稳定的干扰素融合蛋白制剂及其应用的制作方法

1.本公开属于蛋白的药物制剂领域，特别涉及稳定的a-01制剂及其应用。


背景技术：

2.目前，生物技术的进步使之可能使用重组dna技术来生产多种蛋白或多肽，作为药物应用于各种疾病的治疗。由于多种物理不稳定性(包括变性以及形成可溶性或不可溶性聚集体等)，以及多种化学不稳定性(例如水解、氧化、以及脱酰胺作用等)，这些蛋白或多肽可能失去它们潜在的生物活性。
3.为了使蛋白药物维持生物学活性，制剂必须至少使蛋白质氨基酸的核心序列的构象完整性保持完整，同时保护蛋白质的多种官能团免于降解。在液体制剂药物中这些蛋白的稳定性可能受多种因素影响，例如ph、离子强度、温度、冷冻-融化重复循环、以及暴露于机械剪切力(例如在处理过程中发生的)。由于物理搅拌以及在溶液中以及在储存小瓶中液-气界面处蛋白分子的相互作用，也可能发生聚集体形成和生物活性降低或丧失。
4.冻干制剂的优势在于其通常比在溶液中的同样材料在储存和运输期间更稳定，具有更长的存放时间。然而，冻干存在一些问题，因为在冷冻和干燥过程期间可能发生对待保存的活性物质的损害。这些问题在一定程度上通过向待冻干的材料加入冷冻保护剂和冻干保护剂来解决。然而，认识不足的是，一些不稳定、易降解的物质，尤其是包括至少一个游离半胱氨酸残基的肽，即使在冻干过程完成后，仍然容易发生降解和损害。
5.需要一种稳定的液体制剂或冻干制剂，以防止蛋白质在使用之前的生产、储运期间由于随时间变性、氧化或者聚集等作用所致活性或者结构完整性的丧失。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的问题，本公开提供了一种稳定的蛋白制剂，其能够保证人干扰素α-2b fc融合蛋白在制备、运输及储存过程中保持良好的稳定性，具有更好的临床用药安全性及质量可控性。
7.在一方面，本公开提供了一种稳定的蛋白制剂，按质量份数计，其包含：
[0008][0009]
在一方面，本公开提供了一种前述蛋白制剂的冻干剂的制备方法。
[0010]
在一方面，本公开提供了前述蛋白制剂在制备治疗病毒性肝炎、肿瘤、血液病、皮肤性病、病毒性角膜炎、慢性宫颈炎以及其他病毒感染性疾病等领域的疾病的药物中的用途。例如在制备治疗(1)慢性乙型肝炎；(2)慢性丙型肝炎；(3)慢性丁型肝炎；(4)喉乳头状瘤；(5)毛细胞白血病；(6)慢性髓细胞性白血病cml；(7)与慢性髓细胞性白血病cml有关的
血小板增多症；(8)多发性骨髓瘤；(9)非何杰金淋巴瘤；(10)艾滋病有关的卡波氏肉瘤；(11)肾细胞癌；(12)转移性类癌瘤(胰腺内分泌肿瘤)；(13)恶性黑色素瘤等疾病的药物中的用途。
附图说明
[0011]
图1示出了elisa法测定a-01酶切前/后的结合活性图谱。
[0012]
图2示出了报告基因法测定a-01酶切前/后的细胞生物学活性图谱。
[0013]
图3示出了a-01体外增殖抑制活性测定曲线。
[0014]
图4示出了增殖抑制活性作用机理研究曲线。
[0015]
图5示出了给药后各组肿瘤体积增长趋势图。其中，箭头代表各给药时间。
[0016]
图6示出了a-01预制剂(pre-formulation)ph筛选dsc结果。
[0017]
图7示出了a-01预制剂ph筛选2-8℃2个月外观结果。
[0018]
图8示出了a-01制剂ph筛选热稳定性(dsc)结果。
[0019]
图9示出了a-01制剂ph筛选sec-hplc聚体结果。
[0020]
图10示出了a-01制剂ph筛选非还原ce-sds片段结果。
[0021]
图11示出了a-01制剂ph筛选elisa结合活性40℃1个月结果。
[0022]
图12示出了a-01制剂(liq9)ph范围表征sec-hplc聚体结果。
[0023]
图13示出了a-01制剂(liq9)ph范围表征非还原ce-sds片段结果。
[0024]
图14示出了a-01制剂(liq6)添加edta-2na的处方与对照处方的加速样品聚体比较。
[0025]
图15示出了a-01制剂(liq6)添加edta-2na的处方与对照处方的加速样品片段比较。
[0026]
图16示出了a-01制剂(liq7)dsc图谱。
[0027]
图17示出了a-01制剂(liq7)在50
±
2℃14天聚体(sec-hplc)结果。
[0028]
图18示出了a-01制剂(liq7)在40
±
2℃1个月聚体(sec-hplc)结果。
[0029]
图19示出了a-01制剂(liq7)在50
±
2℃day14片段(非还原ce-sds)结果
[0030]
图20示出了a-01制剂(liq7)在40
±
2℃1个月片段(非还原ce-sds)结果。
[0031]
图21示出了a-01制剂(liq7)处方f3，f4，f7在40
±
2℃1个月非还原ce-sds图谱。其中，所述图22直观呈现片段，是对图21的补充，呈现出40
±
2℃加速1个月f7片段略少于f3和f4，f3和f4片段含量无明显差异。
[0032]
图22示出了a-01冻干制剂(lyo5)外观。
[0033]
图23示出了a-01液体制剂(liq11)50℃14天聚体(sec-hplc)结果。
[0034]
图24示出了a-01液体制剂(liq11)50℃14天片段(非还原ce-sds)50℃加速结果。
[0035]
图25示出了a-01液体制剂(liq11 f1～f5)在50
±
2℃加速14天非还原ce-sds图谱。其中，所述图26直观呈现片段，与图25共同呈现出50
±
2℃加速14天后f5片段含量增长最为缓慢。
[0036]
图26示出了a-01冻干制剂外观。其中：f1：左上图，f2：右上图，f3：左下图，f4：右下图。
[0037]
图27示出了a-01制剂的冻干制品外观。
[0038]
图28示出了a-01制剂的冻干曲线。
具体实施方式
[0039]
i.定义
[0040]
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
[0041]
配制的干扰素α-2b fc融合蛋白优选是基本上纯的(essentiallypure)，并且理想的是基本上均质的(即不含污染性蛋白等)。“基本上纯的”蛋白质意指基于组合物的总重量，按重量计包含至少约90％(优选按重量计至少约95％)的蛋白质的组合物。“基本上均质的”蛋白质意指基于组合物的总重量，按重量计包含至少约99％的蛋白质的组合物。
[0042]
制剂中干扰素α-2b fc融合蛋白的完整性在作为液体或作为冻干产品在不同条件下长期储存后通常得到保持。例如，所述干扰素α-2b fc融合蛋白的完整性在暴露于范围较宽的储存温度(例如，-80℃至40℃)、剪切应力(例如，振荡)和界面应力(冻-融循环)之后得到充分保持。对于冻干材料，干扰素α-2bfc融合蛋白的完整性在复原过程中得到充分保持。
[0043]
术语“或”用于本文意指术语“和/或”并且与术语“和/或”可以互换使用，除非上下文明确地指出其他情况。
[0044]
术语“蛋白/蛋白质”和“多肽”在本文可以互换使用。
[0045]“约”和“大约”应通常意指鉴于测量的性质或精确度产生的所测量量的可接受程度的误差。示例性误差程度通常为给定数值或数值范围的百分之二十(20％)之内，10％之内，并且更通常为5％之内。
[0046]
本公开制剂可包含“稳定剂”、“冻干保护剂”、“糖”、“氨基酸”、“多元醇”、“抗氧化剂”、“防腐剂”、“表面活性剂”、“缓冲液”和/或“张度剂”。
