一种Tb3+配位肽保护金纳米簇及其制备方法和应用

本发明属于纳米材料化学和电化学发光生物传感，具体涉及一种tb3+配位肽保护金纳米簇及其制备方法和应用。

背景技术：

1、电化学发光（ecl）是一种将电能转化为光辐射的分析技术，因其近零光学背景干扰、宽动态范围和高灵敏度，在生物分析领域得到广泛应用。近年来，金纳米簇（au ncs）作为一种介于原子与纳米粒子之间的发光材料，因其离散能级、良好生物相容性和分子般的光物理性质，被视为新一代ecl发光体的理想候选。然而，大多数水溶性金纳米簇缺乏精确的结构和组成定义，这阻碍了清晰结构-性能关系的建立，进而限制了其ecl性能的理性设计和生物医学应用。

2、现有原子精确的金纳米簇（如au25）在ecl效率（φecl）方面存在显著瓶颈，主要受“能隙定律”和表面配体松散堆积的影响。核心振动与表面态的强耦合产生大量非辐射衰减通道，导致严重能量耗散。同时，表面缺陷易将激子捕获至低能“暗态”或低效近红外（nir）途径，进一步淬灭辐射输出。现有调控策略主要集中于加速界面电子转移的动力学调控，例如通过au-n键功能化引入浅电子陷阱态，以协调体相发光体快速电子转移与共反应物缓慢氧化还原反应的时间尺度，从而提升某些材料的ecl效率。然而，这些策略往往忽略了对非辐射衰减的热力学抑制，难以实现电子转移动力学与辐射衰减动力学的内在协调，导致ecl效率提升有限。

3、此外，阳离子添加工程虽被用于调控金属纳米簇的几何和电子结构，如通过铜掺杂抑制非辐射衰减并增强系间窜越，但此类合金纳米簇水溶性差、对氧敏感，限制了其在生物医学领域的实际应用。针对特定生物标志物如结缔组织生长因子（ctgf，一种与纤维化和神经退行性疾病相关的基质细胞蛋白）的检测，现有的肽保护金纳米簇虽可实现靶向识别和成像，但未涉及ecl性能，无法满足超灵敏检测需求。检索结果显示，现有技术（如lu etal., nat commun 15, 5000, 2024，doi: 10.1038/s41467-024-49409-4）报道了相同序列肽保护的金纳米簇用于ctgf靶向nir-ii成像，但未涉及tb3+配位修饰或ecl性能提升；其他镧系离子与金纳米簇的相互作用研究（如tb3+与谷胱甘肽保护簇的聚集诱导发光）仅限于荧光增强和稳定性，未实现对非辐射衰减通道的针对性抑制和ecl效率的显著提高；合金化或压力调控策略虽可提升近红外发光，但均未结合表面镧系配位实现热力学与动力学的协同调控。因此，亟需开发一种新型策略，在保持金核心结构不变的前提下，通过表面配位抑制非辐射衰减、重新配置发光途径，同时集成分子识别和高效率ecl功能，以实现对ctgf等生物标志物的超灵敏检测。

4、需要说明的事，现有技术中，上文提到的lu et al.（nat. commun., 2024）报道了一种使用与本发明相同序列的环肽（cys-asp-ala-gly-arg-lys-gln-lys-cys）作为配体的金纳米簇探针（au26dag8），该探针可实现对ctgf的nir-ii成像和多模态分析。其制备条件为在55℃下避光密封反应5小时，氢氧化钠溶液浓度为0.5 mm，且未涉及tb3+配位修饰，亦未公开电化学发光（ecl）性能或基于ecl的免疫传感器应用（参见该文献第2页制备方法及maldi-tof-ms数据）。

5、此外，huang et al.（anal. chem., doi: 10.1021/acs.analchem.4c06529）公开了tb3+离子与金纳米簇结合以提升荧光性能的技术，通过tb3+与配体形成tb-o和tb-n键实现壳层刚性化和非辐射衰减抑制，但其采用的是小分子att配体（而非肽类配体），tb3+为反应后添加方式，且未形成网状超结构，亦未涉及ecl性能提升或ctgf免疫检测应用（参见该文献摘要及制备部分）。现有关于tb³⁺或其它金属离子掺杂提升au ncs ecl性能的研究（如上海师范大学学位论文《金纳米团簇增强电致化学发光策略的研究及生物小分子的检测》），亦未披露tb3+介导的肽壳表面配位所形成的网络状超结构、精确au25核心保留以及分子识别与高效率ecl发射的“三位一体”集成。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种tb3+配位肽保护金纳米簇。

2、本发明的另一目的在于提供上述tb3+配位肽保护金纳米簇的制备方法。

3、本发明的再一目的在于提供上述tb3+配位肽保护金纳米簇的应用。

4、本发明的技术方案如下：

5、一种tb3+配位肽保护金纳米簇，其分子式为au25peptide9tb20，核心为由25个金原子构成的金核au25，如seq id no.01的多肽通过其具有的二cys的-sh与金核au25形成双齿配位，从而包绕金核au25形成肽壳，20个tb3+与该多肽形成的肽壳中的主要为asp残基的羧基氧原子的含氧官能团形成强配位键，并与多肽形成的肽壳中的含氮官能团形成辅助配位键，从而介导多个au25peptide9tb20单元形成网状超结构，该含氮官能团为cys残基和lys残基的侧链氮原子。

