寡核苷酸、试剂及其制备的制作方法

寡核苷酸、试剂及其制备
1.相关申请
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2020年11月11日提交的美国临时申请第63/112,281号的申请日的权益，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及寡核苷酸、试剂以及用于制备寡核苷酸的方法。


背景技术：

4.寡核苷酸是可以化学合成用于广泛应用的短dna或rna寡聚物。利用合成的寡核苷酸作为治疗剂的最新发展增加了对可以以高效率和高纯度大量产生寡核苷酸的合成方法的需求。
5.传统上，寡核苷酸是利用亚磷酰胺化学反应由固相自动合成仪合成的，限于小于2摩尔的规模。因此，固相合成不足以产生临床开发和商业化大适应症中的寡核苷酸药物所需的材料。另外，固相合成通常需要使用过量试剂，因此增加了与产生目标寡核苷酸相关的成本。
6.因此，需要新的试剂和稳健的方法来合成寡核苷酸，这些试剂和方法适用于高效率和高纯度地大规模制造过程。


技术实现要素：

7.本公开的一个方面涉及一种式i'或b的化合物：
[0008][0009]
或其盐；其中环a、a1、a2、a3、r1、r2、p1、y、e和f如下定义。
[0010]
本公开的一个方面涉及一种由式iii或iiip表示的核苷酸或寡核苷酸，
[0011][0012]
或其盐，其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q、x和z如下定义。
[0013]
本公开的一个方面涉及一种由式iii'或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸，
[0014][0015]
或其盐，其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q、q、x、和z如下定义。
[0016]
本公开的一个方面涉及一种用于制备以下的方法：式(v)的寡核苷酸片段，
[0017][0018]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0019]
1)将以下脱保护：式(va)的化合物：
[0020][0021]
或其盐，以形成式(vb)的化合物：
[0022]
或其盐；
[0023]
2)使式(vb)的所述化合物或其盐与以下反应：式(vc)的化合物：
[0024][0025]
或其盐，以形成式(vd)的化合物，
[0026]
或其盐；
[0027]
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(vd)的所述化合物或其盐，以形成式(ve)的化合物：
[0028]
或其盐；
[0029]
4)将式(ve)的所述化合物或其盐脱保护，以形成式(vf)的化合物：
[0030]
或其盐；
[0031]
5)当q等于或大于2时，从式(vf)的所述化合物开始，重复步骤2)、3)和4)q-2次，随后重复步骤2)和3)，得到式(v)的片段或其盐；其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q、x和z如下定义。
[0032]
本公开的一个方面涉及制备一种用于制备以下的方法：式(v')的寡核苷酸片段，
[0033][0034]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0035]
1)将以下脱保护：式(va)的化合物：
[0036][0037]
或其盐，以形成式(vb)的化合物：
[0038]
或其盐；
[0039]
2)使式(vb)的所述化合物或其盐与以下反应：式(vc')的化合物：
[0040][0041]
或其盐，以形成式(vd')的化合物，
[0042]
或其盐；
[0043]
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(vd')的所述化合物或其盐，以形成式(ve')的化合物：
[0044]
或其盐；
[0045]
4)将式(ve')的所述化合物或其盐脱保护，以形成式(vf')的化合物：
[0046]
或其盐；
[0047]
5)当q等于或大于2时，从式(vf')的所述化合物开始，重复步骤2)、3)和4)q-2次，随后重复步骤2)和3)，得到式(v')的所述片段或其盐；其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、q、x和z如下定义。
[0048]
本公开的一个方面涉及制备一种用于制备以下的方法：式(v-c1)或(v-c2)的寡核苷酸片段，
[0049]
[0050][0051]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0052]
1)使式(vb)的所述化合物，
[0053][0054]
或其盐与以下反应：式(v-cr1)或(v-cr2)的化合物，
[0055][0056]
或其盐，以及碱，以形成式(v-c1)或(v-c2)的化合物，其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、q、x和z如下定义。
[0057]
本公开的一个方面涉及制备一种用于制备以下的方法：式(v-c1)或(v-c2)的寡核苷酸片段，
[0058][0059]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0060]
1)使式(vb)的所述化合物，
[0061][0062]
或其盐与以下反应：式(vr1)或(vr2)的试剂，
[0063][0064]
以形成式(v-cr3)或(v-cr4)的化合物，
[0065][0066]
或其盐；
[0067]
2)使式(v-cr3)或(v-cr4)的所述化合物或其盐与以下反应：式(vg)的化合物：
[0068][0069]
或其盐，以及碱，以形成式(v-c1)或(v-c2)的所述化合物，其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r36
、q、x和z如下定义。
[0070]
本公开的一个方面涉及一种用于制备以下的方法：式(vbz)的寡核苷酸片段，
[0071][0072]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0073]
1)使式(vbz-1)的所述化合物，
[0074][0075]
或其盐与以下反应：式(vbz-2)的化合物，
[0076][0077]
或其盐，以形成式(vbz-3)的化合物，
[0078][0078]
或其盐；
[0079]
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(vbz-3)的所述化合物或其盐，以形成式(vbz)的化合物或其盐；其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q、x和z如下定义。
[0080]
本公开的一个方面涉及一种用于制备以下的方法：式(v)的寡核苷酸片段，
[0081][0082]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0083]
a)使式(v-1)的核苷酸：
[0084]
或其盐，
[0085]
与以下在溶液中偶联：式(v-2)的寡核苷酸片段：
[0086]
或其盐，
[0087]
以形成式(v-3)的寡核苷酸片段，
[0088]
或其盐；以及
[0089]
b)硫化或氧化式(v-3)的所述寡核苷酸或其盐，以形成式(v)的寡核苷酸：
[0090]
或其盐；
[0091]
其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、r
37a
、r
37b
、q、x和z如下定义。
[0092]
本公开的一个方面涉及制备一种用于制备以下的方法：式(v*)的寡核苷酸片段，
[0093][0094]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0095]
a)使式(v-1)的核苷酸：
[0096]
或其盐，
[0097]
与以下在溶液中偶联：式(v-2')的寡核苷酸片段：
[0098]
或其盐，以形成式(v-3')的寡核苷酸片段，
[0099]
或其盐；以及
[0100]
b)硫化或氧化式(v-3')的所述寡核苷酸或其盐，以形成式(v*)的所述寡核苷酸或其盐；
[0101]
其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q、x和z如下定义。
[0102]
本公开的一个方面涉及一种用于制备以下的方法：式(vi)或(vi-1)的目标寡核苷酸，
[0103][0104][0105]
或其盐，所述方法包括
[0106]
a)使式(f1)或(f1-1)的寡核苷酸片段：
[0107][0108]
或其盐，
[0109]
与以下在溶液中偶联：式(f2)的寡核苷酸片段：
[0110]
或其盐，以形成式(f3)或(f3-1)的寡核苷酸片段，
[0111][0112][0113]
或其盐；以及
[0114]
b)硫化或氧化式(f3)或(f3-1)的所述寡核苷酸片段或其盐，以形成式(vi)或(vi-1)的所述寡核苷酸或其盐；其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、r
37a
、r
37b
、o、p、q、x、和z如下定
义。
[0115]
本公开的一个方面涉及一种用于制备以下的方法：式(vi')或(vi'-1)的目标寡核苷酸，
[0116]
[0117]
或其盐，所述方法包括a)使式(f1)或(f1-1)的寡核苷酸片段：
[0118][0119]
或其盐与以下在溶液中偶联：式(f2')的寡核苷酸片段：
[0120][0121]
或其盐，以形成式(f3')或(f3'-1)的寡核苷酸片段，
[0122][0123]
或其盐；以及
[0124]
b)硫化或氧化式(f3')或(f3'-1)的所述寡核苷酸片段或其盐，以形成式(vi')或(vi'-1)的所述寡核苷酸或其盐，
[0125]
其中：r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、r
37a
、r
37b
、o、p、q、x、和z如下定义。
附图说明
[0126]
图1示出了用于制备寡核苷酸i的逆合成方案。
[0127]
图2示出了用于制备寡核苷酸片段a的合成方案。
[0128]
图3示出了用于由试剂m19制备寡核苷酸片段b的合成方案。
[0129]
图4示出了用于制备寡核苷酸片段c的合成方案。
[0130]
图5示出了用于制备寡核苷酸片段d的合成方案。
[0131]
图6示出了用于制备寡核苷酸片段e的合成方案。
[0132]
图7示出了用于制备寡核苷酸片段f的合成方案。
[0133]
图8示出了用于制备寡核苷酸片段j的合成方案。
[0134]
图9示出了用于制备寡核苷酸片段k的合成方案。
[0135]
图10示出了用于制备寡核苷酸片段o的合成方案。
[0136]
图11示出了用于由试剂m40制备寡核苷酸片段b的合成方案。
[0137]
图12示出了用于制备p＝o连键的一锅程序的反应产物和副产物。
[0138]
图13示出了用于大规模制备寡核苷酸i的合成方案。
具体实施方式
[0139]
描述了用于促进寡核苷酸制备、尤其是大规模制备的试剂。基于本公开的试剂的合成方法以高纯度大规模产生受保护的目标寡核苷酸，而不需要从寡核苷酸片段的组装中进行色谱纯化。此外，可以选择性基于本公开的条件将受保护的目标寡核苷酸容易地脱保护。在脱保护和标准下游纯化之后，获得适用于治疗用途的高纯度aso寡核苷酸。因此，本公开的新型试剂和合成方法提供了优于寡核苷酸的传统制备的巨大优势。
[0140]
定义
[0141]
术语“核碱基”意指核苷的杂环碱基部分。核碱基可以是天然存在的或可以是修饰的。在某些实施方案中，核碱基可包含能够与另一核酸的核碱基氢键合的任何原子或原子团。特别地，核碱基是杂环碱基，通常是嘌呤和嘧啶。除了“未修饰的”或“天然的”核碱基(诸如嘌呤核碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u))之外，本领域技术人员已知的许多修饰的核碱基或核碱基模拟物也适于掺入通过本文所述的方法合成的化合物中。在某些实施方案中，修饰的核碱基是在结构上与母核碱基非常相似的核碱基，诸如7-脱氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶或g-夹。在某些实施方案中，核碱基模拟物包括更复杂的结构，诸如三环吩噁嗪核碱基模拟物。用于制备上述修饰的核碱基的方法是本领域技术人员熟知的。
[0142]
术语“核苷”是指包含杂环碱基部分和糖部分的化合物，其可以在2'端处被修饰。
[0143]
术语“核苷酸”是指包含磷酸或硫代磷酸或二硫代磷酸连接基团的核苷。
[0144]
术语“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一个或多个是被修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种核糖核苷(rna)和/或脱氧核糖核苷(dna)。
[0145]
如本文所用，“目标寡核苷酸”是指可以基于本公开的试剂和方法制备的寡核苷酸产物。在某些实施方案中，目标寡核苷酸包含至少10个或至少15个核苷酸。在某些实施方案中，目标寡核苷酸具有10至500、15至500、15至200、15至100、15至50、15至40、15至30或16至30个核苷酸。
[0146]
如本文所用，“寡核苷酸片段”是指组装以制成目标寡核苷酸的短寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸片段具有3至10、3至8、3至6或4至6个核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸片段具有4或5个核苷酸。
[0147]
如本文所用，术语“烷基”是指完全饱和的支链或非支链烃部分。在一些实施方案中，烷基包含1至30个碳原子、1至20个碳原子、1至16个碳原子、1至10个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子。在一些实施方案中，烷基包含6至20个碳原子。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。
[0148]
如本文所用，“碳环基”是指具有4至12个环成员的饱和或不饱和的单环、双环或三环环系(例如，稠合、桥接或螺环系)，所有环成员均为碳。术语“碳环基”涵盖环烷基基团、环烯基基团和芳族基团(即，芳基)。“环烷基”是指3-7个碳原子的完全饱和的单环烃基团，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环戊基；并且“环烯基”是指3-7个碳原子的不饱和非芳族单环烃基团，包括环戊烯基、环己烯基和环戊烯基。
[0149]
术语“芳基”是指在环部分中具有6至14个碳原子的单环、双环或三环芳族烃基团。在一个实施方案中，术语“芳基”是指具有6至10个碳原子的单环和双环芳族烃基团。芳基基团的代表性实例包括苯基、萘基、芴基和蒽基。
[0150]
术语“芳基”还指其中至少一个环是芳族的并且与一个或两个非芳族烃环稠合的双环或三环基团。非限制性实例包括四氢萘、二氢萘基和茚满基。
[0151]
如本文所用的术语“桥接环系”是具有碳环基或杂环基环的环系，其中环的两个非相邻原子通过一个或多个(优选一至三个)选自c、n、o或s的原子连接(桥接)。桥接环系可具有6-7个环成员。
[0152]
如本文所用的术语“螺环系”是具有两个环的环系，每个环独立地选自碳环基或杂环基，其中两个环结构共有一个环原子。螺环系具有5至7个环成员。
[0153]
如本文所用，术语“杂环基”是指具有3至7个环成员或3至6个环成员或5至7个环成员的饱和或不饱和的单环或双环环系(例如，桥接或螺环系)，至少一个环成员是杂原子，并且最多4个(例如，1、2、3或4个)环成员可以是杂原子，其中杂原子独立地选自o、s和n，并且其中c可以被氧化(例如，c(o))，n可以被氧化(例如，n(o))或季铵化，并且s可以任选地被氧化成亚砜和砜。不饱和杂环包括杂芳基环。如本文所用，术语“杂芳基”是指具有1至4个独立地选自o、s和n的杂原子的芳族5或6元单环环系，并且其中n可以被氧化(例如，n(o))或季铵化，并且s可以任选地被氧化成亚砜和砜。在一个实施方案中，杂环基是3至7元饱和的单环或3至6元饱和的单环或5至7元饱和的单环。在一个实施方案中，杂环基是3至7元单环或3至6元单环或5至7元单环。在另一个实施方案中，杂环基是6或7元双环。杂环基基团可以在杂原子或碳原子处附接。杂环基的实例包括氮丙啶基、环氧乙烷基、硫杂环丙烷基、氧氮丙啶基、二环氧丙烷基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、吡咯烷基、四氢呋喃基、硫杂环戊
