羊病蛋白质芯片、试剂盒及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种羊病蛋白质芯片、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、随着现代畜牧业向集约化与规模化转型，羊群传染病的流行病学特征发生了显著变化，病原谱的复杂化与多样化已成为制约养羊业健康发展的关键瓶颈。精准、快速的诊断是阻断疫病传播、降低经济损失的首要防线。传统的血清学方法（如elisa）多数为一病一检模式，不仅通量低、耗时长，且难以有效区分疫苗免疫抗体与野毒感染抗体；而分子生物学检测（如pcr）虽然灵敏，但对实验室环境与操作人员要求较高，难以在基层大规模推广。同时羊病临床中多病原共感染现象极为普遍，如呼吸道疾病（可能涉及绵羊肺炎支原体、巴氏杆菌、曼氏杆菌及副流感病毒等）与繁殖障碍疾病（涉及布鲁氏菌、衣原体、弓形虫等）的临床症状高度重叠，仅凭肉眼观察难以区别；此外，皮肤及黏膜的痘疹样病变在小反刍兽疫、羊痘及口疮等疾病初期极易混淆。另一方面，混合感染已成为常态，多种病原协同致病不仅加重了病情，更干扰了单一病原检测的准确性，进而延误治疗时机或导致免疫失败。因此，亟需开发一种能够覆盖多种核心病原、兼具高通量与高灵敏度的筛查工具，以满足现代羊病防控中对多病原同步检测及鉴别诊断的迫切需求。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于，提供一种羊病蛋白质芯片，其具有高通量，高灵敏度的优点，为多病原羊病的同步筛查、检测提供了技术方案。

2、为了解决上述技术问题，作为本发明的第一方面，本发明提供了一种羊病蛋白质芯片，其包括基片和与其连接的抗原；

3、所述抗原包括鸟分枝杆菌副结核亚种抗原、羊种布鲁氏菌抗原、伪结核棒状杆菌抗原和a型口蹄疫病毒抗原；

4、所述鸟分枝杆菌副结核亚种抗原为鸟分枝杆菌副结核亚种质膜囊泡、map1693c、map4308c、map2677c、map1197中的一种或多种；map1693c、map4308c、map2677c、map1197分别由核苷酸序列如seq id no：44~47所示的dna分子编码；

5、所述羊种布鲁氏菌抗原为布鲁氏菌脂多糖、b.melitensis-omp25、b.melitensis-omp31、b.melitensis-dps中的一种或多种；b.melitensis-omp25、b.melitensis-omp31、b.melitensis-dps分别由核苷酸序列如seq id no：61~63所示的dna分子编码；

6、所述伪结核棒状杆菌抗原为cla-pld、cla-cp40、cla-slpa中的一种或多种；cla-pld、cla-cp40、cla-slpa分别由核苷酸序列如seq id no：71~73所示的dna分子编码；

7、所述a型口蹄疫病毒抗原为fmdv-a-1、fmdv-a-2、fmdv-a-3中的一种或多种；fmdv-a-1、fmdv-a-2、fmdv-a-3的氨基酸序列分别如seq id no：85~87所示。

8、作为上述技术方案的改进，所述抗原还包括山羊痘病毒抗原、羊传染性脓疱病毒抗原、蓝舌病病毒抗原、小反刍兽疫病毒抗原、伪狂犬病病毒抗原、尼帕病毒抗原、裂谷热病毒抗原、山羊关节炎-脑炎病毒抗原、日本脑炎病毒抗原、梅迪-维斯纳病毒抗原、内罗毕羊病病毒抗原、羊流产沙门氏菌抗原、丝状支原体山羊亚种抗原、绵羊肺炎支原体抗原、产气荚膜梭菌抗原、无乳支原体抗原、鹦鹉热衣原体抗原、流产衣原体抗原、细粒棘球绦虫抗原、单核细胞增生李斯特菌抗原、弓形虫抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、溶血性曼氏杆菌抗原、炭疽芽孢杆菌抗原、o型口蹄疫病毒抗原、结核分枝杆菌牛变种抗原；

9、所述山羊痘病毒抗原为gtpv-p32、gtpv-r122、gtpv-a34、gtpv-a36中的一种或多种；gtpv-p32、gtpv-r122、gtpv-a34、gtpv-a36分别由核苷酸序列如seq id no：1~4所示的dna分子编码；

10、所述羊传染性脓疱病毒抗原为orfv-b2l、orfv-f1l、orfv-020、orfv-125中的一种或多种；orfv-b2l、orfv-f1l、orfv-020、orfv-125分别由核苷酸序列如seq id no：5~8所示的dna分子编码；

11、所述蓝舌病病毒抗原为btv-vp7、btv-vp2、btv-ns3中的一种或多种；btv-vp7、btv-vp2、btv-ns3分别由核苷酸序列如seq id no：9~11所示的dna分子编码；

12、所述小反刍兽疫病毒抗原为pprv-n、pprv-f、pprv-h中的一种或多种；pprv-n、pprv-f、pprv-h分别由核苷酸序列如seq id no：12~14所示的dna分子编码；

