一种抗谷胱甘肽的双蛋白酶响应金纳米荧光探针及其制备方法

本发明属于纳米生物材料与肿瘤分子诊断，具体涉及一种基于金-炔键（au-c≡c）界面稳定的双蛋白酶响应荧光纳米探针、其制备方法，以及在非小细胞肺癌（nsclc）细胞及组织活性成像与早期分层诊断中的应用。

背景技术：

1、非小细胞肺癌（nsclc）早期诊断是提高患者生存率的关键。现有的影像学及组织活检方法对微小、早期病灶的检测灵敏度与特异性有限，约70%患者确诊时已属晚期。肿瘤发生发展常伴随特定蛋白酶的异常高表达与活性增强，例如基质金属蛋白酶-1（mmp-1）与人中性粒细胞弹性蛋白酶（hne）在nsclc早期即显著上调，且分别参与细胞外基质降解与炎性微环境重塑，二者共表达与肿瘤侵袭性高度相关。

2、然而，现有基于单一蛋白酶标志物的检测策略存在以下缺陷：1）特异性不足：单一标志物在良性病变或个体差异下亦可升高，易导致假阳性。2）细胞内环境干扰：传统基于金-硫醇（au-s）键的纳米探针在高浓度生物硫醇（如谷胱甘肽，gsh）的细胞质中易发生配体置换，导致荧光背景渗漏与信号失真。3）缺乏逻辑判别能力：单一信号无法反映多酶协同的功能状态，难以实现精准的表型分层。

3、因此，亟需开发一种能够抵抗细胞内硫醇干扰、实现多酶活性同步检测并进行逻辑判读的纳米探针，以提高nsclc早期诊断的准确性与特异性。

技术实现思路

1、本发明提供了一种抗谷胱甘肽的双蛋白酶响应金纳米荧光探针及其制备方法，双蛋白酶响应金纳米荧光探针以金纳米颗粒（au nps）为核心，通过稳定的au-c≡c界面共价固定两种荧光标记的酶底物肽，分别响应mmp-1与hne活性，并根据双通道荧光信号实现nsclc细胞与正常细胞的精准区分。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种抗谷胱甘肽的双蛋白酶响应荧光纳米探针，所述双蛋白酶响应荧光纳米探针的结构为(x)n-金纳米颗粒-(y)m，所述x为氨基酸序列如seq idno .1所示的mmp-1底物肽，所述y为氨基酸序列如seq id no .2所示的hne底物肽，所述mmp-1底物肽和hne底物肽的n端分别标记有第一荧光团和第二荧光团，c端均经炔基化修饰后通过au-c≡c键与金纳米颗粒表面共价连接。

4、荧光团因靠近金纳米颗粒而淬灭，在靶酶存在时切割肽链释放荧光团恢复荧光。

5、优选地，seq id no .1的序列为vpmsmrgg；seq id no .2的序列为qpmavvqsvpqk。

6、优选地，所述第一荧光团为荧光素异硫氰酸酯（fitc），所述第二荧光团为5-羧基四甲基罗丹明（5-tamra）。

7、优选地，所述金纳米颗粒的平均直径为10-20 nm。

8、优选地，所述金纳米颗粒的平均直径为15~20 nm。

9、优选地，所述n和m表示每个金纳米颗粒表面负载的肽分子总数，其中500≤n≤600，500≤m≤600。

10、第二方面，本发明提供了上述双蛋白酶响应荧光纳米探针的制备方法，包括：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得金纳米颗粒；将第一荧团光标记的mmp-1底物肽和第二荧光团标记的hne底物肽的末端羧基进行炔基化修饰；在碱性条件下将两种炔基化底物肽与金纳米颗粒共孵育，通过金-炔键自组装形成探针。

11、优选地，所述炔基化修饰包括将第一荧团光标记的mmp-1底物肽和第二荧光团标记的hne底物肽分别溶于乙醇，加入等摩尔比的edc和nhs活化羧基，随后与炔丙胺避光反应不少于24小时，经透析纯化冻干；所述mmp-1底物肽、hne底物肽、edc、nhs和炔丙胺的摩尔比为1：1：63.3：63.3：0.75；

12、优选地，所述自组装包括：取金纳米颗粒溶液，加入naoh调节ph，按比例加入两种炔基化肽链溶液，避光孵育不少于36小时。经离心、洗涤后得到双肽修饰纳米探针；所述金纳米颗粒、炔基化mmp-1底物肽和炔基化hne底物肽的摩尔比为1：1036：128。

13、第三方面，本发明提供了上述双蛋白酶响应荧光纳米探针在制备用于检测非小细胞肺癌试剂或试剂盒中的应用。

14、第四方面，本发明提供了一种非诊断目的鉴别非小细胞肺癌细胞的方法，包括：将待测细胞与上述双蛋白酶响应荧光纳米探针孵育；检测第一荧光团和第二荧光团的荧光信号；若双通道信号均高于预设阈值，则判定细胞具有nsclc恶性特征。