基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、二氧戊环基、二硫戊环基、氧硫杂环戊基、哌啶基、四氢吡喃基、噻烷基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、二噁烷基、二噻烷基、三噁烷基、三噻烷基、氮杂环庚烷基(azepanyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢吡喃基和杂芳基环，包括氮杂环丙烯基(azirinyl)、环氧乙烯基(oxirenyl)、硫杂丙烯环基(thiirenyl)、二氮杂环丙烯基(diazirinyl)、氮杂环丁烯基(azetyl)、氧杂环丁烯基(oxetyl)、硫杂环丁烯基(thietyl)、吡咯基、呋喃基、苯硫基(或噻吩基)、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、呋咕基、噁二唑基、噻二唑基、二噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、吡喃基、噻喃基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁嗪基、噻嗪基、二氧杂环己烯基、二硫杂环己烯基(dithiinyl)、氧硫杂环己基、三嗪基、四嗪基、氮杂基、氧杂基、硫杂基、二氮杂基和硫氮杂基等。双环杂环环系的实例包括3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[3.1.1]庚烷基、2-氮杂螺[3.3]庚烷基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷基和5-氮杂螺[2.3]己烷基。
[0154]“卤素”或“卤基”可以是氟、氯、溴或碘。
[0155]
如本文所用，“羟基保护基团”是指适用于保护羟基基团-oh不与其他试剂反应的基团。羟基保护基团的实例可以在greene,tw等人,protective groups in organic synthesis,第4版,john wiley and sons(2007)中找到。
[0156]
在某些实施方案中，羟基保护基团可以选自例如乙酰基(ac)；苯甲酰基(bz)；苄基(bn)；β-甲氧基乙氧基甲基醚(mem)；甲氧基甲基醚(mom)；甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基，mmt)；4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmt)；甲氧乙基(moe)；对甲氧基苄基醚(pmb)；甲硫基甲基醚；特戊酰(piv)；四氢吡喃基(thp)；四氢呋喃(thf)；甲硅烷基醚(包括但不限于三甲基甲硅烷基(tms)、叔丁基二苯基甲硅烷基(tbdps)、叔丁氧基二苯基甲硅烷基(tbodps)、三苯基甲硅烷基(tps)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(tom)和三异丙基甲硅烷基(tips)醚)；甲基醚和乙氧基乙基醚(ee)。
[0157]
在某些实施方案中，羟基保护基团保护核苷的3'-羟基(称为3'-羟基保护基团)。在某些实施方案中，3'-羟基保护基团包括甲硅烷基羟基保护基团，诸如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、二甲基(叔丁基乙基)甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二叔丁基甲基甲硅烷基、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基和叔丁氧基二苯基甲硅烷基。在某些实施方案中，3'-羟基保护基团是tbdps。在某些实施方案中，3'-羟基保护基团是大疏水保护基团(lhpg)，诸如本文所述的那些。
[0158]
添加到化学名称末尾的后缀“yl”表示命名部分在点处与分子键合。添加到化学名称末尾的后缀“ene”表示命名部分在两个点处与分子键合。
[0159]
在某些实施方案中，羟基保护基团保护核苷的5'-羟基(称为5'-羟基保护基团)。例示性5'-羟基基团包括但不限于如本文所述的那些(例如，任何方面或实施方案中的r
35
)。在一个具体实施方案中，5'-羟基保护基团是酸不稳定的4,4'-二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(dmt或dmtr)保护基团。在某些实施方案中，5'-羟基保护基团是大疏水保护基团(lhpg)，诸如本文所述的那些。
[0160]
如本文所用，“选择性沉淀”是指通过将溶液添加到沉淀出所需产物的溶剂中来将
该产物与溶液中的一种或多种杂质分离而将一种或多种杂质留在溶液中的纯化方法。另选地，可以将溶剂添加到包含粗产物和一种或多种杂质的溶液中以沉淀出产物。在某些实施方案中，本公开的所需化合物或寡核苷酸包含疏水性基团(例如，疏水性3'-羟基保护基团或疏水性5'-羟基保护基团(例如，本文所述的lhpg基团))和将极性溶剂(例如，ch3cn)添加到含有该化合物或寡核苷酸和一种或多种杂质的溶液中以沉淀出所需寡核苷酸。在某些实施方案中，本公开的所需化合物或寡核苷酸可以通过以下来纯化：将共溶剂或溶剂混合物(例如，庚烷、叔丁基甲基醚(tbme或mbte)、庚烷/mbte混合物(例如，庚烷与mbte的体积比在20:1至1:20、9:1至1:9或4:1至1:4的范围内的庚烷/mbte混合物，或庚烷与mbte的体积比为9:1、4:1、2:1、1:1、2:5、1:2、1:4或1:9的庚烷/mbte混合物)添加到在有机溶剂(例如，二氯甲烷(dcm)或乙酸乙酯(etoac))中包含粗产物和一种或多种杂质的溶液中，以沉淀出产物。另选地，可以将包含粗产物和一种或多种杂质的溶液添加到非极性或低极性溶剂或溶剂混合物中以沉淀出产物。合适的共溶剂可以基于产物的疏水性来确定。在某些实施方案中，共溶剂的极性低于溶解产物的有机溶剂。
[0161]
如本文所用，“萃取”是指通过使溶液与所需产物可溶于其中的溶剂接触来将该产物与溶液中的一种或多种杂质分离的纯化方法；而一种或多种杂质是不溶的。另选地，可以使含有产物和一种或多种杂质的溶液与一种或多种杂质可溶于其中的溶剂接触；而产物是不溶的。在某些实施方案中，可以使在有机溶剂(例如，dcm、etoac或thf)或有机溶剂混合物中含有产物和一种或多种杂质的溶液(例如，反应混合物或粗产物的溶液)与水或水溶液(例如，nahco3/h2o溶液或nacl/h2o溶液)接触(用后者萃取或洗涤)以除去亲水性杂质。
[0162]
如本文所用，术语“碱”是指可以在水溶液中产生氢氧根离子(oh-)的物质或可以提供一对非成键电子的物质。例示性碱包括但不限于碱性氢氧化物、碱土金属氢氧化物、烷基胺(例如，叔丁胺、仲丁胺、三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺、2-甲基丙-2-胺)、8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)、咪唑、n-甲基咪唑、吡啶和3-皮考啉。如本文所用，术语“盐”是指本文所述的化合物、核苷酸或寡核苷酸的有机或无机盐。在某些实施方案中，盐是其药学上可接受的盐。短语“药学上可接受的”表示物质或组合物必须在化学上和/或毒理学上与构成制剂的其他成分和/或用其治疗的哺乳动物相容。在某些实施方案中，本文所述的化合物、核苷酸或寡核苷酸的盐是钠盐、钾盐或铵盐。在某些实施方案中，盐是钠盐或铵盐。
[0163]
1.试剂
[0164]
在第一方面，本公开提供了用于促进寡核苷酸合成的试剂。在一个实施方案中，本公开的试剂用作保护核苷酸/寡核苷酸片段的3'-羟基基团的保护基团。在另一个实施方案中，由本公开的试剂保护的核苷酸、寡核苷酸片段或目标寡核苷酸可以选择性地从反应混合物中沉淀。因此，核苷酸、寡核苷酸片段或目标寡核苷酸易于通过过滤收集而无需色谱。
[0165]
在第一方面的第一实施方案中，本公开提供了一种式i'或式b的化合物：
[0166][0167]
或其盐，其中：
[0168]
a1、a2和a3中的一者为ya，而其他为h；
[0169]
为单键或双键；
[0170]
ya为y-(ch2)
a1
ch2o(ch2)
a2-，其中a1和a2各自独立地为0或1至10的整数；
[0171]
环a为苯基、8至10元双环芳基、具有1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的5至6元杂芳基或具有1-4个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的7至10元双环杂芳基；
[0172]
y为h、卤素、or
1a
、nr
2ar3a
、sr
4a
、cr
5ar6ar7a
或包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团；其中r
1a
、r
2a
、r
3a
、r
4a
、r
5a
、r
6a
和r
7a
各自独立地为c
1-6
烷基、c
1-6
烯基、c
1-6
炔基、苯基、or
8a
、-oc(o)r
8a
、-c(o)or
8a
、nr
8ar9a
、-nr
8a
cor
9a
、-conr
8ar9a
、3至7元饱和或部分不饱和的单环碳环基或具有1-2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和的单环杂环基；其中r
8a
和r
9a
在每次出现时独立地为h或c
1-6
烷基；
[0173]
p1为no2或甲硅烷基羟基保护基团；
[0174]
r1和r2独立地为h、c
1-6
烷基或苯基；其中c
1-6
烷基和苯基任选地被1-3个r3取代；
[0175]
r3为c
1-30
烷氧基；
[0176]
e为0至6的整数；并且
[0177]
f为0至6的整数。
[0178]
在第一方面的第二实施方案中，本公开提供了一种式i'的化合物
[0179][0180]
或其盐，其中：
[0181]
环a为苯基、8至10元双环芳基、具有1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的5至6元杂芳基或具有1-4个选自氧、氮和硫的杂原子的7至10元双环杂芳基；
[0182]
y为h、卤素、or
1a
、nr
2ar3a
、sr
4a
、cr
5ar6ar7a
或包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团；其中r
1a
、r
2a
、r
3a
、r
4a
、r
5a
、r
6a
和r
7a
独立地为c
1-6
烷基、c
1-6
烯基、c1-6
炔基、苯基、or
8a
、-oc(o)r
8a
、-c(o)or
8a
、nr
8a r
9a
、-nr
8a cor
9a
、-conr
8ar9a
、3至7元饱和或部分不饱和的单环碳环基或具有1-2个选自氧、氮和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和的单环杂环基；其中r
8a
和r
9a
在每次出现时独立地为h或c
1-6
烷基；
[0183]
p1为no2或甲硅烷基羟基保护基团；
[0184]
r1和r2独立地为h、c
1-6
烷基或苯基；其中c
1-6
烷基和苯基任选地被1-3个r3取代；
[0185]
r3为c
1-30
烷氧基；
[0186]
e为0至6的整数；并且
[0187]
f为0至6的整数。
[0188]
在第三实施方案中，本公开提供了一种式b的化合物：
[0189][0190]
或其盐。式b中的其余变量描述于第一实施方案中。
[0191]
在第四实施方案中，本公开提供了一种式b-1或b-2的化合物：
[0192][0193][0194]
或其盐。式b中的其余变量描述于第三实施方案中。
[0195]
在第五实施方案中，本公开提供了一种式i'或b的化合物或其盐，y为包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团。式i'或b中的其余变量描述于第一、第二、第三或第四实施方案中。
[0196]
在第六实施方案中，本公开提供了一种式i'的化合物或其盐，其中环a为苯基或萘基。式i'中的其余变量描述于第二和/或第五实施方案中。
[0197]
在第七实施方案中，本公开提供了一种式i'或b的化合物或其盐，其中p1为选自以下的甲硅烷基羟基保护基团：
[0198][0199][0200]
其中表示p1的附接点；并且r5、r6和r7各自独立地为h、c
1-30
烷基或c
1-30
烷氧基。式i'或b中的其余变量描述于第一至第六实施方案中的任一个中。
[0201]
在第八实施方案中，本公开提供了一种式i'或b的化合物或其盐，其中p1选自由以下组成的组：-o-tbdms、-o-tips、-o-tbdps、-o-tbodps和
–
o-tbdas：
[0202]
[0203]
式i'中的其余变量描述于第一至第七实施方案中的任一个中。
[0204]
在第九实施方案中，本公开提供了一种式i或ia的化合物：
[0205][0206]
或其盐；
[0207]
其中p1选自由以下组成的组：-o-tbdps、-o-tbodps和
–
o-tbdas：
[0208]
式i或ia中的其余变量描述于第一、第二和/或第五至第八实施方案中。
[0209]
在第十实施方案中，本公开提供了一种式i'、b或式i的化合物或其盐，其中y由式a表示：
[0210]
w-v-u-＊(a)
[0211]
其中：
[0212]-＊表示y的附接点；
[0213]
w由式a1、a2、a2-1、a2-2、a3、a3-1或a3-2表示：
[0214]
[0215][0216]
其中
[0217]-＊＊＊表示w和v连接的点；
[0218]
每个rw独立地为具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团；
[0219]
k为1至5的整数；
[0220]
v为键、氧、c
1-20
亚烷基、c
1-6
亚炔基、-c(＝o)-、***-c(＝o)-o-**、***-o-c(＝o)-**、或具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被1-3个r8取代；其中-＊＊表示v和u连接的点；并且r8为h或c
1-30
烷基；并且
[0221]
u为键、氧、c
1-20
亚烷基、羰基、***-o-c(＝o)-**、具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂环基；具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被1-3个r8取代；或由式a4、a5或a6表示的基团：
[0222][0223]
其中u1为c
1-6
亚烷基、c
1-6
亚烷氧基、具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂环基或具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基。式i、ia、b或式i'中的其余变量描述于第一至第九实施方案中的任一个中。
[0224]
在第十一实施方案中，本公开提供了一种式i'、b或式i的化合物或其盐，其中所述tbdas基团为：
[0225][0226]
其中s为1至30的整数。式i、ia、b或式i'中的其余变量描述于第七至第十实施方案中的任一个中。
[0227]
在第十二实施方案中，本公开提供了一种式i'、b或式i或ia的化合物或其盐，其中p1为
–
o-tbdps。式i、ia或式i'或b中的其余变量描述于第一至第十一实施方案中的任一个中。
[0228]
在第十三实施方案中，本公开提供了一种式i、ia、b或i'的化合物或其盐，其中w由式a1表示：
[0229][0230]
其中rw为c
nh2n 1
；并且n为1至30的整数。式i、b或i'中的其余变量描述于第十实施方案中。
[0231]
在第十四实施方案中，本公开提供了一种式i、ia、b或i'的化合物或其盐，其中rw选自由以下组成的组：c
12h25
、c
18h37
、c
20h41
、c
22h45
、c
24h49
、c
26h53
和c
28h57
。式i、ia、b或i'中的其余变量描述于第十至第十三实施方案中的任一个中。
[0232]
在第十五实施方案中，本公开提供了一种式i、ia、b或i'的化合物或其盐，其中v为键、ch2、ch2ch2、c(＝o)、***-c(＝o)-o-**、或式i、ia、b或i'中的其余变量描述于第十至第十四实施方案中的任一个中。
[0233]
在第十六实施方案中，本公开提供了一种式i、ia、b或i'的化合物或其盐，其中u为键、ch2、ch2ch2、羰基、亚三唑基、亚哌嗪基、式i、ia、b或i'中的其余变量描述于第十至第十五实施方案中的任一个中。
[0234]
在第十七实施方案中，本公开提供了一种式i、ia、b或i'的化合物或其盐，其中u-v选自由以下组成的组：
[0235][0236]
其中r8为h或c
1-6
烷基。式i、b或i'中的其余变量描述于第十至第十六实施方案中的任一个中。
[0237]
在第十八实施方案中，本公开提供了一种式i或ia或式i'或b的化合物或其盐，其中y选自由以下组成的组
[0238][0239]
其中
[0240]
r8为h或c
1-6
烷基；并且
[0241]