[0047]
本文所用术语“稳定剂”表示保护活性药物成分和/或制剂避免在制造、储存和应用期间发生化学和/或物理降解的药学上可接受的赋形剂。稳定剂包括但不限于：糖、氨基酸、多元醇、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂，环糊精如羟丙基-β-环糊精、磺基丁基乙基-β-环糊精、β-环糊精，聚乙二醇如peg3000、3350、4000、6000，白蛋白如人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)，盐如氯化钠、氯化镁、氯化钙，螯合剂如edta，如下文所定义。如上所述，制剂中稳定剂的含量约为10-500mm，优选约10-300mm，更优选约100-300mm。
[0048]
本文所用术语“冻干保护剂”表示能够在冻干过程、后续的储存和重建期间保护不稳定的活性成分(例如蛋白质)对抗失稳条件的药学上可接受的赋形剂。冻干保护剂包括但不限于：糖、多元醇(例如糖醇)和氨基酸。优选的冻干保护剂可选自下组：糖如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖和棉子糖，神经氨酸和半乳糖胺，氨基糖如葡糖胺、n-甲基葡糖胺(“葡甲胺”)，多元醇(如甘露醇)和氨基酸(如精氨酸)。冻干保护剂通常的用量约为10-500mm，优选约10-300mm，更优选约100-300mm。
[0049]
本文所用术语“糖”表示药学上可接受的碳水化合物，用量通常约为10-500mm，优选约10-300mm，更优选约100-300mm。合适的糖包括但不限于：海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、n-甲基葡糖胺(称为“葡甲胺”)、半
乳糖胺和神经氨酸。优选的糖是蔗糖和海藻糖，更优选海藻糖。
[0050]
本文所用术语“氨基酸”在药学胃肠外制剂中表示在相对羧酸基团的α位置上具有氨基部分的药学上可接受的有机分子。氨基酸包括但不限于：精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸以及它们的组合。氨基酸通常的用量约为10-500mm，优选约10-300mm，更优选约100-300mm。
[0051]
本文所用术语“多元醇”表示具有一个以上羟基的药学上可接受的醇。多元醇的用量约为10-500mm，优选约10-300mm，更优选约100-300mm。合适的多元醇包括但不限于：甘露醇、山梨醇、甘油、葡聚糖、丙三醇、阿拉伯醇、丙二醇、聚乙二醇以及它们的组合。
[0052]
本文所用术语“抗氧化剂”表示能够防止活性药物成分的氧化的药学上可接受的赋形剂。抗氧化剂的用量约为1-100mm，优选约5-50mm，更优选约5-20mm。抗氧化剂包括但不限于：抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、edta以及它们的组合。
[0053]
本文所用术语“防腐剂”表示能够防止制剂中微生物的生长的药学上可接受的赋形剂。例如，在多剂量制剂中加入防腐剂能够保护制剂对抗微生物污染。防腐剂通常的用量约为0.001-2％(w/v)。防腐剂包括但不限于：乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵以及它们的组合。
[0054]
本文所用术语“表面活性剂”表示药学上可接受的表面活性剂。在本公开的制剂中，表面活性剂的量以重量/体积百分比(w/v％)表示。合适的药学上可接受的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(苄泽)、烷基苯基聚氧乙烯醚(曲通-x(triton-x))、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆、普流罗尼)和十二烷基硫酸钠(sds)。优选的聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯20(以商品名吐温20
tm
销售)和聚山梨酯80(以商品名吐温80
tm
销售)。优选的聚乙烯-聚丙烯共聚物是以商品名普流罗尼f68和泊洛沙姆188
tm
销售的共聚物。优选的聚氧乙烯烷基醚是以商品名苄泽
tm
销售的物质。优选的烷基酚聚氧乙烯醚是以商品名曲通-x销售的物质。如果使用聚山梨酯20(吐温20
tm
)和聚山梨酯80(吐温80
tm
)，它们通常的用量约为0.001-1％，优选约0.005-0.1％，更优选约0.01-0.04％w/v。
[0055]
本文所用术语“缓冲液”表示能使药物制剂的ph稳定的药学上可接受的赋形剂。合适的缓冲液是本领域公知的，可参见文献所述。优选的药学上可接受的缓冲液包括但不限于：组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。甚至更优选的缓冲液包括l-组氨酸或l-组氨酸和l-盐酸组氨酸的混合物，用本领域已知的酸或碱进行ph调整。上述组氨酸缓冲液通常的用量约为1-100mm，优选约5-50mm，甚至更优选约10-20mm。可以不考虑所用缓冲液，使用本领域已知的酸或碱，例如盐酸、醋酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾将ph调节至约4.0-7.0的值，优选约5.0-6.0，甚至更优选约5.5。
[0056]
本文所用术语“张度剂”表示药学上可接受的张度剂。张度剂用于调节制剂的张度。制剂可以是低渗、等渗或高渗的。等渗性一般涉及与人血清溶液有关的渗透压。本公开制剂可以是低渗、等渗或高渗的，但优选等渗。为清楚起见，再一次强调的是，等渗制剂是液体或由固体形式(例如由冻干形式)重建的液体，表示与比较的一些其他溶液(例如生理盐水和血清)具有相同张度的溶液。合适的等渗性试剂包括但不限于：氯化钠、氯化钾、甘油和选自氨基酸、糖、尤其是本文所限定的葡萄糖的任意组分以及它们的组合。张度剂的用量约
为5-500mm。
[0057]
本文所用术语“液体”与本公开制剂联用时表示在标准压力下和至少约2-8℃的温度下为液体的制剂。
[0058]
本文所用术语“冻干”与本公开制剂联用时表示通过本领域已知的冷冻干燥方法制造的制剂。溶剂(例如水)的去除方法包括：冷冻然后真空升华，残余水在升高的温度下解吸。在药学领域，冻干物中残留水分通常约为0.1-5％(w/w)，以粉末或物理稳定的饼状物形式存在。冻干物的特征在于，加入重建介质后快速溶解。
[0059]
本文所用术语“重建制剂”与本公开制剂联用时表示冻干并通过加入重建介质重新溶解的制剂。重建介质包括但不限于：注射用水(wfi)、注射用抑菌水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨酯20)、ph-缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲溶液)以及它们的组合。
[0060]
本文所用术语“稳定制剂”与本公开制剂联用时表示在制造、储存和应用过程中保持其物理和化学完整性的制剂。稳定性的评价包括在选定的气候条件下储存选定的时间，通过施加机械应力如以选定的振荡频率振荡选定的时间，通过用选定的光强度照射选定的时间，或者通过在选定的温度下重复冻融过程。
