内的全波长光谱数据，结合偏最小二乘判别分析模型对受试者进行健康对照、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃溃疡和食管癌的分类判别。

28、本发明还提供了一种胃部疾病和/或食管癌的pls-da模型的构建方法，包括以下步骤：

29、将临床确认的健康对照（hc）、浅表性胃炎（sg）、萎缩性胃炎（ag）、胃溃疡（gu）、食管癌（ec）患者的唾液样本按步骤（2）至（4）处理，采集获得400～950 nm全波长光谱数据；

30、以全波长光谱数据为自变量 x，其中 400～950 nm 范围内每个波长的吸光度值为一个自变量，共 551 个自变量（矩阵维度为样本数 ×551）；以组别标签（转换为哑变量）为响应变量y，建立pls-da判别模型，采用交叉验证法确定最优主成分数。

31、本发明还提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述程序被处理器执行时实现以下步骤：

32、接收400～950nm 范围内的全波长消光光谱数据；

33、将光谱数据代入偏最小二乘法回归模型或偏最小二乘法判别模型，输出d-丙氨酸和/或d-脯氨酸的预测浓度、或胃部疾病和食管癌的分类结果。

34、本发明还提供了一种胃部疾病和/或食管癌诊断产品，其特征在于，所述产品包括上述用于检测唾液中d-丙氨酸和/或d-脯氨酸的试剂盒。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、本发明提供了一种能检测唾液中d-丙氨酸和/或d-脯氨酸的方法，所述方法通过daao酶选择性催化唾液中的d-丙氨酸和d-脯氨酸氧化原位生成h2o2，再通过fenton反应产生羟基自由基对金纳米棒进行蚀刻，通过检测金纳米棒的光学信号变化确定待测样品中d-氨基酸的含量，该方法能够高效、准确地定量检测唾液中的d-pro和d-ala的含量，具有良好的抗干扰性和选择性。本发明所述检测方法检测获取的样品在400～950nm范围内的全波长光谱数据，结合偏最小二乘判别分析（pls-da）模型，能够有效区分健康个体与浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃溃疡、食管癌等疾病患者，在胃部疾病和食管癌的无创筛查、辅助诊断和鉴别诊断中具有广阔的应用前景。