m为1至5的整数。式i'、b或式i或ia中的其余变量描述于第一至第十二实施方案中的任一个中。
[0242]
在第十九实施方案中，本公开提供了一种式i或ia或式i'的化合物或其盐，其中r1和r2独立地为h或ch3。式i或ia或式i'中的其余变量描述于第一、第二和/或第五至第十八实施方案中。在一个具体实施方案中，r1和r2均为h。在另一个具体实施方案中，r1和r2均为ch3。
[0243]
在第二十实施方案中，本公开提供了一种式i'或式b的化合物或其盐，其中e为0、1或2；并且f为0、1或2。式i'中的其余变量描述于第一、第二、第三和/或第五至第十九实施方案中。
[0244]
在第二十一实施方案中，本公开提供了一种式i、ia、i'或b的化合物或其盐，其中r8为h或c
1-4
烷基。式i、ia、i'或b中的其余变量描述于第十至第二十实施方案中的任一个中。
[0245]
在第二十二实施方案中，本公开提供了一种式ii或iia的化合物：
[0246][0247]
或其盐，其中：
[0248]
t为10至30的整数；
[0249]
选自由以下组成的组
[0250][0251]
其中r8为h或c
1-6
烷基。
[0252]
在第二十三实施方案中，本公开提供了一种式ii的化合物或其盐，其选自由以下组成的组
[0253][0254]
或其盐。
[0255]
在第二十四实施方案中，本公开提供了以下化合物：
[0256]
或其盐。
[0257]
在第二十五实施方案中，本公开提供了一种选自下式中的一个的化合物：
[0258][0259]
或其盐。上式中的其余变量描述于第一实施方案中。在一些实施方案中，a1和a2各自为1至6、1至5或1至4的整数。
[0260]
在第二十六实施方案中，本公开提供了表1中描绘且在示例中制备的化合物、其中性形式和盐。
[0261]
表1
[0262][0263]
2.3'-保护的核苷酸或寡核苷酸
[0264]
在第二方面，本公开描述了一种由本文所述的3'-羟基保护基团保护的核苷酸或
寡核苷酸。在一个实施方案中，3'-羟基保护基衍生自上述试剂。在另一个实施方案中，受保护的核苷酸或寡核苷酸通过选择性沉淀分离。在另一个实施方案中，受保护的核苷酸或寡核苷酸可溶于非极性有机溶剂诸如二氯甲烷中，但在极性有机溶剂诸如乙腈中沉淀。
[0265]
在第二十七实施方案中，本公开提供了一种由式iii或iiip表示的核苷酸或寡核苷酸，
[0266][0267]
或其盐，
[0268]
其中
[0269]r31
在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的nh2(如果存在)任选地被胺保护基团保护；
[0270]r32
在每次出现时独立地选自由以下组成的组：h、卤基、oh和任选地被c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷氧基；其中所述oh基团任选地被羟基保护基团保护；
[0271]r34
在每次出现时独立地为h或与r
32
的所述烷氧基基团形成环；
[0272]r35
为羟基保护基团；
[0273]r36
在每次出现时独立地为h、c
1-6
烷基基团、c
2-6
烯基基团、苯基或苄基基团，这些基团中的每一者任选地被
–
cn、-no2或卤素取代；或者
[0274]r36
为
[0275]
q为1至20的整数；
[0276]
x在每次出现时独立地为o或s；
[0277]
z为由式i
*
或b*表示的基团，
[0278][0279]
其中
[0280]-#表示z的附接点；
[0281]
a1、a2和a3中的一者为ya，而其他为h；
[0282]
为单键或双键；
[0283]
ya为y-(ch2)
a1
ch2o(ch2)
a2-，其中a1和a2各自独立地为0或1至10的整数；
[0284]
环a为苯基、8至10元双环芳基、具有1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的5至6元杂芳基或具有1-4个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的7至10元双环杂芳基；
[0285]
y为h、卤素、or
1a
、nr
2ar3a
、sr
4a
、cr
5ar6ar7a
或包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团；其中r
1a
、r
2a
、r
3a
、r
4a
、r
5a
、r
6a
和r
7a
各自独立地为c
1-6
烷基、c
1-6
烯基、c
1-6
炔基、苯基、or
8a
、-oc(o)r
8a
、-c(o)or
8a
、nr
8ar9a
、-nr
8a
cor
9a
、-conr
8ar9a
、3至7元饱和或部分不饱和的单环碳环基或具有1-2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和的单环杂环基；其中r
8a
和r
9a
在每次出现时独立地为h或c
1-6
烷基；
[0286]
p1为no2或甲硅烷基羟基保护基团；
[0287]
r1和r2独立地为h、c
1-6
烷基或苯基；其中c
1-6
烷基和苯基任选地被1-3个r3取代；
[0288]
r3为c
1-30
烷氧基；
[0289]
e为0至6的整数；并且
[0290]
f为0至6的整数。
[0291]
在第二十八实施方案中，本公开提供了一种由式iii'或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸，
[0292][0293]
或其盐，其中：
[0294]
q为羟基保护基团；
[0295]
为包含被z修饰的nh2基团的核碱基；
[0296]r31
在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的所述nh2(如果存在)任选地被胺保护基团保护；
[0297]r32
在每次出现时独立地选自由以下组成的组：h、卤基、oh和任选地被c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷氧基；其中所述oh基团任选地被羟基保护基团保护；
[0298]r34
在每次出现时独立地为h或与r
32
的所述烷氧基基团形成环；
[0299]r35
为羟基保护基团；
[0300]r36
在每次出现时独立地为h、c
1-6
烷基基团、c
2-6
烯基基团、苯基或苄基基团，这些基团中的每一者任选地被
–
cn、-no2或卤素取代；或者
[0301]r36
为
[0302]
q为1至20的整数；
[0303]
x在每次出现时独立地为o或s；
[0304]
z为由式i
*
或b
*
表示的基团，
[0305][0306]
其中
[0307]-#表示z的附接点；
[0308]
a1、a2和a3中的一者为ya，而其他为h；
[0309]
为单键或双键；
[0310]
ya为y-(ch2)
a1
ch2o(ch2)
a2-，其中a1和a2各自独立地为0或1至10的整数；
[0311]
环a为苯基、8至10元双环芳基、具有1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的5至6元杂芳基或具有1-4个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的7至10元双环杂芳基；
[0312]
y为h、卤素、or
1a
、nr
2ar3a
、sr
4a
、cr
5ar6ar7a
或包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团；其中r
1a
、r
2a
、r
3a
、r
4a
、r
5a
、r
6a
和r
7a
各自独立地为c
1-6
烷基、c
1-6
烯基、c
1-6
炔基、苯基、or
8a
、-oc(o)r
8a
、-c(o)or
8a
、nr
8ar9a
、-nr
8a
cor
9a
、-conr
8ar9a
、3至7元饱和或部分不饱和的单环碳环基或具有1-2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和的单环杂环基；其中r
8a
和r
9a
在每次出现时独立地为h或c
1-6
烷基；
[0313]
p1为no2或甲硅烷基羟基保护基团；
[0314]
r1和r2独立地为h、c
1-6
烷基或苯基；其中c
1-6
烷基和苯基任选地被1-3个r3取代；
[0315]
r3为c
1-30
烷氧基；
[0316]
e为0至6的整数；并且
[0317]
f为0至6的整数。
[0318]
在某些实施方案中，r
32
的羟基保护基团是甲硅烷基保护基团。在某些实施方案中，甲硅烷基保护基团选自由以下组成的组：三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、二甲基(叔丁基乙基)甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二叔丁基甲基甲硅烷基、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基和叔丁氧基二苯基甲硅烷基。
[0319]
在第二十九实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中z为由式i
*
表示的基团，
[0320][0321]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七和/或第二十八实施方案中。
[0322]
在第三十实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中z为由式b
*
表示的基团，
[0323][0324]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七和/或第二十八实施方案中。
[0325]
在第三十一实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中z为由式b-1
*
或b-2
*
表示的基团：
[0326][0327][0328]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七和/或第二十八实施方案中。
[0329]
在第三十二实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中y为包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七和/或第二十八实施方案中。
[0330]
在第三十三实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中环a为苯基或萘基。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七、第二十八和/或第三十二实施方案中。
[0331]
在第三十四实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中p1为选自以下的甲硅烷基羟基保护基团：
[0332][0333][0334]-o-tbdas-1和-o-tbdas-2；其中表示p1的附接点，并且r5、r6和r7各自独立地为h、c
1-30
烷基或c
1-30
烷氧基。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第三十三实施方案中的任一个中。
[0335]
在第三十五实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中p1选自由以下组成的组：
–
o-tbdms、-o-tips、-o-tbdps、-o-tbodps和
–
o-tbdas：
[0336][0337]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第三十四实施方案中的任一个中。
[0338]
在第三十六实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中z为由式i**或ia
**
表示的基团：
[0339][0340]
或其盐，其中p1选自由以下组成的组：-o-tbdps、-o-tbodps和
–
o-tbdas：
[0341]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第三十五实施方案中的任一个中。
[0342]
在第三十七实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中y由式a表示：
[0343]
w-v-u-＊(a)
[0344]
其中：
[0345]-＊表示y的附接点；
[0346]
w由式a1、a2、a2-1、a2-2、a3、a3-1或a3-2表示：
[0347][0348][0349]
其中
[0350]-＊＊＊表示w和v连接的点；
[0351]
每个rw独立地为具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团；
[0352]
k为1至5的整数；
[0353]
v为键、氧、c
1-20
亚烷基、c
1-6
亚炔基、-c(＝o)-、***-c(＝o)-o-**、***-o-c(＝o)-**、或具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被1-3个r8取代；其中-＊＊表示v和u连接的点；并且r8为h或c
1-30
烷基；并且
[0354]
u为键、氧、c
1-20
亚烷基、羰基、***-o-c(＝o)-**、具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂环基；具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被1-3个r8取代；或由式a4、a5或a6表示的基团：
[0355][0356]
其中u1为c
1-6
亚烷基、c
1-6
亚烷氧基、具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂环基或具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第三十六实施方案中的任一个中。
[0357]
在第三十八实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中所述tbdas基团为：
[0358][0359]
其中s为1至30的整数。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第三十四至第三十七实施方案中的任一个中。
[0360]
在第三十九实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中p1为tbdps。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第三十七实施方案中的任一个中。
[0361]
在第四十实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中w由式a1表示：
[0362][0363]
其中rw为c
nh2n 1
；并且n为1至30的整数。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第三十七实施方案中。
[0364]
在第四十一实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中rw选自由以下组成的组：c
12h25
、c
18h37
、c
20h41
、c
22h45
、c
24h49
、c
26h53
和c
28h57
。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第三十七和/或第四十实施方案中。
[0365]
在第四十二实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中v为键、ch2、ch2ch2、c(＝o)-、***-c(＝o)-o-**、或式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第三十七至第四十一实施方案中的任一个中。
[0366]
在第四十三实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中u为键、ch2、ch2ch2、羰基、亚三唑基、亚哌嗪基、式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第三十七至第四十二实施方案中的任一个中。
[0367]
在第四十四实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中u-v选自由以下组成的组
[0368][0369]
其中r8为h或c
1-6
烷基。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第三十七至第四十一实施方案中的任一个中。
[0370]