[0061]
本文所用术语“药学上可接受的”与本公开制剂联用时表示符合药品的现有国际标准要求的制剂。药学上可接受的制剂包含通常认为对于预期施用途径和浓度范围而言是安全的赋形剂。此外，还应提供在制造、储存和应用期间足够的稳定性。具体说，用于胃肠外给药途径的制剂应满足与人血组成相匹配的等渗性和中性(euhydric)ph要求。
[0062]
ii.干扰素融合蛋白
[0063]
本公开所述的干扰素融合蛋白的氨基酸序列选自seq id no 1-13中的任一个。其中，a-01是一种重组人ifnα-2b干扰素融合蛋白药物，ifnα-2b的n端通过可被特异性的mmps酶切的多肽连接子与ifnra2胞外区的c端连接，然后将ifnα-2b的c端与人igg1fc相连，形成对称的双价fc融合蛋白结构，其氨基酸序列如seq id no 1所示，即a-01蛋白的氨基酸序列依次按照ifnra2胞外区-多肽连接子-ifnα-2b-fc的顺序连接。其中，ifnra2胞外区(ifn-α-r2-ecd)的氨基酸序列如seq id no 14所示；多肽连接子(substrat(linker))的氨基酸序列seq id no 15所示；ifnα-2b的氨基酸如seq id no 16所示；fc的氨基酸序列如seq id no 17所示。此外，ifnra2胞外区(ifn-α-r2-ecd)的n端还可与信号肽相连，该信号肽的氨基酸序列如seq id no 18所示。
[0064]
重组蛋白的表达主要包括三个步骤，一是基因的克隆及细胞株的构建，二是重组细胞培养，三是目的产物的分离纯化等。通过将a-01的氨基酸序列进行密码子优化，将完善好的dna序列进行全基因合成，获得携带目的基因的质粒，将携带目的基因的质粒经过“酶切
→
连接
→
转化
→
筛选
→
鉴别”完成a-01重组质粒构建，通过系列克隆筛选获得能够稳定表达目标蛋白的单克隆细胞株。通过中国仓鼠卵巢(cho)细胞作为宿主细胞进行目的蛋白表达，经细胞培养、多步骤的纯化工序获得高纯度的干扰素融合蛋白。
[0065]
iii.冷冻干燥
[0066]
在一个方面，包含本公开干扰素α-2b fc融合蛋白的所述制剂在给药前被冷冻干燥。使用本领域通用技术进行冷冻干燥，并应针对所开发的组合物进行优化。
[0067]
本公开干扰素融合蛋白冻干剂通过将所述蛋白制剂冷冻干燥得到。所述冷冻干燥
包括以下步骤：
[0068]
(1)预冻；(2)退火；(3)二次冷冻；(4)一次干燥；(5)二次干燥。
[0069]
具体地，所述冷冻干燥包括以下步骤：
[0070]
(1)将所述液体蛋白制剂在≤-40℃的温度下预冻1-4小时；
[0071]
(2)在高于产品的玻璃化转变温度tg’的温度下退火2-3小时；
[0072]
(3)在≤-40℃的温度下二次冷冻1-4小时；
[0073]
(4)真空度100-300μbar条件下干燥2-3小时，干燥温度低于其崩解温度；
[0074]
(5)25-30℃，真空度20μbar条件下二次干燥至少6小时，干燥盒充氮压塞。
[0075]
所述液体蛋白制剂为原液经稀释后过滤、灌装、加塞、轧盖、灯检后包装得到。
[0076]
步骤(2)所述退火操作的目的是为改变冰晶的形态和大小分布以及非晶态基质的形态和浓度，从而影响后续的干燥过程和得到的冻干药品品质。
[0077]
iv.本公开制剂
[0078]
任何合适的干扰素融合蛋白都可以用于制备本公开的组合物。
[0079]
在一方面，本公开提供了一种稳定的蛋白制剂，按质量份数计，其包含：
[0080][0081]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含：
[0082][0083]
在一些实施方式中，干扰素融合蛋白为干扰素α-2b fc融合蛋白；
[0084]
在一些实施方式中，干扰素融合蛋白包含与seq id no.1-13任一个所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，干扰素融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1-13任一个所示序列；
[0085]
在一些实施方式中，蛋白制剂是液体形式、冻干形式或从冻干形式重建的液体形式。
[0086]
在一些实施方式中，蛋白制剂是液体形式，缓冲剂可为缓冲液。
[0087]
在一些实施方案中，缓冲液选自组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。
[0088]
在一些实施方案中，组氨酸缓冲液包含组氨酸或组氨酸和盐酸组氨酸的混合物；更优选地，组氨酸缓冲液为包含组氨酸和盐酸组氨酸的混合物。
[0089]
在一些实施方案中，组氨酸缓冲液包括l-组氨酸或l-组氨酸和l-盐酸组氨酸的混合物；更优选地，组氨酸缓冲液为包含l-组氨酸和l-盐酸组氨酸的混合物。
[0090]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含组氨酸1.7-4.5份。
[0091]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含盐酸组氨酸0.9-2.4份。
[0092]
在一些实施方案中，糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、n-甲基葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸或其组合。
[0093]
在一些实施方案中，糖是海藻糖；更优选地，海藻糖是二水海藻糖。
[0094]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含海藻糖44-89份。
[0095]
在一些实施方案中，氨基酸选自精氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、脯氨酸以及它们的组合。
[0096]
在一些实施方案中，氨基酸为精氨酸。
[0097]
在一些实施方案中，氨基酸为精氨酸和谷氨酸。
[0098]
在一些实施方案中，氨基酸为精氨酸和甲硫氨酸。
[0099]
在一些实施方案中，精氨酸的盐为盐酸精氨酸。
[0100]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含精氨酸或其盐18-50份；更优选地，蛋白制剂包含精氨酸或其盐20-43份。
[0101]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含谷氨酸或其盐17-45份；更优选地，蛋白制剂包含谷氨酸或其盐13-20份。
[0102]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含甲硫氨酸或其盐0.5-18份；更优选地，蛋白制剂包含甲硫氨酸或其盐1.2-2份。
[0103]
在一些实施方案中，抗氧化剂选自依地酸或其盐、抗坏血酸或其盐、谷胱甘肽或其盐、半胱氨酸或其盐、甲硫氨酸或其盐、柠檬酸或其盐以及它们的组合。
[0104]
在一些实施方案中，依地酸的盐为依地酸二钠和依地酸钙钠。
[0105]
在一些实施方案中，依地酸的盐为依地酸二钠。
[0106]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含依地酸或其盐0.2-0.5份。
