一种双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶、比色生物传感器、试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及生物传感器，具体涉及一种双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶、比色生物传感器、试剂盒和应用。

背景技术：

1、比色传感器是基于催化显色液输出比色信号，放大检测信号，利用光电转换元件实现对待测分析物的定性定量分析。在传统酶联免疫吸附分析中，通常需通过化学偶联反应将抗体与过氧化物酶或过氧化物酶标记二抗进行标记。这一过程不仅操作复杂、耗时，还可能导致生物分子活性受损。

2、比色传感器（colorimetric sensor）是一种将目标分析物的浓度信息转化为肉眼可见的颜色变化信号的分析装置。因其无需复杂仪器、操作简便、可通过裸眼直接判读结果，在食品安全、环境监测、临床诊断及公共安全等领域具有重要的应用价值。

3、传统的比色传感器多依赖天然酶（如辣根过氧化物酶hrp）标记抗体以产生比色信号。然而，天然酶在实际应用中存在明显局限：制备和纯化成本高昂、在高温或酸碱环境中易变性失活、储存条件苛刻，且通过化学偶联方式标记抗体操作繁琐，易损害生物分子的活性。

4、纳米酶（nanozymes）是一类具有类酶催化活性的纳米材料。纳米酶相比天然酶，具备催化效率高、稳定性好、成本低廉、易于规模化制备和表面功能化等优势。基于纳米酶构建的比色传感器，通过其类过氧化物酶活性催化底物（如无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺，tmb）发生显色反应，产生肉眼可辨的蓝色信号，从而实现对目标物的灵敏检测。然而，尽管在某些体系中纳米酶的催化效率可以媲美甚至超过天然酶，但多数纳米酶的亲和力、灵敏度仍显不足。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶、比色生物传感器、试剂盒和应用。本发明提供的双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶具有高偶联效率，不易损害生物分子活性，用于酶联免疫吸附检测时具有高亲和力和灵敏度。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，包括铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球，以及化学连接在所述铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球表面的抗体和过氧化物酶，所述抗体与过氧化物酶通过醌基-氨基相互作用与铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球结合。

4、优选的，所述抗体包括igg抗体和/或核酸适配体；所述过氧化物酶包括辣根过氧化物酶。

5、优选的，所述铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球的粒径为280~360 nm；

6、所述铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球中，铁的掺杂量为1.0~1.5wt%，锌的掺杂量为3~5wt%。

7、本发明提供了上述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

8、将铁源、锌源、多巴胺与溶剂混合，调节ph值至碱性，进行氧化自聚反应，得到铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球；

9、将铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球水溶液、抗体溶液与过氧化物酶溶液与水混合，进行自组装反应，封闭未结合位点，得到双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶。

10、优选的，所述铁源、锌源、多巴胺的摩尔比为1:（2~4）:（15~30）；

11、所述调节ph值至碱性的ph值为9~11；

12、所述氧化自聚反应的温度为室温，时间为20~30 h。

13、优选的，所述铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球水溶液的浓度为0.20~0.25 mg/ml，所述抗体溶液的浓度为2.5~3.0 mg/ml，所述过氧化物酶的浓度为2.5~3.0 mg/ml；

14、所述自组装反应的温度为室温，时间为0.5~2 h。

15、本发明提供了一种比色生物传感器，包括上述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，以及与所述纳米酶中抗体竞争结合的固定抗原和待测抗原。

16、本发明提供了一种比色生物传感试剂盒，包括上述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，还包括包被固定抗原的酶标板、过氧化氢、显色底物。

17、本发明提供了上述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶、比色生物传感器或者比色生物传感试剂盒在非诊断目的酶联免疫吸附检测中的应用。

18、本发明提供了一种非诊断目的酶联免疫吸附检测方法，包括以下步骤：

19、使用固定抗原包被酶标板，封闭未结合位点，得到包被固定抗原的酶标板；

20、向所述包被固定抗原的酶标板中加入待测液和上述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，进行孵育，洗去未结合物，得到孵育后的酶标板；

21、向所述孵育后的酶标板中加入显色底物和过氧化氢溶液，进行显色反应，终止反应后测试比色信号；

22、根据所述比色信号和预定的标准曲线获得待测液中待测抗原的含量。

23、本发明提供了一种双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，包括铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球，以及化学连接在所述铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球表面的抗体和过氧化物酶，所述抗体与过氧化物酶通过醌基-氨基相互作用与铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球结合。本发明提供的双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶能够实现一步法合成，通过抗体特异性识别抗原，并利用过氧化物酶催化过氧化氢-四甲基联苯胺显色生成比色信号，实现检测信号放大，从而克服了化学偶联效率低、生物活性易受损、操作步骤复杂等固有缺陷。同时，本发明提供的双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶具有良好的亲和力、催化活性、生物相容性及检测灵敏性，能够减少检测步骤，提高响应速度与准确性，适用于食品安全领域的实时动态监测，具有广泛的推广价值。以地西泮抗体为例，本发明提供的双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶亲和力常数kd为7.16×108l/mol，表明具有较强的亲和力和生物相容性，其ic50值为6.42 µg/l，具有高检测灵敏度。

24、本发明提供了上述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶的制备方法，在得到铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球后，仅需一步法就可以将抗体和过氧化物酶偶联到纳米微球表面，操作简单，条件温和，不损伤生物活性，易于实现工业推广应用。

1.一种双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，其特征在于，包括铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球，以及化学连接在所述铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球表面的抗体和过氧化物酶，所述抗体与过氧化物酶通过醌基-氨基相互作用与铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球结合。

2.根据权利要求1所述的双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，其特征在于，所述抗体包括igg抗体和/或核酸适配体；所述过氧化物酶包括辣根过氧化物酶。

3.根据权利要求1所述的双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，其特征在于，所述铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球的粒径为280~360 nm；

4.权利要求1~3任意一项所述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述铁源、锌源、多巴胺的摩尔比为1:（2~4）:（15~30）；

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述铁锌掺杂聚多巴胺纳米微球水溶液的浓度为0.20~0.25 mg/ml，所述抗体溶液的浓度为2.0~3.0 mg/ml，所述过氧化物酶溶液的浓度为2.0~3.0 mg/ml；

7.一种比色生物传感器，其特征在于，包括权利要求1~3任意一项所述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶或权利要求4~6任意一项所述制备方法制备得到的双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，以及与所述纳米酶中抗体竞争结合的固定抗原和待测抗原。

8.一种比色生物传感试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任意一项所述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶或权利要求4~6任意一项所述制备方法制备得到的双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶，还包括包被固定抗原的酶标板、过氧化氢、显色底物。

9.权利要求1~3任意一项所述双功能铁锌掺杂聚多巴胺纳米酶、权利要求7所述比色生物传感器或者权利要求8所述比色生物传感试剂盒在非诊断目的酶联免疫吸附检测中的应用。

10.一种非诊断目的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，包括以下步骤：