在第四十五实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中y选自由以下组成的组：
[0371][0372]
其中
[0373]
r8为h或c
1-6
烷基；并且
[0374]
m为1至5的整数。
[0375]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第三十九实施方案中的任一个中。
[0376]
在第四十六实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中r1和r2独立地为h或ch3。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第四十五实施方案中的任一个中。在一个具体实施方案中，r1和r2均为h。在另一个具体实施方案中，r1和r2均为ch3。
[0377]
在第四十七实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中e为0、1或2；并且f为0、1或2。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第四十六实施方案中的任一个中。
[0378]
在第四十八实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中r8为h或c
1-4
烷基。式iii或iiip中的其余变量描述于第三十七实施方案中。在一个实施方案中，r8为h或甲基。
[0379]
在第四十九实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中z由式ii*或iia
*
表示，
[0380][0381]
其中：
[0382]
t为10至30的整数；
[0383]
选自由以下组成的组
[0384][0385]
其中r8为h或c
1-6
烷基。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七和/或第二十八实施方案中。
[0386]
在第五十实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中z为
[0387][0388]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第四十九实施方案中。
[0389]
在第五十一实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中z为
[0390][0391]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七和/或第二十八实施方案中。
[0392]
在第五十二实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中z为
[0393][0394]
式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七和/或第二十八实施方案中。在一些实施方案中，a1和a2各自为1至6、1至5或1至4的整数。
[0395]
在第五十三实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中当x为s时，硫代磷酸基团具有如下所示的s-构型：
[0396][0397]
如下所示的r-构型：
[0398][0399]
其中表示与3'-oh基团的连接点并且表示与5'-oh基团的连接点。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第五十二实施方案中的任一个中。
[0400]
在某些实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中r
31
在每次出现时为腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)或尿嘧啶(u)。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第五十三实施方案中的任一个中。
[0401]
在某些实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中r
32
在每次出现时独立地为h、f、cl、br、i或
–
och2ch2ome。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第五十三实施方案中的任一个中。在一个具体实施方案中，r
32
在每次出现时独立地为h或
–
och2ch2ome。
[0402]
在某些实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中r
34
为h。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第五十三实施方案中的任一个中。
[0403]
在某些实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中r
35
为4,4'-二甲氧基三苯甲基。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第五十三实施方案中的任一个中。
[0404]
在某些实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中r
36
为
–
ch2ch2cn。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第五十三实施方案中的任一个中。
[0405]
在某些实施方案中，本公开提供了一种由式iii、iii'、iiip或iiip'表示的核苷酸或寡核苷酸或其盐，其中r
32
为
–
och2ch2ome。式iii、iii'、iiip或iiip'中的其余变量描述于第二十七至第五十三实施方案中的任一个中。
[0406]
3.用于制备寡核苷酸片段的方法
[0407]
在第三方面，本公开描述了一种用于制备在3'端处带有羟基保护基团(例如，疏水性羟基保护基团)(当片段带有疏水性羟基保护基团时，其可以在本文中被称为“3'-片段”)或在核碱基处带有氨基保护基团(当核碱基包含nh2基团时，其可以在本文中被称为“核碱基silhpg片段”)的寡核苷酸片段的方法。人们惊奇地发现，本公开的用于合成3'-片段或核碱基silhpg片段的方法可以用于以高纯度制备具有3至20个(例如，3至10、3至8、3至5或4至5个)核苷酸的寡核苷酸片段而无需色谱纯化。在一些实施方案中，使用疏水性3'-羟基保护基团，其促进通过选择性沉淀分离寡核苷酸片段产物。在一些实施方案中，使用疏水性氨基保护基团，其促进通过选择性沉淀分离寡核苷酸片段产物。在一些实施方案中，该液相方法包括(1)5'-oh脱保护步骤、(2)偶联步骤和(3)氧化或硫化步骤，其中重复步骤(1)、(2)和(3)直到所需数量的核苷酸连接在一起以形成3'-寡核苷酸片段。
[0408]
在第五十四实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(v)的寡核苷酸片段，
[0409][0410]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0411]
1)将以下脱保护：式(va)的化合物：
[0412][0413]
或其盐，以形成式(vb)的化合物：
[0414]
或其盐；
[0415]
2)使式(vb)的所述化合物或其盐与以下反应：式(vc)的化合物：
[0416][0417]
或其盐，以形成式(vd)的化合物，
[0418]
或其盐；
[0419]
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(vd)的所述化合物或其盐，以形成式(ve)的化合物：
[0420]
或其盐；
[0421]
4)将式(ve)的所述化合物或其盐脱保护，以形成式(vf)的化合物：
[0422]
或其盐；
[0423]
5)当q等于或大于2时，从式(vf)的所述化合物开始，重复步骤2)、3)和4)q-2次，随后重复步骤2)和3)，得到式(v)的片段或其盐，其中：
[0424]r31
在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的nh2(如果存在)被胺保护基团保护；
[0425]r32
在每次出现时独立地选自由以下组成的组：h、卤基、oh和任选地被c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷氧基；其中所述oh基团任选地被羟基保护基团保护；
[0426]r34
在每次出现时独立地为h或与r
32
的所述烷氧基基团形成环；
[0427]r35
为羟基保护基团；
[0428]r36
在每次出现时独立地为c
1-6
烷基基团、c
2-6
烯基基团、苯基或苄基基团，这些基团中的每一者任选地被
–
cn、-no2或卤素取代；或者
[0429]r36
为
[0430]r37a
和r
37b
独立地为c
1-6
烷基；
[0431]
q为1至20的整数；
[0432]
x在每次出现时独立地为o或s；
[0433]
z为由式i
*
或b*表示的基团，
[0434][0435]
其中
[0436]
#表示z的附接点；
[0437]
a1、a2和a3中的一者为ya，而其他为h；
[0438]
为单键或双键；
[0439]
ya为y-(ch2)
a1
ch2o(ch2)
a2-，其中a1和a2各自独立地为0或1至10的整数；
[0440]
环a为苯基、8至10元双环芳基、具有1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的5至6元杂芳基或具有1-4个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的7至10元双环杂芳基；
[0441]
y为h、卤素、or
1a
、nr
2ar3a
、sr
4a
、cr
5ar6ar7a
或包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团；其中r
1a
、r
2a
、r
3a
、r
4a
、r
5a
、r
6a
和r
7a
各自独立地为c
1-6
烷基、c
1-6
烯基、c
1-6
炔基、苯基、or
8a
、-oc(o)r
8a
、-c(o)or
8a
、nr
8ar9a
、-nr
8a
cor
9a
、-conr
8ar9a
、3至7元饱和或部分不饱和的单环碳环基或具有1-2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和的单环杂环基；其中r
8a
和r
9a
在每次出现时独立地为h或c
1-6
烷基；
[0442]
p1为no2或甲硅烷基羟基保护基团；
[0443]
r1和r2独立地为h、c
1-6
烷基或苯基；其中c
1-6
烷基和苯基任选地被1-3个r3取代；
[0444]
r3为c
1-30
烷氧基；
[0445]
e为0至6的整数；并且
[0446]
f为0至6的整数。
[0447]
在第五十五实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(v')的寡核苷酸片段，
[0448][0449]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0450]
1)将以下脱保护：式(va)的化合物：
[0451][0452]
或其盐，以形成式(vb)的化合物：
[0453]
或其盐；
[0454]
2)使式(vb)的所述化合物或其盐与以下反应：式(vc')的化合物：
[0455][0456]
或其盐，以形成式(vd')的化合物，
[0457]
或其盐；
[0458]
3)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(vd')的所述化合物或其盐，以形成式(ve')的
化合物：
[0459]
或其盐；
[0460]
4)将式(ve')的所述化合物或其盐脱保护，以形成式(vf')的化合物：
[0461]
或其盐；
[0462]
5)当q等于或大于2时，从式(vf')的所述化合物开始，重复步骤2)、3)和4)q-2次，随后重复步骤2)和3)，得到式(v')的所述片段或其盐，其中：
[0463]r31
、r
32
、r
34
、r
35
、q、x和z如上文在第五十四实施方案中针对式(v)所述。
[0464]
在第五十六实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(v-c1)或(v-c2)的寡核苷酸片段，
[0465][0466]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0467]
1)使式(vb)的所述化合物，
[0468][0469]
或其盐与以下反应：式(v-cr1)或(v-cr2)的化合物，
[0470][0471][0472]
或其盐，以及碱，以形成式(v-c1)或(v-c2)的所述化合物，其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q、x和z如上文在第五十四实施方案中针对式(v)所述。式(vb)与(v-cr1)的反应形成式
(v-c1)的化合物，并且式(vb)与(v-cr2)的反应形成式(v-c2)的化合物。
[0473]
在第五十七实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(v-c1)或(v-c2)的寡核苷酸片段，
[0474][0475]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0476]
1)使式(vb)的所述化合物，
[0477][0478]
或其盐与以下反应：式(vr1)或(vr2)的试剂，
[0479][0480]
以形成式(v-cr3)或(v-cr4)的化合物，
[0481][0482]
或其盐；
[0483]
2)使式(v-cr3)或(v-cr4)的所述化合物或其盐与以下反应：式(vg)的化合物：
[0484][0485]
或其盐，以及碱，以形成式(v-c1)或(v-c2)的化合物，其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q、x
和z如上文在第五十四实施方案中针对式(v)所述。试剂(vr1)与式(vb)的化合物的反应形成式(v-cr3)的化合物，其与式(vg)的化合物反应以形成式(v-c1)的化合物。试剂(vr2)与式(vb)的化合物的反应形成式(v-cr4)的化合物，其与式(vg)的化合物反应以形成式(v-c2)的化合物。
[0486]
在第五十八实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(vbz)的寡核苷酸片段，
[0487][0488]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0489]
1)使式(vbz-1)的所述化合物，
[0490][0491]
或其盐与以下反应：式(vbz-2)的化合物，
[0492]
[0493]
或其盐，以形成式(vbz-3)的化合物，
[0494][0495]
或其盐；
[0496]
2)用硫化剂或氧化剂硫化或氧化式(vbz-3)的所述化合物或其盐，以形成式(vbz)的化合物或其盐；
[0497]
其中：
[0498]
q为羟基保护基团；
[0499]
为包含被z修饰的nh2基团的核碱基；并且r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、r
37a
、r
37b
、q、x和z如上文在第五十四实施方案中针对式(v)所述。
[0500]
在第五十九实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十八实施方案中所述的式(vbz)的寡核苷酸片段或其盐的方法，其中式vbz-1的所述化合物通过以下来制备
[0501]
1)使式(vbz-4)的所述化合物，
[0502][0503]
或其盐与z-oh反应，以形成式vbz-5的化合物，
[0504][0505]
或其盐；
[0506]
2)将式(vbz-5)的所述化合物脱保护，以形成式(vbz-1)的所述化合物。
[0507]
在第六十实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十四至第五十九实施方案中所述的式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)或(vbz)的寡核苷酸片段或其盐的方法，其中y为包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团。式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)或(vbz)中的其余变量描述于第五十四至第五十九实施方案中的任一个中。
[0508]