[0107]
在一些实施方案中，表面活性剂选自聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(苄泽)、烷基苯基聚氧乙烯醚(曲拉通-x(triton-x))、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆、普流罗尼)和十二烷基硫酸钠(sds)。
[0108]
在一些实施方案中，聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯20或聚山梨酯80。
[0109]
在一些实施方案中，表面活性剂为聚山梨酯20。
[0110]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯0.2-0.5份。
[0111]
在一些实施方案中，蛋白制剂的渗透压为300-600mosmol/kg，优选为约350mosmol/k。
[0112]
在一些实施方案中，蛋白制剂ph范围是ph6.0～6.6，优选ph为6.3。
[0113]
在一些实施方案中，蛋白制剂中，二水海藻糖浓度为44.2mg/ml，盐酸精氨酸浓度为100mm，甲硫氨酸浓度为10mm。
[0114]
在一些实施方案中，蛋白制剂中，精氨酸浓度为150mm，谷氨酸浓度为150mm。
[0115]
在一些实施方案中，蛋白制剂中，精氨酸浓度为150mm，甲硫氨酸浓度为10mm。
[0116]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含150mm精氨酸，150mm醋酸，80mg/ml二水海藻糖，
0.5mg/ml依地酸二钠，0.2mg/ml聚山梨酯20，ph 6.5。
[0117]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含20mm醋酸-醋酸钠，80mg/ml二水海藻糖，0.5mg/ml依地酸二钠，0.2mg/ml聚山梨酯20，ph 6.5。
[0118]
在一些实施方案中，蛋白制剂包含2mg重组干扰素α-2b fc融合蛋白，2.217mg组氨酸，1.198mg盐酸组氨酸，44.2mg二水海藻糖，21.07mg盐酸精氨酸，0.2mg依地酸二钠，1.49mg甲硫氨酸，0.2mg聚山梨酯20，ph6.3。
[0119]
在一些实施方案中，蛋白制剂时冻干形式。
[0120]
在一些实施方案中，冻干形式的蛋白制剂是由液体形式的蛋白制剂冻干后形成的制剂。
[0121]
v.本公开的治疗用途
[0122]
本公开内容涉及医学、肿瘤学和免疫治疗学等领域，其中主要涉及病毒性肝炎、肿瘤、血液病、皮肤性病、病毒性角膜炎、慢性宫颈炎以及其他病毒感染性疾病等领域的疾病治疗，例如：(1)慢性乙型肝炎；(2)慢性丙型肝炎；(3)慢性丁型肝炎；(4)喉乳头状瘤；(5)毛细胞白血病；(6)慢性髓细胞性白血病cml；(7)与慢性髓细胞性白血病cml有关的血小板增多症；(8)多发性骨髓瘤；(9)非何杰金淋巴瘤；(10)艾滋病有关的卡波氏肉瘤；(11)肾细胞癌；(12)转移性类癌瘤(胰腺内分泌肿瘤)；(13)恶性黑色素瘤等。
[0123]
通过下列若干实例进一步阐释本公开。这些实例仅出于例示性目的而提供。不应将其理解为以任何方式限制本公开的范围或内容。
[0124]
实施例
[0125]
实施例1干扰素融合蛋白的制备
[0126]
将构建好的携带目的基因的质粒转染进cho-s宿主细胞，通过一系列筛选步骤获得能稳定表达蛋白的单克隆细胞株，并建立细胞库，用于常规的生产；生产过程主要包括细胞培养及蛋白纯化，将冻存的工作细胞经细胞复苏、摇瓶培养、wave培养、200l生物反应器培养过程，经过一定时间的培养，获得含有目标蛋白的细胞培养液；细胞培养液经过多步的层析、病毒灭活、病毒过滤、超滤/透析等步骤获得高纯度的a-01蛋白原液，用于a-01蛋白制剂的制备。
[0127]
1、结合活性(elisa法)
[0128]
实验目的：本研究考察a-01蛋白与人ifnar2的结合活性。
[0129]
实验方法：取a-01蛋白原液与mmp-14，用酶解缓冲液(50mm tris、3mm cacl2、1μm ph为7.0的zncl2)分别稀释至288μg/ml、12μg/ml，按1∶1比例混合，用封口膜封好，37℃酶解过夜(24
±
4h)。使用pbs(10mm，ph 7.4)将人ifnar2稀释至1μg/ml，再将稀释好的ifnar2包被于酶标板(costar，cat#：9018)中，100μl/孔，2-8℃孵育过夜(19h)。pbst洗涤两次后，封闭液(含1％脱脂奶粉的pbst)封闭1小时，300μl/孔。使用pbst将酶解前后样品稀释至5000ng/ml，并进行2倍梯度稀释。将梯度稀释的样品加入酶标板中，100μl/孔，室温孵育2小时。pbst洗涤四次后加入酶标二抗(jackson，cat#：109-035-008；pbst 1∶10000稀释)，100μl/孔，室温孵育1小时。pbst洗涤四次后，加入显色液(0.01％tmb and 0.0035％h2o2，0.02m醋酸钠-柠檬酸缓冲液，ph 5.6)，100μl/孔，显色30分钟。0.2m硫酸终止反应，50μl/孔，酶标仪上读取od450nm和od620nm(参比波长)。
[0130]
实验结果：酶切后a-01蛋白可与人ifnar2结合，ec50为155.36ng/ml，未酶切a-01
蛋白原液对照与人ifnar2不结合(图1)。
[0131]
2、细胞生物学活性(报告基因法)
[0132]
实验目的：本研究考察a-01蛋白原液的细胞生物学活性。
[0133]
实验方法：取a-01蛋白原液与mmp-14，用酶解缓冲液(50mm tris、3mm cacl2、1μm ph为7.0的zncl2)分别稀释至288μg/ml、12μg/ml，按1∶1比例混合，用封口膜封好，37℃酶解过夜(24
±
4h)。将酶解前后样品用检测缓冲液分别稀释至82.8nm，然后进行梯度稀释，浓度依次为82.8、41.4、20.7、5.16、1.29、0.323、0.081、0.02、0.005、0.001、0.0003、0.00008nm；收集293h-isre-luc重组细胞，按4万/孔接种到96孔全白细胞板，将上述稀释的各浓度供试品加入细胞板，于37℃、5％co2培养箱湿盒培养18h～24h；将萤光素酶试剂平衡至室温，用多道移液器吸去96孔全白细胞板中的上清液，将萤光素酶试剂按70μl/孔加入细胞板中，200～500rpm室温震荡避光反应10min～30min；多功能酶标仪测定化学发光rlu值。以光单位值(rlu)为纵坐标，以抗体浓度为横坐标，使用softmax软件进行四参数逻辑拟合分析半数有效浓度(ec50)。
[0134]
实验结果：报告基因法测得酶切激活后a-01蛋白可结合细胞表面ifnr，产生相应的细胞生物学活性，ec50为0.929nm，a-01未酶切对照没有充分激活报告基因信号，表明未酶切a-01基本无ifn生物学活性，经mmp-14特异性酶切后，a-01展现出ifn生物学活性(图2，表1)。
[0135]
表1 酶切前后a-01的细胞生物学活性测定结果
[0136]
名称批号ec
50
(nm)酶切前a-012019004pr-vfn/a酶切后a-012019004pr-vf0.929
[0137]