6、在本发明的一个优选实施方案中，所述au25的平均粒径为1.15 nm，晶格条纹d间距为0.237 nm，对应面心立方金的（111）晶面。

7、在本发明的一个优选实施方案中，au与tb的摩尔比为1: 0.75-0.80。

8、上述tb3+配位肽保护金纳米簇的制备方法，其特征在于：包括：将氯金酸逐滴加入所述多肽的溶液中，加入柠檬酸钠溶液和氢氧化钠溶液混匀后，再加入tbcl3，避光于54-56℃反应10-14 h，随后透析纯化，即得。

9、在本发明的一个优选实施方案中，所述多肽的溶液的浓度为0.8-1.2 mg/ml，所述柠檬酸钠溶液的浓度为38-42 mm，所述氢氧化钠溶液的浓度为2.4-2.6 m。

10、进一步优选的，所述tbcl3溶液的浓度为18-22 mm。

11、在本发明的一个优选实施方案中，所述透析纯化采用截留分子量为3 kda的透析袋进行。

12、上述tb3+配位肽保护金纳米簇作为电化学发光探针的用途。

13、上述tb3+配位肽保护金纳米簇在制备用于检测结缔组织生长因子的电化学发光免疫传感器中的用途。

14、在本发明的一个优选实施方案中，所述电化学发光免疫传感器为夹心型免疫传感器，其中所述tb3+配位肽保护金纳米簇作为信号探针，通过其上的多肽与ctgf的特异性结合形成ab/ctgf/ au25peptide9tb20免疫复合物。

15、在本发明的技术方案中，所述tb3+配位肽保护金纳米簇通过特定序列九肽（seq idno.01）与au25金核的双齿配位以及20个tb3+离子介导的簇内和簇间配位，形成了区别于现有技术的精确au25peptide9tb20分子式及网络状超结构。本发明在保持金核心结构不变的前提下，通过tb3+与肽壳含氧、含氮官能团的特异性配位（主要为asp残基羧基氧原子及cys、lys残基侧链氮原子），实现了表面刚性化、非辐射衰减抑制及发光路径重构，同时集成分子识别与高效率电化学发光（ecl）功能。与现有技术相比，本发明不仅克服了lu et al.（nat.commun., 2024）所公开的au26dag8探针仅限于nir-ii成像且未涉及tb3+修饰或ecl应用的局限，还不同于huang et al.（anal. chem., doi: 10.1021/acs.analchem.4c06529）采用小分子att配体及后添加tb3+的方式，形成了本领域前所未有的“三位一体”ecl探针特性，从而为ctgf等生物标志物的超灵敏检测提供了新的技术方案。

16、本发明的有益效果是：

17、1、本发明通过tb3+与肽壳羧基的强配位，实现表面刚性化，有效钝化缺陷、抑制低效nir-ii发射途径，将激发能导向高效nir-i辐射通道，非辐射衰减速率降低57.3%，荧光量子产率从12.5%提升至24.15%（提升93.2%），荧光寿命从71.75 μs延长至145.74 μs（提升103.1%），为辐射复合提供更充足时间。该配位方式形成的网络状超结构（实施例1 tem、dls表征）是lu et al.（doi: 10.1038/s41467-024-49409-4）和huang et al.（doi: 10.1021/acs.analchem.4c06529）未曾公开的，产生了非预见性的协同刚性化效果。

18、2、本发明尽管界面电子转移略有减弱，但内在发光效率的跃升主导ecl性能，ecl量子产率从3.9%大幅提升至22.53%（提升477.7%），突破了传统仅依赖动力学调控的局限，揭示了发光效率而非电子转移主导ecl输出的新机制。

19、3、本发明制备的金纳米簇不仅具有近红外二区荧光发射，还具有近红外二区ecl发射，实现了荧光与ecl双模态发光特性。

20、4、本发明中tb3+介导的簇间和簇内交联形成网络状超结构，增加表面正电荷（zeta电位从2.77 mv升至8.00 mv），网状结构内部疏水作用力增强对共反应物tea的富集，降低激态扩散损失，进一步协同提升ecl强度。

21、5、本发明利用特定序列肽作为配体，实现分子识别、高效率ecl发射和信号放大的“三位一体”集成，无需额外抗体偶联，简化传感器构建，提高电子隧穿概率。

22、6、基于本发明构建的夹心型ecl免疫传感器对ctgf检测限达337.28 fg/ml，线性范围覆盖0.63 pg/ml-100 ng/ml，具有优异选择性（对aβ40、gfap、nfl、tau-181等干扰物无明显响应）、稳定性（4℃储存4周后信号无显著衰减）和实际样品适用性（人血清回收率87.9%-107.0%，rsd≤8.0%），显著优于现有金纳米簇ecl探针。