13、所述伪狂犬病病毒抗原为prv-gd、prv-gb、prv-ge中的一种或多种，prv-gd、prv-gb、prv-ge分别由核苷酸序列如seq id no：15~17所示的dna分子编码；

14、所述尼帕病毒抗原为niv-n和/或niv-g；niv-n、niv-g分别由核苷酸序列如seq idno：18~19所示的dna分子编码；

15、所述裂谷热病毒抗原为rvfv-np、rvfv-nss、rvfv-nsm中的一种或多种；rvfv-np、rvfv-nss、rvfv-nsm分别由核苷酸序列如seq id no：20~22所示的dna分子编码；

16、所述山羊关节炎-脑炎病毒抗原为caev-ca、caev-gp135、caev-ma中的一种或多种；caev-ca、caev-gp135、caev-ma分别由核苷酸序列如seq id no：23~25所示的dna分子编码；

17、所述日本脑炎病毒抗原为jev-c、jev-e、jev-ns1中的一种或多种；jev-c、jev-e、jev-ns1分别由核苷酸序列如seq id no：26~28所示的dna分子编码；

18、所述梅迪-维斯纳病毒抗原为mvv-p15、mvv-p25、mvv-p28、mvv-p135中的一种或多种；mvv-p15、mvv-p25、mvv-p28、mvv-p135分别由核苷酸序列如seq id no：29~32所示的dna分子编码；

19、所述内罗毕羊病病毒抗原为nsd-n和/或nsd-gc/gn；nsd-n、nsd-gc/gn分别由核苷酸序列如seq id no：33~34所示的dna分子编码；

20、所述羊流产沙门氏菌抗原为s.abortusovis-fljb-h和/或s.abortusovis-omp；s.abortusovis-fljb-h、.abortusovis-omp分别由核苷酸序列如seq id no：35~36所示的dna分子编码；

21、所述丝状支原体山羊亚种抗原为m.mycoides-lppa和/或m.mycoides-seca；m.mycoides-lppa、m.mycoides-seca分别由核苷酸序列如seq id no：37~38所示的dna分子编码；

22、所述绵羊肺炎支原体抗原为m.ovi-p70、m.ovi-enolase、m.ovi-p113、m.ovi-p60、m.ovi-pdhd中的一种或多种；m.ovi-p70、m.ovi-enolase、m.ovi-p113、m.ovi-p60、m.ovi-pdhd分别由核苷酸序列如seq id no：39~43所示的dna分子编码；

23、所述产气荚膜梭菌抗原为alpha toxin和/或beta toxin；alpha toxin、betatoxin分别由核苷酸序列如seq id no：48~49所示的dna分子编码；

24、所述产气荚膜梭菌抗原为netb和/或epsilon toxin；netb、epsilon toxin分别由核苷酸序列如seq id no：50~51所示的dna分子编码；

25、所述无乳支原体抗原为m.agalactiae-pdhb、m.agalactiae-p80、m.agalactiae-p48中的一种或多种；m.agalactiae-pdhb、m.agalactiae-p80、m.agalactiae-p48分别由核苷酸序列如seq id no：52~54所示的dna分子编码；

26、所述鹦鹉热衣原体抗原为c.psittaci-momp、c.psittaci-tarp、c.psittaci-cpaf中的一种或多种；c.psittaci-momp、c.psittaci-tarp、c.psittaci-cpaf分别由核苷酸序列如seq id no：55~57所示的dna分子编码；

27、所述流产衣原体抗原为c.abortus-mip、c.abortus-momp、c.abortus-pomp90b中的一种或多种；c.abortus-mip、c.abortus-momp、c.abortus-pomp90b分别由核苷酸序列如seq id no：58~60所示的dna分子编码；

28、所述细粒棘球绦虫抗原为egm123、egseverin、eg14-3-3ζ、eg-agb8/3中的一种或多种；egm123、egseverin、eg14-3-3ζ、eg-agb8/3分别由核苷酸序列如seq id no：64~67所示的dna分子编码；

29、所述单核细胞增生李斯特菌抗原为llo、p60、inlb中的一种或多种；llo、p60、inlb分别由核苷酸序列如seq id no：68~70所示的dna分子编码；

30、所述弓形虫抗原为sag1、gra6、sag2a中的一种或多种；sag1、gra6、sag2a分别由核苷酸序列如seq id no：74~76所示的dna分子编码；

31、所述多杀性巴氏杆菌抗原为pm-ompa和/或pm-omph；pm-ompa、pm-omph分别由核苷酸序列如seq id no：77~78所示的dna分子编码；

32、所述溶血性曼氏杆菌抗原为m.haemolytica-lkt和/或m.haemolytica-nlpi；m.haemolytica-lkt、m.haemolytica-nlpi分别由核苷酸序列如seq id no：79~80所示的dna分子编码；