3、肿瘤细胞增殖抑制活性(ad-tr-a0110)
[0138]
实验目的：本研究通过考察酶切激活后a-01的细胞增殖抑制活性以及促进肿瘤细胞凋亡活性，验证其药效(文献报道ifnα可以通过阻滞细胞周期进而抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞的凋亡)。
[0139]
实验方法：收集mda-mb-231细胞，用检测培养液(5％fbs dmem培养液)将细胞密度调整至4
×
105个/ml，按50μl/孔接种到96孔透明细胞板中，于37℃、5％co2培养箱培养1.0h；取15.56μm ifn-fc用检测培养液进行梯度稀释，稀释因子第2列为10，第3～5列为2，第6～12列为10；将上述稀释的各浓度供试品加入细胞板，于37℃、5％co2培养箱湿盒培养72
±
6h。
[0140]
增殖抑制活性检测：将cck-8试剂平衡至室温，将cck-8溶液与检测培养液按1∶2比例混匀，按30μl/孔加入细胞板中，37℃避光反应4
±
1h；多功能酶标仪测定od450值。以od450读值为纵坐标，以药物浓度为横坐标，使用softmax软件进行四参数逻辑拟合分析半数抑制浓度(ic
50
)。
[0141]
促进肿瘤细胞凋亡活性检测：按20μl/孔将viability/cytotoxicity试剂加入细胞板中，300rpm振摇30s后，于37℃避光反应30min，多功能酶标仪测定各孔荧光强度(viability：激发波长360nm，发射波长505nm；cytotoxicity：激发波长485nm，发射波长520nm)；之后将caspase-3/7试剂按100μl/孔加入到细胞板中，300rpm振摇30s后，于室温避光反应30min，多功能酶标仪测定化学发光rlu值。以各孔光信号增加百分比为纵坐标，
以药物浓度为横坐标，使用graphpad软件进行四参数逻辑拟合。
[0142]
实验结果：通过细胞增殖抑制法测定酶切激活后a-01(ifn-fc)具备抑制肿瘤细胞增殖的能力，剂量曲线ic
50
为8.16nm(图3)；通过对细胞活力、细胞毒性以及细胞凋亡的检测，确认酶切激活后a-01(ifn-fc)可以促进肿瘤细胞的凋亡，降低细胞活力，同时对肿瘤细胞有轻微的细胞毒性(图4)。
[0143]
4、体内药效学研究
[0144]
实验目的：本研究考察a-01单药的细胞生物学活性
[0145]
实验方法：将人乳腺癌mda-mb-231细胞接种于20只雌性cd34 人源化小鼠的左侧皮下，接种量为2
×
106个/0.1ml/小鼠。肿瘤接种后第3天，按照小鼠外周血中hcd45

的比例随机分为5组：阴性对照组(a-01缓冲液组)、sylatron 0.213mg/kg(11.03nmol ifn/kg)组、a-01 0.8mg/kg(11.03nmol ifn/kg)低剂量组、a-01 2.4mg/kg(33.10nmol ifn/kg)中剂量组、a-018mg/kg(110.3nmol ifn/kg)高剂量组，每组4只小鼠。分组当天，各组小鼠经腹腔注射的方式进行给药(给药当天定义为day 1)，每三天给药一次，一共给药10次，末次给药7天后结束实验(day 36)。首次给药后1次/天进行一般临床观察，每周测量肿瘤体积(tv)及体重2次，实验结束时，在安乐死前取小鼠尾静脉血液100μl，检测各组小鼠血清中il-1β、ifn-α2、ifn-γ、tnf-α、mcp-1(ccl2)、il-6、il-8(cxcl8)、il-10、il-12p70、il-17a、il-18、il-23、il-33细胞因子含量。计算肿瘤体积(tv)、肿瘤抑制率(tgi％)。
[0146]
实验结果：实验过程中动物精神状态普遍良好。
[0147]
体内实验结束时(day 36)，和阴性对照组相比各给药组动物体重无显著性差异(p＞0.05)，提示动物耐受良好。相对于阴性对照组，各给药组的细胞因子mcp-1、il-6、il-8和il-18均观察到明显的下降(p＜0.05)，而其他细胞因子未见明显的变化，表明a-01及sylatron给药没有引发细胞因子风暴的风险。
[0148]
day25时，阴性对照组平均肿瘤体积tv为430.61mm3，整个试验期间肿瘤体积逐渐增长。sylatron组、a-01的0.8、2.4、8mg/kg组的平均肿瘤体积分别为：290.35、206.48、225.31、253.52mm3(详见图5)，tgi％分别为：32.57％、52.05％、47.68％、41.13％。表明本实验条件下a-01对肿瘤生长有明显的抑制作用，而sylatron的抑瘤作用相对较弱，同摩尔ifn剂量下a-01的抑瘤作用略优于sylatron(tv比较时p＞0.05)。a-01不同剂量间的tv比较未见显著性差异(p＞0.05)，提示测试剂量下a-01未见明显的剂量依赖性。在本实验条件下，供试品a-01对人乳腺癌mda-mb-231肿瘤生长有明显的抑制作用。在同摩尔ifn剂量下，a-01的肿瘤抑制效果略优于阳性对照sylatron(peg-ifn)。a-01及sylatron给药后未见明显毒性反应，没有引起细胞因子风暴的风险。
[0149]
实施例2干扰素融合蛋白液体制剂ph的筛选
[0150]
ph是影响蛋白质稳定性的关键因素。a-01制剂ph的筛选经过ph筛选预实验、ph筛选、ph对比、ph表征等试验，来确定a-01制剂的最佳ph范围。
[0151]
1.ph筛选预实验
[0152]
实验目的：以25mm醋酸-tris为基础缓冲液，考查ph5.0、ph6.0、ph7.0的样品稳定性。
[0153]
评价指标：热稳定性(dsc)、2-8℃长期储存稳定性(sec-hplc、亚可见微粒、外观等)。
[0154]
实验结果：
[0155]
(1)热稳定性：dsc结果(图6，表2)显示，ph5.0样品的tonset和tm值明显低于ph6.0和ph7.0；ph6.0和ph7.0样品的tonset和tm无显著差异，即ph6.0和ph7.0样品的热稳定性较优。
[0156]
(2)sec-hplc数据(表3)显示，各ph样品零时纯度无显著差异。2-8℃2个月后，ph7.0样品纯度下降约8％，片段明显增加。ph6.0和ph5.0样品纯度无显著变化。
[0157]
(3)各ph样品零时亚可见微粒数据无显著差异(表3)。外观(图7)显示，三个ph的样品在2-8℃放置两个月，溶液澄清，无絮凝。
[0158]
表2 a-01 ph筛选预实验dsc数据
[0159][0160]
表3 a-01 ph筛选预实验结果
[0161][0162]
n/a代表未送检。
[0163]
综合上述预实验结果，ph6.0样品的热稳定性较好，2-8℃下的降解物质与初始样品无显著性变化，所以优选ph6.0。
[0164]
2.ph筛选实验(liq2)
[0165]
实验目的：本研究以制剂平台处方(2mg/ml a-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，80mg/ml二水海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯80)为基础，设计4个ph梯度(5.0、5.5、6.0、6.5)，拟筛选出最适合的ph值，具体处方信息见表4。
[0166]
评价指标：热稳定性(dsc)、40
±
2℃加速稳定性、-80
±
10℃～5
±
3℃反复冻融稳定性。
[0167]