在第六十一实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十四至第五十九实施方案中所述的式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)或(vbz)的寡核苷酸片段或其盐的方法，其中不使用色谱法来纯化步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物。
[0509]
在第六十二实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十四至第五十九实施方案中所述的式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)或(vbz)的寡核苷酸片段或其盐的方法，其中步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物通过选择性沉淀来纯化。在某些实施方案中，步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物或其盐的选择性沉淀可以通过将乙腈添加到粗产物在dcm中的溶液中来实现。另选地，可以将粗产物的溶液添加到乙腈中以沉淀出所需产物。
[0510]
在某些实施方案中，除了选择性沉淀之外，步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物或其盐还通过用水性溶液(例如，nahco3/h2o或nacl/h2o)萃取有机溶剂(mbte、etoac、庚烷/mbte混合物、dcm等)中包含步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物或其盐的溶液来纯化。在某些实施方案中，萃取在选择性沉淀之前进行。另选地，萃取在选择性沉淀之后进行。在某些实施方案中，步骤1)、2)、3)和4)中任一个的反应产物或其盐的选择性沉淀可以通过将庚烷或庚烷/mbte混合物添加到粗产物在dcm或etoac中的溶液中来实现。另选地，可以将粗产物的溶液添加到庚烷或庚烷/mbte混合物中以沉淀出所需产物。可以使用具有合适体积比(例如，本文所述的体积比)的庚烷/mbte混合物。
[0511]
在第六十三实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(v)的寡核苷酸片段
[0512][0513]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0514]
a)使式(v-1)的核苷酸：
[0515]
或其盐，与以下在溶液中偶联：式(v-2)的寡核苷酸片段：
[0516]
或其盐，以形成式(v-3)的寡核苷酸片段，
[0517]
或其盐；以及
[0518]
b)硫化或氧化式(v-3)的所述寡核苷酸或其盐，以形成式(v)的寡核苷酸：
[0519]
或其盐；
[0520]
其中：
[0521]r31
在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的nh2(如果存在)被胺保护基团保护；
[0522]r32
在每次出现时独立地选自由以下组成的组：h、卤基、oh和任选地被c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷氧基；其中所述oh基团任选地被羟基保护基团保护；
[0523]r34
在每次出现时独立地为h或与r
32
的所述烷氧基基团形成环；
[0524]r35
为羟基保护基团；
[0525]r36
在每次出现时独立地为c
1-6
烷基基团、c
2-6
烯基基团、苯基或苄基基团，这些基团中的每一者任选地被
–
cn、-no2或卤素取代；或者
[0526]r36
为
[0527]r37a
和r
37b
独立地为c
1-6
烷基；
[0528]
q为1至20的整数；
[0529]
x在每次出现时独立地为o或s；
[0530]
z为由式i
*
或b
*
表示的基团，
[0531][0532]
其中
[0533]
#表示z的附接点；
[0534]
a1、a2和a3中的一者为ya，而其他为h；
[0535]
为单键或双键；
[0536]
ya为y-(ch2)
a1
ch2o(ch2)
a2-，其中a1和a2各自独立地为0或1至10的整数；
[0537]
环a为苯基、8至10元双环芳基、具有1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的5至6元杂芳基或具有1-4个选自氧、氮和硫的杂原子的7至10元双环杂芳基；
[0538]
y为h、卤素、or
1a
、nr
2ar3a
、sr
4a
、cr
5ar6ar7a
或包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团；其中r
1a
、r
2a
、r
3a
、r
4a
、r
5a
、r
6a
和r
7a
独立地为c
1-6
烷基、c
1-6
烯基、c
1-6
炔基、苯基、or
8a
、-oc(o)r
8a
、-c(o)or
8a
、nr
8ar9a
、-nr
8a
cor
9a
、-conr
8ar9a
、3至7元饱和或部分不饱和的单环碳环基或具有1-2个选自氧、氮和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和的单环杂环基；其中r
8a
和r
9a
在每次出现时独立地为h或c
1-6
烷基；
[0539]
p1为no2或甲硅烷基羟基保护基团；
[0540]
r1和r2独立地为h、c
1-6
烷基或苯基；其中c
1-6
烷基和苯基任选地被1-3个r3取代；
[0541]
r3为c
1-30
烷氧基；
[0542]
e为0至6的整数；并且
[0543]
f为0至6的整数。
[0544]
在第六十四实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(v*)的寡核苷酸片段，
[0545][0546]
或其盐，所述方法包括以下步骤：
[0547]
a)使式(v-1)的核苷酸：
[0548]
或其盐，
[0549]
与以下在溶液中偶联：式(v-2')的寡核苷酸片段：
[0550]
或其盐，以形成式(v-3')的寡核苷酸片段，
[0551]
或其盐；以及
[0552]
b)硫化或氧化式(v-3')的所述寡核苷酸或其盐，以形成式(v*)的所述寡核苷酸或其盐；其中r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、r
37a
、r
37b
、q、x和z如上文在第六十三实施方案中针对式(v)所述。
[0553]
在第六十五实施方案中，本公开提供了一种用于制备第六十三或第六十四实施方案中所述的式(v)或(v*)的寡核苷酸片段或其盐的方法，其中y为包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团。
[0554]
在第六十六实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十四或第六十三实施方案中所述的式(v)的寡核苷酸片段或其盐的方法，所述方法还包括将式(v)的片段脱保护以形成式(vh)的脱保护片段：
[0555]
或其盐。
[0556]
在第六十七实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十五实施方案中所述的式(v')的寡核苷酸片段或其盐的方法，所述方法还包括将式(v')的所述片段脱保护以形成式(vh')的脱保护片段：
[0557]
或其盐。
[0558]
在第六十八实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十六或第五十七实施方案中所述的式(v-c1)或(v-c2)的寡核苷酸片段或其盐的方法，所述方法还包括将式(v-c1)或(v-c2)的所述片段脱保护以形成式(v-c3)或(v-c4)的脱保护片段：
[0559]
或其盐，或
[0560]
或其盐。
[0561]
在第六十九实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十八实施方案中所述的式(vbz)的寡核苷酸片段或其盐的方法，所述方法还包括将式(vbz)的所述片段脱保护以形成式(vbz-6)的脱保护片段：
[0562]
或其盐。
[0563]
在第七十实施方案中，本公开提供了一种用于制备第六十四实施方案中所述的式(v*)的寡核苷酸片段或其盐的方法，所述方法还包括将式(v*)的所述片段脱保护以形成式(v*-1)的脱保护片段：
[0564]
或其盐。
[0565]
在第七十一实施方案中，本公开提供了一种用于制备第五十四至第六十四实施方案中所述的式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)、(vbz)或(v*)的寡核苷酸片段或其盐的方法，所述方法还包括使式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)、(vbz)或(v*)的所述片段的脱甲硅烷化，以分别形成式(vj)、(vj')、(v-c5)、(v-c6)、(vbz-7)或(v*-2)的片段：
[0566]
或其盐，
[0567]
或其盐，
[0568][0569]
或其盐，
[0570]
或其盐，
[0571]
或其盐，或
[0572]
或其盐。在一个实施方案中，当式(vbz)中的q和p1相同时，脱甲硅烷基化反应形成式(vbz-7')的化合物：
[0573][0574]
在第七十二实施方案中，本公开提供了一种用于制备第七十一实施方案中任一项所述的式(vj)、(vj')、(v-c5)、(v-c6)、(vbz-7)或(v*-2)的所述片段的方法，其中所述脱甲硅烷基化反应通过使式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)、(vbz)或(v*)的所述化合物与hf在碱存在下反应来进行。
[0575]
在第七十三实施方案中，本公开提供了一种第七十二实施方案中所述的方法，其中所述碱为咪唑或吡啶，其中所述咪唑或吡啶任选地被取代。在某些实施方案中，所述吡啶和/或咪唑各自独立地被一至三个选自卤素、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、-oh和c
1-6
卤代烷基的取代基取代。
[0576]
在第七十四实施方案中，本公开提供了一种第七十三实施方案中所述的方法，其中所述脱甲硅烷基化反应通过使式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)、(vbz)或(v*)的所述化合物与hf在吡啶和咪唑存在下反应来进行。
[0577]
在第七十五实施方案中，本公开提供了一种第七十四实施方案中所述的方法，其中咪唑与hf的摩尔比在0.5:1至10:1的范围内。
[0578]
在第七十六实施方案中，本公开提供了一种第七十五实施方案中所述的方法，其中咪唑与hf的摩尔比在1.1:1至5:1的范围内。
[0579]
在第七十七实施方案中，本公开提供了一种第七十六实施方案中所述的方法，其中咪唑与hf的摩尔比在2:1的范围内。
[0580]
在第七十八实施方案中，本公开提供了一种第七十四至第七十七实施方案中所述的方法，其中吡啶与hf的摩尔比在100:1至1:1的范围内。
[0581]
在第七十九实施方案中，本公开提供了一种第七十四至第七十七实施方案中所述的方法，其中吡啶与hf的摩尔比在1:1的范围内。
[0582]
在第八十实施方案中，本公开提供了一种第五十四至第七十一实施方案中的任一个中所述的方法，其中式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)、(vbz)、(v*)、(vh)、(vh')、(v-c3)、(v-c4)、(vbz-6)、(v*-1)、(vj)、(vj')、(v-c5)、(v-c6)、(vbz-7)、(vbz-7')或(v*-2)的所述片段不通过色谱法纯化。
[0583]
在第八十一实施方案中，本公开提供了一种第八十实施方案中所述的方法，其中式(v)、(v')、(v-c1)、(v-c2)、(vbz)、(v*)、(vh)、(vh')、(v-c3)、(v-c4)、(vbz-6)、(v*-1)、(vj)、(vj')、(v-c5)、(v-c6)、(vbz-7)、(vbz-7')或(v*-2)的所述片段通过选择性沉淀和/或萃取来纯化。
[0584]
在第八十二实施方案中，本公开提供了一种第五十四至第八十一实施方案中的任一个中所述的方法，其中q为2至5。
[0585]
在第八十三实施方案中，本公开提供了一种任一第八十二实施方案中所述的方法，其中q为4。
[0586]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任何实施方案(例如，第六十五至第七十五实施方案)中所述的方法，变量r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q和/或z描述于第二方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第二十七至第三十三实施方案)中。
[0587]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，5'-oh脱保护步骤是用于除去5'-三苯甲基基团的脱三苯甲基化方法。发现当脱三苯甲基化反应在无水或基本上无水的条件下进行时，可以实现副反应(例如，核碱基胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶或它们的常用于寡核苷酸合成的衍生物的脱氨作用)的显著减少。本脱三苯甲基化方法还包括添加阳离子清除剂以促进反应的完成。因此，可以获得具有高纯度的产物而不需要色谱法(例如，柱色谱法)。脱三苯甲基化反应的水含量可以通过使用干燥剂(例如，分子筛)、共沸蒸馏或本领域已知的其他合适方法来控制。另选地，脱三苯甲基化反应中使用的溶剂、酸和其他试剂、要进行脱三苯甲基化反应的底物以及反应容器可以在用于脱三苯甲基化反应之前干燥以满足残余水含量。
[0588]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，r
36
为以下中的一个：
[0589][0590]
参见nat biotechnol.2017年9月；35(9):845-851；j.org.chem.1999,64,7515-7522；biopolymers(peptide science),2001,60,3，这些文献中的每一者通过引用并入本文。
[0591]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，5'-oh脱保护(或脱三苯甲基化)反应在干燥剂存在下进行。任何合适的干燥剂可以用于脱保护反应中。在一些实施方案中，干燥剂选自氯化钙、氯化钾、硫酸钠、硫酸钙、硫酸镁和分子筛。
[0592]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，干燥剂是分子筛。
[0593]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，分子筛的尺寸为或在一个实施方案中，分子筛的尺寸为
[0594]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，用于脱保护反应的无水或基本上无水的溶液通过在脱保护反应之前使用共沸蒸馏除去水来获得。
[0595]
另选地，溶剂、酸或酸溶液以及包含要在脱三苯甲基化反应中使用的试剂的其他试剂或溶液、要进行脱三苯甲基化反应的底物或底物溶液以及反应容器可以在脱三苯甲基化反应之前单独或组合干燥。
[0596]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，脱保护反应在选自以下的清除剂存在下进行：包含
–
sh基团的阳离子清除剂、硅烷清除剂(诸如hsiph3、hsibu3、三异丙基硅烷等)、硅氧烷、聚苯乙烯、呋喃、吡咯和吲哚。
[0597]
在某些实施方案中，脱保护反应在选自以下的清除剂存在下进行：1-十二烷硫醇、环己烷硫醇、1-辛烷硫醇、三异丙基硅烷、吲哚、2,3-二甲基呋喃、二苯基硅烷、2-巯基咪唑、二苯基甲基硅烷、苯基硅烷、5-甲氧基吲哚、甲基苯基硅烷、氯二甲基硅烷、1,1,3,3-四甲基二硅氧烷、1-硫代甘油、三苯基硅烷、叔丁基二甲基硅烷、丁基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、1,1,3,3,5,5-六甲基三硅氧烷、己基硅烷、(巯基甲基)聚苯乙烯或二甲基苯基硅烷。
[0598]
在某些实施方案中，阳离子清除剂是具有式rsh的化合物，其中r为烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团，这些基团中的每一者任选地被取代。
[0599]
在某些实施方案中，阳离子清除剂是ch3(ch2)5sh、ch3(ch2)
11
sh、环己烷硫醇(cysh)或ch3ch2oc(＝o)ch2ch2sh。
[0600]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，r