15、优选地，所述待测细胞来源于细胞悬液、组织匀浆或体液。

16、优选地，所述第一荧光团为fitc，第二荧光团为5-tamra，以激发494 nm、发射518nm的波长检测fitc通道的荧光强度，以激发554 nm、发射585 nm的波长检测5-tamra通道的荧光强度；若两个通道的荧光强度均显著高于阴性对照（如正常细胞或缓冲液背景），则判定为双酶阳性，提示样本具有nsclc恶性特征；若任一通道或双通道为阴性，则判定为非恶性表型。进一步可计算双酶活性指数（例如归一化荧光强度乘积或加权和）进行定量分层。

17、优选地，所述孵育时间为1-5小时；所述荧光信号通过共聚焦显微镜或荧光分光光度计检测。

18、优选地，所述孵育条件为在37±2℃、ph 6.2~8.0的条件下孵育。

19、本发明的荧光淬灭机制：完整肽链上的荧光团因靠近金纳米颗粒表面而发生荧光共振能量转移（fret）淬灭，荧光处于“关”状态；当对应蛋白酶特异性切割肽链后，荧光团释放远离金表面，荧光恢复至“开”状态。

20、与现有技术相比，本方案的有益效果：

21、高灵敏度和特异性：本发明制备的双蛋白酶响应金纳米探针通过双底物序列设计确保仅对靶酶响应，检测限低至10ng/ml级别，明显优于传统elisa方法。

22、卓越的胞内稳定性：创新性地采用au-c≡c连接方式，完全抵抗毫摩尔级谷胱甘肽的配体置换，保证细胞内信号的真实性，解决了传统au-s探针的核心缺陷。

23、智能逻辑诊断能力：通过双通道“与”逻辑（and gate）判据，只有同时具有高mmp-1和hne活性的细胞才被判定为阳性，极大降低了单一标志物可能导致的假阳性，实现了对nsclc细胞的功能活性分层。

24、操作简便快速：仅需一步孵育即可实现活细胞内原位检测，无需繁琐的洗涤或二次放大步骤。

25、应用前景广阔：该平台技术具有高度可扩展性，通过更换肽序列即可用于检测其他疾病相关的蛋白酶组合，为肿瘤及其他疾病的精准诊断提供了新的工具。

1.一种抗谷胱甘肽的双蛋白酶响应荧光纳米探针，其特征在于，所述双蛋白酶响应荧光纳米探针的结构为(x)n-金纳米颗粒-(y)m，所述x为氨基酸序列如seq id no .1所示的mmp-1底物肽，所述y为氨基酸序列如seq id no .2所示的hne底物肽，所述mmp-1底物肽和hne底物肽的n端分别标记有第一荧光团和第二荧光团，c端均经炔基化修饰后通过au-c≡c键与金纳米颗粒表面共价连接。

2.根据权利要求1所述的一种抗谷胱甘肽的双蛋白酶响应荧光纳米探针，其特征在于，所述第一荧光团为fitc，所述第二荧光团为5-tamra。

3.根据权利要求1所述的一种抗谷胱甘肽的双蛋白酶响应荧光纳米探针，其特征在于，所述金纳米颗粒的平均直径为10-20nm。

4.根据权利要求1所述的一种抗谷胱甘肽的双蛋白酶响应荧光纳米探针，其特征在于，所述n和m表示每个金纳米颗粒表面负载的肽分子总数，其中500≤n≤600，500≤m≤600。

5.权利要求1-4任一项所述的双蛋白酶响应荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得金纳米颗粒；将第一荧团光标记的mmp-1底物肽和第二荧光团标记的hne底物肽的末端羧基进行炔基化修饰；在碱性条件下将两种炔基化底物肽与金纳米颗粒共孵育，通过金-炔键自组装形成探针。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述炔基化修饰包括将第一荧团光标记的mmp-1底物肽和第二荧光团标记的hne底物肽分别溶于乙醇，加入等摩尔比的edc和nhs活化羧基，随后与炔丙胺避光反应不少于24小时，经透析纯化冻干；所述mmp-1底物肽、hne底物肽、edc、nhs和炔丙胺的摩尔比为1:1:63.3:63.3:0.75。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述自组装包括：取金纳米颗粒溶液，加入naoh调节ph，按比例加入两种炔基化肽链溶液，避光孵育不少于36小时；经离心、洗涤后得到双肽修饰纳米探针；所述金纳米颗粒、炔基化mmp-1底物肽和炔基化hne底物肽的摩尔比为1:1036:128。

8.权利要求1-4任一项所述的双蛋白酶响应荧光纳米探针在制备用于检测非小细胞肺癌试剂或试剂盒中的应用。

9.一种非诊断目的鉴别非小细胞肺癌细胞的方法，其特征在于，包括：将待测细胞与权利要求1-4任一项所述的双蛋白酶响应荧光纳米探针孵育；检测第一荧光团和第二荧光团的荧光信号；若双通道信号均高于预设阈值，则判定细胞具有nsclc恶性特征。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述孵育为在37±2℃、ph 6.2~8.0的条件下孵育为1-5小时；所述荧光信号通过共聚焦显微镜或荧光分光光度计检测。