实验结果：
[0168]
(1)热稳定性：ph5.0和ph5.5样品的tonset和tm值明显低于ph6.0和ph6.5；ph6.0和ph6.5样品的tonset和tm无显著差异，即ph6.0和ph6.5样品的热稳定性较优(图8，表5)。
[0169]
(2)加速稳定性：外观与可见异物：40℃加速1个月，各处方均为无色澄明液体，无明显可见异物(表6)。纯度：40℃加速1个月，聚体含量(sec-hplc)随着ph升高显著减少。ph5.0～ph6.5范围内各处方的片段含量(非还原ce-sds)均无显著性差异(图9，图10，表6)。结合活性(elisa)：ph5.0～ph6.5样品零时的结合活性无显著性差异。40℃1个月时，ph5.0样品的结合活性显著升高，说明活性抑制物ifnar2已不能有效的阻断a-01活性；ph5.5样品的结合活性同样有所升高；ph6.0样品的结合活性略有升高；ph6.5样品的结合活性基本无
变化，即处方稳定性ph6.5＞ph6.0＞ph5.5＞ph5.0(图11，表6)。
[0170]
(3)反复冻融稳定性：各ph值处方在-80℃
±
10℃～5℃
±
3℃之间反复冻融5次后，稳定性与零时无明显差异(表7)。
[0171]
表4 a-01 liq2处方表
[0172][0173]
表5 a-01 liq2 ph筛选热稳定性(dsc)数据
[0174]
[0175][0176]
表7 a-01 liq2 ph筛选反复冻融(-80℃
±
10℃～5℃
±
3℃之间反复冻融)稳定性数据
[0177][0178]
n.d.代表未检出。
[0179]
综合上述ph筛选实验结果，ph6.5处方样品的热稳定性、加速稳定性、反复冻融稳定性均较优.优选ph6.5。
[0180]
3.ph对比实验(liq6 f1～f2)
[0181]
实验目的：本研究以制剂处方(2mg/ml a-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，80mg/ml二水海藻糖，0.5mg/ml精氨酸，0.2mg/ml聚山梨酯80)为基础，比较ph 6.4(f1)与ph 6.7(f2)的稳定性差异。
[0182]
评价指标：40
±
2℃加速稳定性。
[0183]
实验结果：在40℃加速1个月，ph 6.7处方的片段(非还原ce-sds)增长速度比ph 6.4处方稍快(表8)。
[0184]
表8 a-01 liq6 f1～f2 ph考察40
±
2℃稳定性数据
[0185][0186]
n/a代表未送检。
[0187]
4.ph表征(liq9)
[0188]
实验目的：根据以上数据，在ph5.0～ph7.0范围内，ph6.5稳定性较好，ph6.0聚体含量比ph6.5高，ph6.7～ph7.0片段含量比ph6.5高，所以在ph6.0-6.7进行表征，确定ph中心值和可接受的ph范围区间，为实际生产操作和成品qs提供提示。
[0189]
本研究以制剂处方(2mg/ml a-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，88.4mg/ml二水海藻糖，150mm盐酸精氨酸*，0.5mg/ml依地酸二钠**，0.2mg/ml聚山梨酯20)为基础进行ph范围表征，设计ph梯度6.0、6.1、6.2、6.3、6.5、6.6、6.7，具体处方信息见表9。(注：*盐酸精氨酸筛选见实施例6和实施例7。**依地酸二钠筛选见实施例3。)
[0190]
评价指标：50
±
2℃加速稳定性。
[0191]
实验结果：50℃加速下，各ph处方间的亚可见微粒未见显著性差异(表10)。ph6.0的聚体含量(sec-hplc，图12，表10)比其他ph处方的高，ph6.7处方片段(非还原ce-sds，图13，表10)增长趋势比其他ph处方的快。提示在ph6.0～6.7范围内ph越低越容易聚集，ph越高越容易产生片段。
[0192]
综合分析，可接受的ph范围是ph6.0～6.6，其中，最适ph为6.3，优选ph范围6.3
±
0.3。
[0193]
表9 a-01 liq9处方表
[0194][0195]
表10 a-01 liq9 ph范围表征50
±
2℃加速稳定性数据
[0196][0197][0198]
n/a代表未送检。n.d.代表未检出。
[0199]
实施例3抑制a-01分子聚集的稳定剂筛选
[0200]
1.依地酸二钠作用(liq6)
[0201]
实验目的：由于a-01分子易聚集，添加常见稳定剂以抑制其聚集。本研究以制剂处方(2mg/ml a-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，80mg/ml二水海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯20，ph 6.3)为基础，添加0.2mg/ml或0.5mg/ml依地酸二钠(edta-2na)，具体处方见表11。
[0202]
评价指标：40
±
2℃加速稳定性。
[0203]
实验结果：40℃加速2周结果显示，添加0.2mg/ml edta-2na和0.5mg/ml edta-2na都能够显著抑制聚体增长(sec-hplc，图14，表12)，添加edta-2na不能降低分子降解速度(非还原ce-sds，图15，表12)。
[0204]
即处方中添加edta-2na能够有效抑制a-01的聚体增长，0.2mg/ml或0.5mg/ml两个浓度的edta-2na抑制蛋白聚集的作用一致。
[0205]
表11 a-01 liq6 edta-2na作用考察处方表
[0206]
[0207][0208]
2.依地酸二钠和依地酸钙钠的选择(liq10)
[0209]
实验目的：本研究以制剂处方(2mg/ml a-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，88.4mg/ml
二水海藻糖，150mm精氨酸，0.2mg/ml聚山梨酯20，ph 6.5)为基础，比较0.2mg/ml和0.5mg/ml的依地酸二钠和依地酸钙钠(edtaca-2na)对a-01蛋白的稳定性作用，具体处方见表13。
[0210]
评价指标：50
±
2℃加速稳定性，40
±
2℃加速稳定性。
[0211]
实验结果：两个浓度下的依地酸二钠和依地酸钙钠的处方在50℃10天、40℃2周的各质量指标(如纯度(聚体、片段)、亚可见颗粒、细胞活性等)(表14，表15)均无显著性差异，即两者对a-01蛋白的稳定作用相当。
[0212]
依地酸二钠和依地酸钙钠均为金属离子螯合剂，usp nf均有收载，依地酸二钠被chp2015版四部作为药用辅料收载，依地酸钠钙、依地酸钠钙注射液已被chp2015版二部作为药用辅料、原料药收载，国内外上市制剂处方中使用依地酸二钠的产品较多于依地酸钙钠。
[0213]
综上所述，选择0.2mg/mledta-2na在处方中添加，可显著抑制聚体增长。
[0214]
表13 a-01 liq10处方表
[0215][0216]
edta-2na物质的量换算为：1.5mm＝0.5mg/ml，0.6mm＝0.2mg/ml。
[0217][0218]
实施例4 a-01液体制剂缓冲体系筛选
[0219]
实验目的：本研究以制剂处方(2mg/ml a-01，88.4mg/ml二水海藻糖，150mm盐酸精