35
为4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmt)基团。
[0601]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，脱保护反应通过使式(va)的化合物与脱三苯甲基化试剂反应来进行。可以使用任何合适的脱三苯甲基化试剂。
[0602]
在某些实施方案中，脱三苯甲基化试剂是强有机酸。
[0603]
在某些实施方案中，脱三苯甲基化试剂选自cf3cooh、ccl3cooh、chcl2cooh、ch2clcooh、h3po4、甲磺酸(msa)、苯磺酸(bsa)、cclf2cooh、chf2cooh、phso2h(苯基亚磺酸)等。在一个优选实施方案中，脱三苯甲基化试剂是ch2clcooh。在另一个具体实施方案中，脱三苯甲基化试剂是cf3cooh。在又一个具体实施方案中，脱三苯甲基化试剂是chcl2cooh。
[0604]
在某些实施方案中，脱三苯甲基化试剂是柠檬酸。在某些实施方案中，脱三苯甲基化试剂是饱和柠檬酸溶液。
[0605]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，步骤2)的偶联反应可以在本文中所述的活化剂(例如，第三十九实施方案中所述的活化剂)存在下进行。在某些实施方案中，活化剂是4,5-二氰基咪唑(dci)或5-乙硫基-1h-四唑(ett)。
[0606]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，步骤3)的硫化反应使用硫化剂(诸如3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(氢化黄原素或adtt)、3-(n,n-二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑(ddtt)、苯乙酰基二硫化物(pads)、3h-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(beaucage reagent)或苯基-3h-1,2,4-二硫唑-3-酮(pos))进行。在一个具体实施方案中，硫化剂是ddtt。在一个具体实施方案中，硫化剂是氢化黄原素。在某些实施方案中，硫化反应在如本文所述的碱存在下进行。在某些实施方案中，碱是吡啶或咪唑。在某些实施方案中，步骤3)的硫化反应在ddtt和4,5-二氰基咪唑(dci)存在下进行。
[0607]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，步骤3)的氧化反应通过使用文献中已知的标准氧化剂来进行。例示性氧化剂包括但不限于叔丁基过氧化氢(t-buooh)、(1s)-( )-(10-樟脑磺酰基)氧杂吖丙啶(cso)、(1r)-(-)-(10-樟脑磺酰基)氧杂吖丙啶(cso的对映异构体)、i2和碘-吡啶-水氧化剂溶液。在一个具体实施方案中，氧化剂是t-buooh。
[0608]
在某些实施方案中，对于第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的方法，偶联/氧化/脱三苯甲基化步骤在一锅反应中进行。在某些实施方案中，一锅反应中的氧化剂是bpo或tbuooh：
[0609][0610]
4.制备目标寡核苷酸的方法
[0611]
在第四方面，本公开描述了一种用于制备目标寡核苷酸的方法，其中所述目标寡核苷酸在3'-末端至5'-末端的方向(3'-5'方向)上组装。已经证明，本公开的方法成功地用于大量合成目标寡核苷酸。另外，可以通过本公开的方法而无需色谱纯化来获得高纯度的受保护的目标寡核苷酸。
[0612]
在某些实施方案中，本文所述的方法包括在液相(溶液)中逐步添加寡核苷酸片段以合成目标寡核苷酸。例如，首先偶联5聚体和4聚体片段以合成9聚体片段，使该9聚体片段进一步与另一5聚体片段反应以合成14聚体寡核苷酸。可以使14聚体寡核苷酸进一步与另一片段偶联，直到获得所需长度的目标寡核苷酸。在某些实施方案中，首先使具有3'-疏水性羟基保护基团(3'-lhpg)(3'端片段)或在核碱基处具有氨基保护基团(当核碱基包含nh2基团时，其可以在本文中被称为“核碱基lhpg片段”)的5聚体片段与5聚体片段偶联以形成具有3'-lhpg基团或核碱基lhpg基团的10聚体片段，然后使该10聚体片段进一步与4聚体片段反应以形成14聚体片段，又使该14聚体片段与另一4聚体片段偶联以形成目标18聚体寡核苷酸。在某些实施方案中，具有n个核苷酸的3'端片段(例如，5聚体片段)通过使具有3'-lhpg基团的单个核苷酸与具有n-1个核苷酸的片段(例如，4聚体片段)偶联来合成。在某些实施方案中，具有n个核苷酸的核碱基lhpg片段(例如，5聚体片段)通过使在核碱基处具有lhpg基团的单个核苷酸与具有n-1个核苷酸的片段(例如，4聚体片段)偶联来合成。
[0613]
在第八十四实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(vi)或(vi-1)的寡核苷酸，
[0614][0615]
或其盐，所述方法包括
[0616]
a)使式(f1)或(f1-1)的寡核苷酸片段：
[0617][0618]
或其盐，
[0619]
与以下在溶液中偶联：式(f2)的寡核苷酸片段：
[0620]
或其盐，以形成式(f3)或(f3-1)的寡核苷酸片段，
[0621][0622][0623]
或其盐；以及
[0624]
b)硫化或氧化式(f3)或(f3-1)的所述寡核苷酸片段或其盐，以形成式(vi)或(vi-1)的所述寡核苷酸或其盐，
[0625]
其中：
[0626]
q为羟基保护基团；
[0627]
为包含被z修饰的nh2基团的核碱基；
[0628]r31
在每次出现时独立地为核碱基，其中所述核碱基的所述nh2(如果存在)被胺保护基团保护；
[0629]r32
在每次出现时独立地选自由以下组成的组：h、卤基、oh和任选地被c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷氧基；其中所述oh基团任选地被羟基保护基团保护；
[0630]r34
在每次出现时独立地为h或与r
32
的所述烷氧基基团形成环；
[0631]r35
为羟基保护基团；
[0632]r36
在每次出现时独立地为c
1-6
烷基基团、c
2-6
烯基基团、苯基或苄基基团，这些基团中的每一者任选地被
–
cn、-no2或卤素取代；或者
[0633]r36
为
[0634]r37a
和r
37b
独立地为c
1-6
烷基；
[0635]
p为2至20的整数；
[0636]
o为1至200的整数；
[0637]
x在每次出现时独立地为o或s；
[0638]
z为由式i
*
或b
*
表示的基团，
[0639][0640]
其中
[0641]
#表示z的附接点；
[0642]
a1、a2和a3中的一者为ya，而其他为h；
[0643]
为单键或双键；
[0644]
ya为y-(ch2)
a1
ch2o(ch2)
a2-，其中a1和a2各自独立地为0或1至10的整数；
[0645]
环a为苯基、8至10元双环芳基、具有1至3个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的5至6元杂芳基或具有1-4个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的7至10元双环杂芳基；
[0646]
y为h、卤素、or
1a
、nr
2ar3a
、sr
4a
、cr
5ar6ar7a
或包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团；其中r
1a
、r
2a
、r
3a
、r
4a
、r
5a
、r
6a
和r
7a
各自独立地为c
1-6
烷基、c
1-6
烯基、c
1-6
炔基、苯基、or
8a
、-oc(o)r
8a
、-c(o)or
8a
、nr
8ar9a
、-nr
8a
cor
9a
、-conr
8ar9a
、3至7元饱和或部分不饱和的单环碳环基或具有1-2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3至7元饱和或部分不饱和的单环杂环基；其中r
8a
和r
9a
在每次出现时独立地为h或c
1-6
烷基；
[0647]
p1为no2或甲硅烷基羟基保护基团；
[0648]
r1和r2独立地为h、c
1-6
烷基或苯基；其中c
1-6
烷基和苯基任选地被1-3个r3取代；
[0649]
r3为c
1-30
烷氧基；
[0650]
e为0至6的整数；并且
[0651]
f为0至6的整数。
[0652]
在第八十五实施方案中，本公开提供了一种用于制备以下的方法：式(vi')或(vi'-1)的寡核苷酸，
[0653][0654]
或其盐，所述方法包括a)使式(f1)或(f1-1)的寡核苷酸片段：
[0655][0656]
或其盐与以下在溶液中偶联：式(f2')的寡核苷酸片段：
[0657][0658]
或其盐，以形成式(f3')或(f3'-1)的寡核苷酸片段，
[0659][0660]
或其盐；以及
[0661]
b)硫化或氧化式(f3')或(f3'-1)的所述寡核苷酸片段或其盐，以形成式(vi')或(vi'-1)的所述寡核苷酸或其盐，
[0662]
其中q、r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、r
37a
以及r
37b
、p、o、x和z如上文在第八十四实施方案中针对式(vi)或(vi-1)所述。
[0663]
在第八十六实施方案中，本公开提供了一种用于制备第八十四或第八十五实施方案中所述的式(vi)、(vi')、(vi-1)或(vi'-1)的寡核苷酸的方法，其中y为包含一个或多个具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团的疏水基团。
[0664]
在第八十七实施方案中，本公开提供了一种用于制备第八十四或第八十五实施方案中所述的式(vi)、(vi')、(vi-1)或(vi'-1)的寡核苷酸的方法，所述方法还包括步骤c)将式(vi)、(vi')、(vi-1)或(vi'-1)的所述寡核苷酸脱保护，以形成式(vii)、(vii-1)、(vii')或(vii'-1)的寡核苷酸：
[0665]
[0666]
[0667][0668]
或其盐。
[0669]
在第八十八实施方案中，本公开提供了一种用于制备第八十七实施方案中所述的式(vii)、(vii-1)、(vii')或(vii'-1)的寡核苷酸的方法，其中从式(vii)、(vii-1)、(vii')或(vii'-1)的寡核苷酸开始，所述方法还包括重复步骤a)、b)和c)1至10次，随后重复步骤a)和b)，以形成具有所需长度的目标寡核苷酸。
[0670]
在第八十九实施方案中，本公开提供了一种第八十八实施方案中所述的方法，其中所述方法还包括重复步骤a)、b)和c)1至3次，随后重复步骤a)和b)，以形成具有所需长度的目标寡核苷酸。
[0671]
在第九十实施方案中，本公开提供了一种第八十四至第八十九实施方案中所述的方法，其中o为2至20的整数。
[0672]
在第九十一实施方案中，本公开提供了一种第九十实施方案中所述的方法，其中o为2至5的整数。
[0673]
在第九十二实施方案中，本公开提供了一种第九十一实施方案中所述的方法，其中o为4。
[0674]
在第九十三实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十二实施方案中的任一个)中所述的方法，其中z为由式i
*
表示的基团，
[0675][0676]
在第九十四实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十二实施方案中的任一个)中所述的方法，其中z为由式b
*
表示的基团，
[0677][0678]
在第九十五实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十二实施方案中的任一个)中所述的方法，其中z为由式b-1
*
或b-2
*
表示的基团：
[0679][0680]
在第九十六实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十二实施方案中的任一个)中所述的方法，其中环a为苯基或萘基。
[0681]
在第九十七实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十六实施方案中的任一个)中所述的方法，其中p1为选自以下的甲硅烷基羟基保护基团：
[0682][0683]
其中表示p1的附接点，并且r5、r6和r7各自独立地为h、c
1-30
烷基或c
1-30
烷氧基。
[0684]
在第九十八实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十七实施方案中的任一个)中所述的方法，其中p1选自由以下组成的组：
–
o-tbdms、-o-tips、-o-tbdps、-o-tbodps和
–
o-tbdas：
[0685][0686]
在第九十九实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十三实施方案中的任一个)中所述的方法，其中z为由式i
**
或ia
**
表示的基团：
[0687][0688]
或其盐；
[0689]
其中p1选自由以下组成的组：-o-tbdps、-o-tbodps和
–
o-tbdas：
[0690]
并且r5、r6和r7各自独立地为h、c
1-30
烷基或c
1-30
烷氧基。
[0691]
在第一百实施方案中，本公开提供了第三或第四方面(例如，第五十四至第九十九实施方案中的任一个)中所述的方法，其中y由式a表示：
[0692]
w-v-u-＊(a)
[0693]
其中：
[0694]-＊表示y的附接点；
[0695]
w由式a1、a2、a2-1、a2-2、a3、a3-1或a3-2表示：
[0696][0697][0698]
其中
[0699]-＊＊＊表示w和v连接的点；
[0700]
每个rw独立地为具有10个或更多个碳原子的脂族烃基团；
[0701]
k为1至5的整数；
[0702]
v为键、氧、c
1-20
亚烷基、c
1-6
亚炔基、-c(＝o)-、***-c(＝o)-o-**、***-o-c(＝o)-**、或具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被1-3个r8取代；其中-＊＊表示v和u连接的点；并且r8为h或c
1-30
烷基；并且
[0703]
u为键、氧、c
1-20
亚烷基、羰基、***-o-c(＝o)-**、具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂环基；具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被1-3个r8取代；或由式a4、a5或a6表示的基团：
[0704][0705]
其中u1为c
1-6
亚烷基、c
1-6
亚烷氧基、具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂环基或具有1至3个选自氧、氮和硫的杂原子的5至7元杂芳基。
[0706]
在第一百零一实施方案中，本公开提供了一种第九十七至第一百实施方案中的任
一个中所述的方法，其中所述tbdas基团为：
[0707][0708]
其中s为1至30的整数。
[0709]
在第一百零二实施方案中，本公开提供了一种第五十四至第一百实施方案中所述的方法，其中p1为tbdps。
[0710]
在第一百零三实施方案中，本公开提供了一种第一百至第一百零二实施方案中所述的方法，其中w由式a1表示：
[0711][0712]
其中rw为c
nh2n 1
；
[0713]
n为1至30的整数。
[0714]
在第一百零四实施方案中，本公开提供了一种第一百至第一百零三实施方案中所述的方法，其中rw选自由以下组成的组：c
12h25
、c
18h37
、c
20h41
、c
22h45
、c
24h49
、c
26h53
和c
28h57
。
[0715]
在第一百零五实施方案中，本公开提供了一种第一百至第一百零四实施方案中所述的方法，其中v为键、ch2、ch2ch2、c(＝o)-、***-c(＝o)-o-**、或
[0716]
在第一百零六实施方案中，本公开提供了一种第五十四至第一百实施方案中所述的方法，其中y选自由以下组成的组
[0717][0718]
其中
[0719]
r8为h或c
1-6
烷基；并且
[0720]
m为1至5的整数。
[0721]
在第一百零七实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第一百零六实施方案)中所述的方法，其中r1和r2独立地为h或ch3。在一个具体实施方案中，r1和r2均为h。在另一个具体实施方案中，r1和r2均为ch3。
[0722]
在第一百零八实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第一百零七实施方案)中所述的方法，其中e为0、1或2；并且f为0、1或2。