33、所述炭疽芽孢杆菌抗原为b.anthracis-pa63，其由核苷酸序列如seq id no：81所示的dna分子编码；

34、所述o型口蹄疫病毒抗原为fmdv-o-1、fmdv-o-2、fmdv-o-3中的一种或多种；fmdv-o-1、fmdv-o-2、fmdv-o-3的氨基酸序列分别如seq id no：82~84所示；

35、所述结核分枝杆菌牛变种抗原为结核分枝杆菌牛变种脂阿拉伯甘露聚糖。

36、作为上述技术方案的改进，gtpv-p32、gtpv-r122、gtpv-a34、gtpv-a36、orfv-b2l、orfv-f1l、orfv-020、orfv-125、btv-vp7、btv-vp2、btv-ns3、pprv-n、pprv-f、pprv-h、prv-gd、prv-gb、prv-ge、niv-n、niv-g、rvfv-np、rvfv-nss、rvfv-nsm、caev-ca、caev-gp135、caev-ma、jev-c、jev-e、jev-ns1、mvv-p15、mvv-p25、mvv-p28、mvv-p135、nsd-n、nsd-gc/gn、s. abortusovis-fljb-h、s. abortusovis-omp、m. mycoides-lppa、m. mycoides-seca、m.ovi-p70、m.ovi-enolase、m.ovi-p113、m.ovi-p60、m.ovi-pdhd、map1693c、map4308c、map2677c、map1197、alpha toxin、beta toxin、netb、epsilon toxin、m. agalactiae-pdhb、m. agalactiae-p80，m. agalactiae-p48、c. psittaci-momp、c. psittaci-tarp、c.psittaci-cpaf、c. abortus-mip、c. abortus-momp、c. abortus-pomp90b、b.melitensis-omp25、b. melitensis-omp31、b. melitensis-dps、egm123、egseverin、eg14-3-3ζ、eg-agb8/3、llo、p60、inlb、cla-pld、cla-cp40、cla-slpa、sag1、gra6、sag2a、pm-ompa、pm-omph、m.haemolytica-lkt、m.haemolytica-nlpi、b.anthracis-pa63为重组表达纯化的蛋白质。

37、作为上述技术方案的改进，所述基片为硝酸纤维素修饰玻片、醛基修饰玻片或环氧基修饰玻片；和/或

38、所述抗原通过点样缓冲液稀释至点样浓度为0.25mg/l~1.5mg/l；和/或

39、所述点样缓冲液选用甘油水溶液、pbs、tbs中的一种或多种。

40、作为上述技术方案的改进，所述基片为硝酸纤维素修饰载玻片；和/或

41、所述抗原通过点样缓冲液稀释至点样浓度为0.25mg/l~1.0mg/l；和/或

42、所述点样缓冲液选用80wt%甘油水溶液。

43、作为本发明的第二个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括上述的羊病蛋白质芯片。

44、作为上述技术方案的改进，还包括样品稀释液、封闭液、洗涤液、二抗和荧光三抗。

45、作为上述技术方案的改进，所述样品稀释液为含有0.5wt%~2wt%bsa的pbst或含有0.5wt%~2wt%鱼皮明胶的鱼皮明胶与水的混合物；和/或

46、所述封闭液为含有1wt%~5wt%bsa的pbs或含有2wt%~5wt%的鱼皮明胶的鱼皮明胶与水的混合物；和/或

47、所述洗涤液为pbs、pbst或tbst；和/或

48、所述二抗为兔抗羊igg；和/或

49、所述荧光三抗为荧光基团标记的鼠抗兔igg；所述荧光基团选用fitc、tritc、cy、fam或r-pe；和/或

50、所述二抗的稀释度为1:2000~1:3000；和/或

51、所述荧光三抗的稀释度为1:2000~1:3000。

52、作为上述技术方案的改进，所述样品稀释液为含有1wt%bsa的pbst；和/或

53、所述封闭液为含有3wt%bsa的pbs；和/或

54、所述洗涤液为pbst；和/或

55、所述二抗的稀释度为1:2000；和/或

56、所述荧光三抗的稀释度为1:2000。

57、作为本发明的第三个方面，本发明公开了上述的羊病蛋白质芯片在（1）或（2）中的应用：

58、（1）非诊断目的的羊病检测；

59、（2）筛选或评价用于羊病的疫苗。

60、作为本发明的第四个方面，本发明公开了上述的试剂盒在（1）或（2）中的应用：

61、（1）非诊断目的的羊病检测；

62、（2）筛选或评价用于羊病的疫苗。

63、实施本发明，具有如下有益效果：

64、本发明构建的羊病蛋白质芯片通过多靶点联合检测策略，对每种病原设计了一个或多个特异性抗原，极大地降低了漏检风险，提升了检测的灵敏度与特异性。该芯片实现了单次实验即可同步筛查数十种羊病病原，不仅适用于大规模的流行病学调查，还能为疫苗免疫效果评估、疾病早期预警以及混合感染的复杂病因分析提供精准的数据支持，具有显著的临床应用价值。