氨酸，0.5mg/ml依地酸二钠，0.2mg/ml聚山梨酯20，ph6.5)为基础，考察了三种缓冲对(20mm组氨酸-盐酸组氨酸、20mm磷酸盐缓冲液、20mm柠檬酸盐缓冲液)，具体处方见表16。
[0220]
评价指标：50
±
2℃加速稳定性。
[0221]
实验结果：50℃加速14天，三个处方的纯度、亚可见颗粒均无显著性差异(表17)。由于磷酸盐缓冲液在冻干过程中可能会出现ph偏移，柠檬酸盐缓冲液存在注射疼痛感的缺点，最终选择组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液作为a-01成品处方的缓冲体系。
[0222]
表16 a-01 liq12处方表
[0223]
[0224][0225]
实施例5 a-01液体制剂表面活性剂筛选
[0226]
实验目的：本研究以制剂处方(2mg/mla-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，88.4mg/ml
二水海藻糖，0.5mg/ml依地酸二钠，ph6.3)为基础，对比0.5mg/ml和0.2mg/ml的聚山梨酯20(polysorbate20，以下简称ps20)和聚山梨酯80(polysorbate80，以下简称ps80)对产品稳定性的影响，具体处方信息见表18。
[0227]
评价指标：50
±
2℃加速稳定性，40
±
2℃加速稳定性，-80
±
10℃～5
±
3℃反复冻融稳定性。
[0228]
实验结果：
[0229]
(1)0.2mg/ml或0.5mg/ml的聚山梨酯20或聚山梨酯80处方的样品，在50℃加速14天和40℃加速1个月，各处方间各质量指标(外观和可见异物、ph、亚可见微粒、sec-hplc、非还原ce-sds)均无显著性差异(表19，表20)；
[0230]
(2)-80
±
10℃～5
±
3℃反复冻融5次后，所有处方的各质量指标(外观和可见异物、ph、亚可见微粒、纯度、蛋白质含量)无显著性变化(表21)。
[0231]
所以，0.2mg/ml～0.5mg/ml聚山梨酯20和聚山梨酯80对a-01蛋白的稳定作用相同。综合考虑法规符合性、采购便利性等，选择聚山梨酯20作为处方中的表面活性剂，浓度为0.2mg/ml。
[0232]
表18 a-01 liq8聚山梨酯筛选处方表
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237][0238]
实施例6抑制a-01分子降解的稳定剂筛选(liq7)
[0239]
实验目的：由于a-01分子结构特殊易断裂产生片段，尝试在处方中添加精氨酸、甲
硫氨酸等氨基酸成分，以抑制其降解。a-01 liq7以制剂处方(2mg/ml a-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，80mg/ml二水海藻糖，0.5mg/ml依地酸二钠，0.2mg/ml聚山梨酯20，ph 6.5)为基础，比较不同浓度的精氨酸或与其他氨基酸的组合对a-01的稳定效果，具体处方见表22。
[0240]
表22 a-01液体制剂(liq7)中精氨酸及其组合筛选处方表
[0241][0242]
评价指标：热稳定性(dsc)，50
±
2℃加速稳定性，40
±
2℃加速稳定性。
[0243]
实验结果：
[0244]
(1)热稳定性：各处方的热稳定性(dsc)无显著性差异(图16，表23)。
[0245]
(2)聚体：50℃和40℃的加速条件下，除50℃加速下不含精氨酸的处方(f1)聚体增长大于3％之外，含精氨酸的各处方的聚体(sec-hplc)增长趋势一致，均≤2％，无显著性差异(图17和图18，表24和表25)。
[0246]
(3)片段：50℃加速14天和40℃加速1个月，未添加精氨酸的对照组(f1)和50mm精氨酸的试验组(f2)样品的片段含量(非还原ce-sds)都明显高于其他实验组结果(图19、图20、图21，表23和表24)。100mm精氨酸、150mm精氨酸、150mm精氨酸加10mm甲硫氨酸样品的片段均增长较慢，前两者的片段含量无明显差异，150mm精氨酸加10mm甲硫氨酸的样品片段略少。
[0247]
综上所述，100～150mm精氨酸，精氨酸加甲硫氨酸组合都可能抑制a-01产品的降解。
[0248]
表23 a-01 liq7 dsc数据
[0249]
处方编号f1f2f3f4f5f6f7f8f9tonset(℃)59.1560.7560.9259.2860.6262.4460.8861.4260.65tm1(℃)69.4169.4169.5869.3568.8869.8969.1669.6569.91tm2(℃)86.2885.8985.8985.6686.2085.7785.4886.8986.00
[0250]
表24 a-01液体制剂(liq7)精氨酸及其组合筛选50
±
2℃加速稳定性
[0251][0252][0253]
*f9的ph漂移，无法控制在ph6.5左右，后期不再监测稳定性。
[0254]
n/a代表未送检。n.d.代表未检出。
[0255]
表25 a-01液体制剂(liq7)精氨酸及其组合筛选40
±
2℃加速稳定性
[0256][0257][0258]
*f9的ph漂移，无法控制在ph6.5左右，后期不再监测稳定性。
[0259]
n/a代表未送检。n.d.代表未检出。
[0260]
实施例7冻干制剂处方中各辅料含量研究
[0261]
实验目的：以上实施例6的试验表明一定浓度的精氨酸及甲硫氨酸能在一定程度上能降低a-01分子降解速率，同时为进一步确保a-01成品的质量、便于储存和运输，暂定a-01成品的剂型为冻干制剂。
[0262]
本研究基于冻干剂型，进行赋形剂及稳定剂的考察。冻干制剂由液体制剂冻干制成。为保障成品冻干外观、渗透压、片段等质量指标在可接受范围内，进行了冻干赋型剂(二水海藻糖)、稳定剂(盐酸精氨酸、甲硫氨酸)等辅料浓度范围的研究。通过减少二水海藻糖含量以保障外观合格的同时，控制渗透压在等渗范围，探索盐酸精氨酸在处方中的最大浓度以控制渗透压的同时进一步降低片段、提高甲硫氨酸浓度以进一步降低片段。具体处方见表26。
[0263]
表26 a-01液体制剂(liq11)及冻干制剂(lyo5)处方表
[0264][0265][0266]
评价指标：冻干制剂外观及50
±
2℃加速稳定性，液体制剂50
±
2℃加速稳定性。
[0267]
冻干制剂外观及50℃加速稳定性结果：
[0268]
(1)冻干制剂外观(图22)：f1和f5(88.4mg/ml二水海藻糖)、f2(44.2mg/ml二水海藻糖)的处方外观均可接受，f3(22.1mg/ml二水海藻糖)处方明显萎缩，f4(不含二水海藻糖仅含200mm盐酸精氨酸)的处方未成型，f6和f7(110.5mg/ml二水海藻糖)处方严重粘底。可见，200mm精氨酸无赋形作用，目前冻干工艺较适宜的二水海藻糖浓度为：44.2mg/ml～88.4mg/ml。
[0269]
(2)f1和f2处方在50℃加速1个月，冻干制剂的各质量指标(聚体含量(sec-hplc)、片段含量(非还原ce-sds)，表27)与未冻干前的初始液体制剂无明显变化。
[0270]
综上，a-01冻干制剂的最适二水海藻糖浓度为44.2～88.4mg/ml。
[0271][0272]
液体制剂50℃加速稳定性结果：
[0273]
(1)不含edta-2na的液体制剂处方(f4、f7)的聚体(sec-hplc，图23，表28)增长最