[0723]
在第一百零九实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第一百零八实施方案)中所述的方法，其中e为1；并且f为1。
[0724]
在第一百一十实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第一百零八实施方案)中所述的方法，其中e为0；并且f为1或者e为1；并且f为0。
[0725]
在第一百一十一实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第一百一十实施方案)中所述的方法，其中r8为h或c
1-4
烷基。
[0726]
在第一百一十二实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第一百一十一实施方案)中所述的方法，其中z由式ii
*
或iia
*
表示，
[0727][0728]
其中
[0729]
t为10至30的整数；
[0730]
选自由以下组成的组
[0731][0732]
其中r8为h或c
1-6
烷基。
[0733]
在第一百一十三实施方案中，本公开提供了一种第三或第四方面(例如，第五十四至第一百一十二实施方案)中所述的方法，其中z为：
[0734][0735]
在第一百一十四实施方案中，本公开一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十三实施方案)中所述的方法，其中z为
[0736][0737]
在第一百一十五实施方案中，本公开一种第三或第四方面(例如，第五十四至第九十三实施方案)中所述的方法，其中z为
[0738][0739]
在第一百一十六实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百一十五实施方案中所述的方法，其中所述核苷酸或寡核苷酸中的所有p＝x基团为p＝s。
[0740]
在第一百一十七实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百一十五实施方案中所述的方法，其中所述核苷酸或寡核苷酸中的所有p＝x基团为p＝o。
[0741]
在第一百一十八实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百一十五实施方案中所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的p＝x基团为p＝s。
[0742]
在第一百一十九实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百一十五实施方案中所述的方法，其中所述化合物或寡核苷酸中10-90％、20-80％、30-70％或40-60％的p＝x基团为p＝s。
[0743]
在第一百二十实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百一十六实施方案中所述的方法，其中所述核碱基选自由以下组成的组：胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，其中所述核碱基的nh2基团(如果存在)被phco-、ch3co-、iprco-、me2n-ch＝或me2n-cme＝保护。
[0744]
在第一百二十一实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百一十五实施方案中所述的方法，其中所述核碱基选自由以下组成的组：胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶，其中所述核碱基的nh2基团(如果存在)被phco-、ch3co-、iprco-、me2n-ch＝或me2n-cme＝保护。
[0745]
在第一百二十二实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中
所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百二十一实施方案中所述的方法，其中
[0746]
每个r
32
独立地选自由以下组成的组：h、f和任选地被c
1-4
烷氧基取代的c
1-4
烷氧基；
[0747]
每个r
34
独立地为h或与r2的所述烷氧基基团形成环，其中所述环为任选地被1至3个c
1-4
烷基基团取代的5或6元环；
[0748]
每个r
35
为4,4'-二甲氧基三苯甲基基团；
[0749]r36
为
–
ch2ch2cn；并且
[0750]r37a
和r
37b
独立地为c
1-4
烷基。
[0751]
在第一百二十三实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百二十一实施方案中所述的方法，其中
[0752]
每个r
32
独立地选自由以下组成的组：h、f、-och3、
–
och2ch2och3和-otbdms；并且
[0753]
每个r
34
独立地为h或与r
32
的所述烷氧基基团形成环，其中所述环为5元环。
[0754]
在第一百二十四实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百二十一实施方案中所述的方法，其中每个r
34
独立地为h或与r
32
的所述烷氧基基团一起形成
–
ch
2-o-。
[0755]
在第一百二十五实施方案中，本公开提供了一种第二十七至第五十三实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第五十四至第一百二十一实施方案中所述的方法，其中
[0756]
每个r
32
独立地选自h或
–
och2ch2ome；
[0757]
每个r
34
为h；
[0758]
每个r
35
为4,4'-二甲氧基三苯甲基基团；
[0759]r36
为
–
ch2ch2cn；并且
[0760]r37a
和r
37b
均为-ch(ch3)2。
[0761]
在第一百二十六实施方案中，本公开提供了一种第五十五、第六十四或第八十五实施方案所述的方法，其中式(vd')、(v-2')或(f2')的所述化合物的所述盐选自三甲基胺盐、三乙基胺盐和三异丙基胺盐。
[0762]
在第一百二十七实施方案中，本公开提供了一种第一百二十六实施方案中所述的方法，其中式(vd')、(v-2')或(f2')的所述化合物的所述盐为三乙基胺盐。
[0763]
在第一百二十八实施方案中，本公开提供了一种第二方面(例如，第二十八实施方案)中所述的核苷酸或寡核苷酸或第三或第四方面(例如，第五十八、第五十九、第六十九和第七十一至第九十二实施方案中的任一个)中所述的方法，其中所述为腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤。
[0764]
在第一百二十九实施方案中，本公开提供了一种第二方面(例如，第二十八实施方案)中所述的核苷酸或寡核苷酸或第三或第四方面(例如，第五十八、第五十九、第六十九和第七十一至第九十二实施方案中的任一个)中所述的方法，其中所述q为甲硅烷基保护基团。
[0765]
在第一百三十实施方案中，本公开提供了一种第二方面(例如，第二十八实施方案)中所述的核苷酸或寡核苷酸或第三或第四方面(例如，第五十八、第五十九、第六十九和第七十一至第九十二实施方案中的任一个)中所述的方法，其中所述q选自由以下组成的组：三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基
异丙基甲硅烷基、二甲基(叔丁基乙基)甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二叔丁基甲基甲硅烷基、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基和叔丁氧基二苯基甲硅烷基。
[0766]
在第一百三十一实施方案中，本公开提供了一种第二方面(例如，第二十八实施方案)中所述的核苷酸或寡核苷酸或第三或第四方面(例如，第五十八、第五十九、第六十九和第七十一至第九十二实施方案中的任一个)中所述的方法，其中q为叔丁基二苯基甲硅烷基。
[0767]
在某些实施方案中，对于第四方面或其中描述的任何实施方案(例如，第八十四至第一百一十五实施方案)中所述的方法，变量r
31
、r
32
、r
34
、r
35
、r
36
、q和/或z描述于第二方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第二十七至第五十三实施方案)中。
[0768]
在某些实施方案中，对于第四方面或其中描述的任何实施方案(例如，第八十四至第一百一十五实施方案)中所述的方法，所述5'-oh脱保护(或脱三苯甲基化)步骤、所述偶联步骤和所述氧化或硫化步骤在第三方面或其中描述的任一个实施方案(例如，第五十四至第八十三实施方案)中所述的条件下进行。
[0769]
在某些实施方案中，对于第二方面或其中描述的任何实施方案中所述的核苷酸或寡核苷酸或第三或第四方面或其中描述的任何实施方案中所述的方法，当x为s时，硫代磷酸基团可以具有s-构型、r-构型或它们的混合物(例如，外消旋混合物)。
[0770]
示例
[0771]
缩写
[0772]
acn＝乙腈
[0773]
calcd＝计算的
[0774]
dbu＝8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
[0775]
dca＝chcl2cooh或二氯乙酸
[0776]
dcm＝二氯甲烷
[0777]
ddtt＝3-(n,n-二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑
[0778]
dci＝4,5-二氰基咪唑
[0779]
diea＝n,n-二异丙基乙胺
[0780]
dmt或dmtr＝4,4'-二甲氧基三苯甲基或双(4-甲氧基苯基)苯基甲基
[0781]
dmso＝二甲基亚砜
[0782]
etoac或ea＝乙酸乙酯
[0783]
ett＝5-乙硫基-1h-四唑
[0784]
h或hr＝小时
[0785]
hbtu＝3-[双(二甲基氨基)甲基]-3h-苯并三唑-1-氧化物六氟磷酸盐
[0786]
hobt＝羟基苯并三唑
[0787]
imid＝咪唑
[0788]
ipac＝乙酸异丙酯
[0789]
iproh＝异丙醇
[0790]
moe＝甲氧基乙基
[0791]
ms＝分子筛
[0792]
mtbe或tbme＝甲基叔丁醚
[0793]
nmi＝n-甲基咪唑
[0794]
tbs＝叔丁基二甲基甲硅烷基
[0795]
py＝吡啶
[0796]
rbf＝圆底烧瓶
[0797]
rt＝保留时间
[0798]
tbaf＝四正丁基氟化铵
[0799]
tbuaa＝三丁基乙酸胺
[0800]
tbdpscl＝叔丁基(氯)二苯基硅烷
[0801]
tca＝三氯乙酸
[0802]
tea＝三乙胺
[0803]
teab＝四乙基溴化铵
[0804]
tfa＝三氟乙酸
[0805]
thf＝四氢呋喃
[0806]
tlc＝薄层色谱
[0807]
tol＝甲苯
[0808]
实施例1.化合物m19的合成
[0809]
a.化合物m19的合成方案
[0810]
[0811][0812]
b.化合物m19的合成程序
[0813]
用于制备化合物2的一般程序
[0814][0815]
在25℃下在n2下向化合物1(1.20kg，6.52mol，1.00eq)和k2co3(5.40kg，39.1mol，6.00eq)在dmf(12l)中的混合物中一次性添加1-溴十八烷(8.69kg，26.1mol，4.00eq)。将混合物在90℃下搅拌并搅拌16h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝5/1，起始材料rf＝0.52，产物rf＝0.88)表明未检测到起始材料。添加18l h2o，冷却至25℃，过滤并用7lh2o和10l丙酮洗涤。将固体用30l正庚烷在55℃下重结晶1h。冷却至25℃，过滤并用5l正庚烷洗涤固体。获得化合
物2(8.60kg，粗品)，为白色固体。
[0816]
用于制备化合物3的一般程序
[0817][0818]
在25℃下在n2下向化合物2(3.00kg，3.19mol，1.00eq)在etoh(15l)中的混合物中一次性添加koh(268g，4.78mol，1.50eq)在h2o(3l)中的溶液。将混合物在80℃下搅拌并搅拌16h。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝5/1，起始材料rf＝0.33，产物rf＝0.86)表明未检测到起始材料。用2n hcl(6l)将ph调节至2～3，冷却至25℃，倒入75l h2o中。过滤并用20l h2o和10l丙酮洗涤固体。在烘箱中在50℃下干燥24h。溶解在28l dcm中，在40℃下研磨1h。冷却至25℃。过滤并用40l meoh洗涤。在烘箱中在50℃下干燥48h。获得化合物3(4.20kg，4.53mol，71.1％收率)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl37.33(s,2h),4.06-4.01(m,6h),1.84-1.76(m,6h),1.50-1.26(m,6h),1.26(m,86h),0.90-0.87(t,j＝6.8hz,9h)。
[0819]
用于制备化合物4的一般程序
[0820][0821]
在25℃向化合物3(4.00kg，4.31mol，1.00eq)、edci(1.65kg，8.62mol，2.00eq)和dmap(105g，862mmol，0.200eq)在dcm(28l)中的混合物中添加哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.04kg，5.61mol，1.30eq)。在25℃下在n2下搅拌16h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20/1，起始材料rf＝0.32，产物rf＝0.53)表明未检测到起始材料。倒入50l meoh中，过滤并用30l meoh洗涤滤饼。获得化合物4(4.62kg，4.22mol，97.7％收率)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl
3 6.57(s,2h),3.97-3.94(m,6h),3.57-3.29(m,8h),1.82-1.71(m,6h),1.47(m,16h),1.25(m,16h),0.89-0.86(t,j＝6.8hz,9h)。
[0822]
用于制备化合物5的一般程序
[0823][0824]
在25℃下在n2下向化合物4(1.50kg，1.37mol，1.00eq)在dcm(10l)中的混合物中一次性添加4n hcl的etoh(4m，3.42l，10.0eq)溶液。将混合物在25℃下搅拌16h。tlc(dcm/meoh＝20/1，产物rf＝0.74，起始材料rf＝0.18)表明化合物4消失。过滤并用5letoh洗涤固体。获得化合物5(3.80kg，3.68mol，89.6％收率，hcl盐形式)，为白色固体。
[0825]
用于制备化合物7的一般程序
[0826][0827]
在25℃下在n2下向化合物6(500g，3.01mol，1.00eq)和ch2o(181g，6.02mol，2.00eq)的混合物中一次性添加发烟硫酸(825ml)。将混合物在140℃下搅拌15h。在废气吸收物中加入10％ naoh水溶液。hplc(起始材料：rt＝2.73min；产物：rt＝2.84min)显示化合物6消失。冷却至25℃，用3300ml h2o淬灭。过滤并用h2o洗涤，直到ph为3～4。在80℃下用3200ml dmf重结晶。过滤并用2letoh洗涤。真空干燥。获得化合物7(1.60kg，粗品)，为灰色固体。将化合物7(1.60kg，8.98mol，1.00eq)在dmf(3200ml)中的混合物在80℃下搅拌1h。在16h的时间内缓慢冷却至25℃。过滤并用500ml etoh洗涤。真空干燥。获得化合物7(620g，3.48mol，38.7％收率)，为浅橙色固体。
[0828]
另选地，化合物7通过以下程序制备：
[0829][0830]
在25℃下在n2下向50％ h2so4水溶液(15.0l)中一次性添加化合物6a(1.50kg，9.43mol，1.00eq)。将混合物在120℃下搅拌16hr。lcms(et49477-3-p1a2，产物：rt＝0.597min)显示起始材料被完全消耗。冷却至25℃。倒入h2o(冰，15.0l)中，过滤并用h2o(2.00lx 5)洗涤固体。在真空烘箱中干燥滤饼(55℃，48hr)。获得化合物7(2.50kg，14.0mol，74％收率，98.8％纯度)，为白色固体。esi

:ms：c9h6o4(m h)

计算值为178.0，实测值为178.1。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(s,1h),8.09-8.07(d,j＝8.0hz,1h),7.93-7.91(d,j＝8.0hz,1h),5.45(s,2h).