快，其他处方的聚体增长趋势均能控制在2.0％以下，再次证实了edta-2na抑制a-01聚体的作用。尤其是不含edta-2na和盐酸精氨酸的处方(f7)的聚体尤其高，说明盐酸精氨酸也能在一定程度上控制a-01的聚集。
[0274]
(2)f1(150mm盐酸精氨酸)、f2(150mm盐酸精氨酸)、f3(165mm盐酸精氨酸)、f4(200mm盐酸精氨酸)的处方片段增长趋势一致，f5(60mm甲硫氨酸)的处方片段增长最缓慢(非还原ce-sds，图24和图25，表29)。可见，150～200mm的盐酸精氨酸对a-01的稳定作用相当，同时，甲硫氨酸有利于降低a-01片段的产生。
[0275]
综上，edta-2na、150～200mm盐酸精氨酸有利于控制a-01分子的聚集，150～200mm盐酸精氨酸、60mm甲硫氨酸有利于降低a-01片段的产生。
[0276]
表28 a-01液体制剂(liq11)50
±
2℃加速稳定性
[0277][0278]
*f6和f7处方(110.5mg/ml二水海藻糖)是为了探索冻干制剂而制备，未纳入讨论液体制剂稳定性中。
[0279]
n/a代表未送检。n.d.代表未检出。
[0280]
实施例8冻干制剂处方中各辅料含量确定
[0281]
实验目的：本研究考察在44.2mg/ml～88.4mg/ml二水海藻糖、100～150mm盐酸精氨酸、10-60mm甲硫氨酸浓度范围中、最低含量的各辅料的组合处方能否稳定地进行冻干放大。处方信息见表29。
[0282]
评价指标：冻干制剂外观及50
±
2℃加速稳定性，液体制剂40
±
2℃加速稳定性。
[0283]
实验结果：液体制剂处方f1(2mg/mla-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，44.2mg/ml二水海藻糖，100mm盐酸精氨酸，0.5mg/ml依地酸二钠，10mm甲硫氨酸，0.2mg/ml聚山梨酯20，ph6.3)制备的冻干成品外观饱满(图26)，零时及加速条件下的亚可见颗粒、水分、纯度(聚体、片段)等均符合要求(表30)，该处方液体状态下的稳定性也良好(表31)，符合生产要求。
[0284]
综上所述，确认处方中二水海藻糖为44.2mg/ml，盐酸精氨酸为100mm，甲硫氨酸为10mm。
[0285]
表29 a-01液体制剂(liq17)和冻干制剂(201904008)处方表
[0286]
[0287][0288]
表31 a-01液体制剂(liq17)40
±
2℃加速稳定性
[0289][0290]
n/a代表未送检。n.d.代表未检出。
[0291]
在冻干制剂放大批(201904008)生产结束后，按制剂处方：2mg/ml a-01，20mm组氨酸-盐酸组氨酸，44.2mg/ml二水海藻糖，100mm盐酸精氨酸(相当于21.07mg/ml盐酸精氨酸)，0.5mg/ml依地酸二钠，10mm甲硫氨酸(1.49mg/ml甲硫氨酸)，0.2mg/ml聚山梨酯80，ph6.3再次进行工程批(201905009)的成品生产。该工程批的表面活性剂使用聚山梨酯80替换聚山梨酯20。经检测，工程批的各质量指标结果均符合质量要求。
[0292]
经过液体制剂下的ph筛选、缓冲体系筛选、稳定剂(抑制聚集、抑制降解)筛选、表面活性剂筛选研究，和冻干制剂下的辅料含量研究实验，最终确定a-01成品处方为：每瓶含2mg重组干扰素α-2b fc融合蛋白，2.217mg组氨酸，1.198mg盐酸组氨酸(相当于20mm组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液)，442mg二水海藻糖，21.07mg盐酸精氨酸，0.2mg依地酸二钠，1.49mg甲硫氨酸，0.2mg聚山梨酯20，ph6.3。
[0293]
实施例9 a-01冻干制剂的工艺开发及优化
[0294]
a-01成品剂型可以为注射用冻干制剂，给药方式为皮下注射，成品生产工艺中较为关键的生产步骤为原液融化、中间品制备、除菌过滤、灌装、冻干等工艺阶段，本实施例对以上关键步骤的关键工艺操作参数开展了研究。
[0295]
5.1冻干工艺相关的关键属性
[0296]
通过冻干显微镜和dsc仪器检测a-01制剂处方的关键属性：崩解温度、玻璃化转变温度以及共晶点。所得数据如表32所示。
[0297]
表32 a-01制剂处方的冻干关键属性
[0298][0299]
5.2冻干工艺开发
[0300]
在冻干工艺开发初期，使用小试冻干机对a-01冻干参数进行摸索，确定了在小试冻干机上稳健性良好的冻干工艺(见lyo6)，再放大到中试生产型冻干机，最终进行冻干工艺确认(见201904008)。
[0301]
lyo6：
[0302]
实验设计：lyo6考察100～150mm盐酸精氨酸和甲硫氨酸组合的冻干工艺参数设计，处方设计详见表33。冻干参数为：退火温度为-30℃，一次干燥阶梯为-35℃和-31℃，二次干燥阶梯为25℃和30℃。
[0303]
结果：lyo6三个处方的冻干制品外观(图27)均合格，制品饼型完整，其中f2处方底部稍有萎缩，分析可能由于精氨酸浓度增高，降低了体系的玻璃化转变温度所致。
[0304]
lyo6在50
±
2℃加速1个月的稳定性数据见表34，三个处方的纯度(聚体(sec-hplc)、片段(非还原ce-sds))及亚可见微粒与零时相比无明显差异。零时水分也均低于1.0％。
[0305]
综合制品外观和稳定性数据，lyo6的冻干参数适用于a-01项目在小试冻干机。在向中试冻干机的转移放大过程中，以此冻干参数为基础。
[0306]
表33 a-01 20190425-lyo6处方信息表
[0307]
[0308][0309]
冻干工艺放大及确定
[0310]
a-01 201904008冻干工艺放大实验旨在将小试冻干机上的a-01冻干工艺转移放
大至中试生产型冻干机。依据a-01项目200l细胞培养、纯化收率、制剂规格及冻干机规模计算，a-01制剂生产批量为10000瓶/批(即冻干机满载，6个板层)。处方设计信息见表31。
[0311]
由于冻干批量放大，在lyo6冻干参数基础上，将一次干燥第一步-35℃由10小时延长至15小时，并在水线干完后继续保持一次干燥条件4小时，一次干燥和二次干燥终点均以压力升测试的方式进行判断。a-01201904008冻干曲线见图28。
[0312]
christ冻干机使用皮拉尼真空计，而gea冻干机使用电容式真空计；所以在冻干工艺由christ冻干机转移至gea冻干机时，一次干燥的箱体压力由0.2mbar换算为0.12mbar，换算系数0.6。
[0313]
结果：根据外观和冻干制品稳定性(图26和表30)良好判断，本冻干参数可用于a-01项目的中试生产。
[0314]
实施例10 a-01成品的活性研究
[0315]
1.成品稳定性研究
[0316]
实验目的：本研究考察实施例9制备的a-01冻干成品的稳定性。
[0317]
评价指标：长期稳定性、加速稳定性、强加速稳定性、光照稳定性。
[0318]
实验结果：长期稳定性：5℃12个月，a-01成品检项参数无明显变化，表明该条件下成品稳定；加速稳定性：25℃6个月，a-01成品检项参数无明显变化，表明该条件下成品稳定；强加速稳定性：40℃6周，2批成品检项参数无明显变化，稳定性良好；光照稳定性：成品检项参数无明显变化，稳定性良好(表35)。
[0319]