13
c{1h}nmr(100mhz,cdcl3)δ169.9,166.5,147.6,135.7,129.8,128.5,125.1,124.0,70.1。
[0831]
用于制备化合物m-17的一般程序
[0832][0833]
在25℃下在n2下向化合物5(3.60kg，3.49mol，1.00eq，hcl)和化合物7(683g，3.84mol，1.10eq)在dcm(24l)中的混合物中一次性添加dmap(852g，6.98mol，2.00eq)、edci(1.34kg，6.98mol，2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌2h。tlc(dcm/meoh＝20/1，起始材料rf＝0.62，rf＝0)表明起始材料被完全消耗。倒入etoh(50l)中，过滤并用etoh(20l)洗涤。获
得化合物m-17(3.80kg，3.29mol，94.3％收率)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl
3 7.99-7.97(d,j＝6.8hz,1h),7.56-7.53(m,2h),6.59(s,2h),5.36(s,2h),3.97-3.94(t,j＝6.4hz,6h),3.78-3.44(m,8h),1.82-1.71(m,7h),1.46-1.42(m,7h),1.30-1.26(m,93h),0.89-0.86(t,j＝6.8hz,9h)
[0834]
用于制备化合物m-18的一般程序
[0835][0836]
在25℃下在n2下向化合物m-17在thf(20l)中的混合物中一次性添加lioh.h2o(175g，4.16mol，1.30eq)在h2o(4000ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌并搅拌3h。tlc(dcm/meoh＝20/1，起始材料rf＝0.46，rf＝0.05)表明起始材料被完全消耗。浓缩并用40l h2o稀释，用1n hcl(10l)将ph调节至4～5。过滤并用45l h2o洗涤，直到ph为6～7。用4l acn洗涤。获得化合物m-18(3.90kg，粗品)，为白色固体。1h nmr:et29928-65-p1a1 400mhz cdcl38.05-8.00(m,1h),7.57-7.54(m,1h),7.38-7.36(m,1h),6.59(s,2h),6.6(s,2h),4.79(s,2h),3.97-3.94(m,8h),3.81-3.45(m,8h),1.82-1.77(m,4h),1.45(m,7h),1.29-1.25(m,90h),0.89-0.86(t,j＝7.2hz,9h)。
[0837]
用于制备化合物m-19-a的一般程序
[0838][0839]
在25℃下在n2下向化合物m-18(1.70kg，1.45mol，1.00eq)在dcm(20l)中的混合物中一次性添加咪唑(986g，14.5mol，10.0eq)和tbdpscl(3.98kg，14.5mol，3.72l，10.0eq)。将混合物在25℃下搅拌并搅拌2h。tlc(dcm/meoh＝10/1，起始材料rf＝0.18，rf＝0.92)表明起始材料被完全消耗。反应与et29928-70一起进行。用h2o(15l x 2)洗涤，分离有机层并经无水na2so4干燥并浓缩。获得化合物m-19-a(5.80kg，粗品)，为白色固体。
[0840]
用于制备化合物silhpg m19的一般程序
[0841][0842]
在25℃下在n2下向化合物m-19-a(2000g，485mmol，1.00eq)在thf(16l)中的混合物中一次性添加k2co3(87.1g，630mmol，1.30eq)在h2o(6000ml)和meoh(2000ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌16h。tlc(pe/ea＝2/1，起始材料rf＝0.43，rf＝0)表明起始材料被完全消耗。浓缩并用10l h2o稀释，用1m khso4将ph调节至5，用dcm(10l x 2)萃取，经无水na2so4干燥。浓缩至～5l，倒入10l meoh中，过滤并用meoh(5l x 4)洗涤以除去tbdps副产物。溶解在dcm(5l)中并滴入mecn(10l)中，过滤并用mecn(2l x 4)洗涤，溶解在dcm(12l)中，通过硅胶垫过滤，并用dcm/etoac＝1/1(10l)洗涤。获得化合物silhpg m19(835g，591mmol，48.8％收率)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl3δ8.10-8.08(d,j＝8.0hz,1h),7.99(s,1h),7.66-7.64(m,4h),7.43-7.32(m,7h),6.59(s,2h),5.21(s,2h),3.99-3.93(m,6h),3.78-3.44(m,8h),1.82-1.75(m,6h),1.47-1.42(m,7h),1.31-1.27(m,93h),1.12(s,10h),0.90-0.87(t,j＝6.8hz,9h)。
[0843]
用于制备化合物m-18a的一般程序：
[0844][0845]
在25℃下在n2下向化合物m-17(2.00kg，1.73mol，1.00eq)在thf(20.0l)中的混合物中一次性添加lioh.h2o(94.4g，2.25mol，1.30eq)在h2o(4000ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌并搅拌3hr。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20/1，起始材料rf＝0.5，rf＝0.1)表明起始材料被完全消耗。倒入acn(20.0l)中并过滤。收集合并的固体，然后在真空烘箱中干燥(50℃，10天)。反应分五个批次平行进行。获得化合物m-18a(10.8kg，9.15mol，106％收率，87.4％纯度)，为白色固体。hrms：c
74h129
n2o8(m-li 2h)

计算值为1173.9671，实测值为1173.9755。1h nmr:(li盐被中和为游离酸用于h-nmr).400mhz,cdcl3δ8.05-8.00(m,1h),7.57-7.54(m,1h),7.38-7.36(m,1h),6.59(s,2h),6.6(s,2h),4.79(s,2h),3.97-3.94(m,8h),3.81-3.45(m,8h),1.82-1.77(m,4h),1.45(m,7h),1.29-1.25(m,90h),0.89-0.86(t,j＝7.2hz,9h)。
[0846]
另选地，化合物m19通过以下程序制备：
[0847][0848]
在25℃下在n2下向化合物m-18a(3.00kg，2.54mol，1.00eq)在thf(24.0l)中的混合物中分5次添加咪唑(1.21kg，17.80mol，7.0eq)和tbdpscl(4.19kg，15.3mol，3.92l，6.0eq)。将混合物在25℃下搅拌并搅拌16hr。hplc(起始材料tr＝5.92min，产物tr＝9.32min)指示起始材料剩余～5％。将反应用dcm(20.0l)稀释并用h2o(20.0l x 2)洗涤。然后将有机层经无水na2so4干燥，过滤并浓缩至～7l，倒入15l meoh中，过滤并用meoh(5l x 4)洗涤以除去tbdps副产物。溶解在dcm(7l)中并滴入mecn(15l)中，过滤并用mecn(5l x 4)洗涤，合并滤饼并在烘箱中干燥(50℃，72hr)。获得化合物silhpg m19(13.6kg，粗品，89％纯度，5％ m-17，3％ m-18)，为白色固体。将残余物通过柱色谱法(sio2，石油醚/乙酸乙酯＝1/10至4/1)(将10％ dcm添加到pe洗脱剂中)纯化。反应以三个批次平行进行。浓缩并获得化合物silhpg m19(7.20kg，5.09mol，66.5％收率，95.08％纯度)，为白色固体。hrms：c
90h147
n2o8si(m h)

计算值为1412.0848，实测值为1412.0908。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.10-8.08(d,j＝8.0hz,1h),7.99(s,1h),7.66-7.64(m,4h),7.43-7.32(m,7h),6.59(s,2h),5.21(s,2h),3.99-3.93(m,6h),3.78-3.44(m,8h),1.82-1.75(m,6h),1.47-1.42(m,7h),1.31-1.27(m,90h),1.12(s,10h),0.90-0.87(t,j＝6.8hz,9h).
13
c{1h}nmr(100mhz,cdcl3)δ170.8,169.9,153.3,144.7,139.8,139.4,135.4,134.8,133.1,132.1,129.9,129.6,127.9,127.7,125.6,125.1,105.7,73.6,69.3,64.0,60.4,47.5,42.3,31.9,30.3,29.4-29.7,26.9,26.1,22.7,14.1。
[0849]
实施例2.化合物m22的合成
[0850]
a.化合物m22的合成方案
[0851][0852]
b.化合物m22的合成程序
[0853]
用于制备化合物3的一般程序
[0854][0855]
将化合物1(24.00g，113mmol)、化合物2(44.2g，451mmol，62.4ml)、cui(6.45g，33.8mmol)、pd(pph3)4(6.51g，5.64mmol)和tea(5.70g，56.3mmol，7.83ml)在dmf(144ml)中的混合物脱气并用n2吹扫3次，然后将混合物在n2气氛下在65℃下搅拌24h。在tlc(石油醚/
乙酸乙酯＝10/1，产物：rt＝0.43)中检测到所需产物。将滤液用etoac(600ml)稀释并用盐水(450ml x 3)洗涤。将有机层经无水na2so4(45.0g)干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(sio2，石油醚/乙酸乙酯＝100/1至5/1)纯化。获得化合物3(15.0g，57.8％收率)，为棕色固体。
[0856]
用于制备化合物4的一般程序
[0857][0858]
向化合物3(15.0g，65.1mmol)在thf(90.0ml)中的溶液中添加tbaf(1.00m，65.1mmol，65.1ml)。将混合物在0℃下搅拌20min。在lcms(et25847-215-p1b，rt＝1.446)和tlc(石油醚/乙酸乙酯＝5/1，产物：rf＝0.43)中检测到所需产物。将反应混合物用dcm(300ml)稀释并用盐水(300ml x 3)洗涤。将合并的有机层经无水na2so4(30.0g)干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(sio2，石油醚/乙酸乙酯＝30/1至5/1)纯化。获得化合物4(3.20g，31.1％收率)，为黄色固体。1h nmr:400mhz cdcl37.84-7.86(d,j＝8.0hz,1h),7.53-7.63(m,2h),5.29(s,2h),0.28(s,9h)。
[0859]
用于制备化合物6的一般程序
[0860][0861]
在0℃下向化合物5(48.0g，51.0mmol)在thf(288ml)中的溶液中添加lialh4(3.18g，83.6mmol)。将混合物在25℃下搅拌16h。tlc(dcm/meoh＝5/1，产物：rf＝0.80)指示化合物5被完全消耗并且形成一个新的斑点。通过添加na2so4.10h2o(90.0g)淬灭反应混合物，然后过滤。浓缩滤液。将残余物用dcm(900ml)稀释并用水(450ml x 2)、盐水(600ml)洗涤，并经无水na2so4(90.0g)干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。获得化合物6(40.0g，粗品)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl36.57(s,2h),4.60-4.61(d,j＝4.0hz,2h),3.93-4.00(m,6h),1.71-1.84(m,6h),1.27-1.31(m,90h),0.87-0.91(t,j＝6.4hz,9h)。
[0862]
用于制备化合物7的一般程序
[0863][0864]
在0℃下向化合物6(40.0g，43.8mmol)在dcm(240ml)中的溶液中添加tmsbr(8.04g，52.5mmol，6.82ml)并搅拌1h。然后将混合物在25℃下搅拌3h。tlc(dcm/meoh＝20/
1，产物：rf＝0.95)指示化合物6被完全消耗并且形成一个新的斑点。合并反应混合物并减压浓缩以除去溶剂。将残余物溶解在dcm(200ml)中并与acn(1.00l)研磨。将固体用acn(200ml x 3)洗涤并过滤。然后将其浓缩。获得化合物7(42.0g，98.2％％收率)，为浅黄色固体。1h nmr:400mhz cdcl36.58(s,2h),4.44(s,2h),3.93-3.99(m,6h),1.72-1.84(m,6h),1.27-1.47(m,90h),0.87-0.91(t,j＝6.4hz,9h)。
[0865]
用于制备化合物8的一般程序
[0866][0867]
向化合物7(42.0g，43.0mmol)在dmf(252ml)和thf(200ml)中的溶液中添加nan3(4.20g，64.5mmol)的h2o(36.0ml)溶液。将混合物在40℃下搅拌12h。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝10/1，产物：rt＝0.66)指示化合物7被完全消耗并且形成一个新的斑点。将反应混合物用dcm(300ml)稀释并用盐水(450ml x 3)洗涤。将合并的有机层经无水na2so4(30.0g)干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。获得化合物8(40.0g，粗品)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl36.49(s,2h),4.25(s,2h),3.94-4.00(m,6h),1.75-1.84(m,6h),1.27-1.49(m,90h),0.87-0.91(t,j＝6.4hz,9h)。
[0868]
用于制备化合物9的一般程序
[0869][0870]
将化合物9(2.70g，2.88mmol)、化合物4(682mg，4.32mmol)、抗坏血酸钠(570mg，2.88mmol)、cuso4.5h2o(360mg，1.44mmol)在thf(16.2ml)和h2o(5.40ml)中的混合物脱气并用n2吹扫3次，然后将混合物在n2气氛下在70℃下搅拌12h。在tlc(石油醚/乙酸乙酯＝3/1，rf＝0.22)中检测到所需产物。然后将其过滤并减压浓缩以除去溶剂。将残余物溶解在dcm(60.0ml)中并与meoh(600ml)研磨。获得化合物9(3.00g，粗品)，为黄色固体。
[0871]
用于制备化合物10的一般程序
[0872][0873]
向化合物9(3.00g，2.74mmol)在thf(18.0ml)中的溶液中添加naoh(438mg，11.0mmol)的h2o(3.60ml)溶液。将混合物在60℃下搅拌3h。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝2/1，产物：rf＝0.04)指示化合物9被完全消耗并且形成一个新的斑点。将该反应与反应(et258474-259)合并。将反应混合物减压浓缩以除去thf。将残余物用h2o(300ml)稀释。用
hcl(1.00m)将溶液调节至ph～2，并用h2o过滤至ph～7，并减压浓缩，得到残余物。然后将其用acn(100ml)洗涤。获得化合物10(4.80g，粗品)，为浅黄色固体。
[0874]
用于制备化合物11的一般程序
[0875][0876]
向化合物10(4.80g，4.32mmol)在dcm(28.8ml)中的溶液中添加tbdpscl(2.96g，10.8mmol，2.77ml)和im(880mg，12.9mmol)。将混合物在40℃下搅拌3h。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝2/1，产物：rf＝0.94)指示化合物10被完全消耗并且形成一个新的斑点。通过添加nahco3(150ml)淬灭反应混合物，并用dcm(300ml)萃取。将合并的有机层用盐水(300ml x 2)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物重新溶解在dcm(90.0ml)中并在剧烈搅拌下滴入meoh(600ml)中。沉淀出所需产物，过滤并减压浓缩，得到残余物。然后将其用meoh(300ml x 3)洗涤。获得化合物11(6.05g，粗品)，为白色固体。
[0877]
用于制备化合物m22的一般程序
[0878][0879]
向化合物11(6.00g，3.76mmol)在thf(36.0ml)和meoh(6.00ml)中的溶液中添加k2co3(1.30g，9.42mmol)的h2o(12ml)溶液。将混合物在25℃下搅拌12h。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝2/1，产物：rf＝0.43)指示化合物11被完全消耗并且形成一个新的斑点。合并反应并减压浓缩。通过添加盐水(200ml)淬灭反应混合物，并用khso4水溶液(200ml，1.00m)调节至ph～2。然后将其用dcm(300ml)萃取并用盐水(100ml x 2)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物重新溶解在dcm(50.0ml)中并在剧烈搅拌下滴入meoh(300ml)中。沉淀出所需产物并过滤。获得化合物silhpg m22(4.5g，88.2％收率)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl
3 8.17(s,1h),8.12-8.10(d,j＝8.0hz,1h),7.94-7.92(d,j＝8.0hz,1h),7.72-7.64(m,5h),7.39-7.30(m,6h),6.52(s,2h),5.47(s,2h),5.18(s,2h),3.97-3.92(m,6h),1.82-1.74(m,6h),1.47-1.42(m,6h),1.31-1.26(m,84h),1.11(s,9h),0.90-0.87(t,j＝6.8hz,9h)。
[0880]
实施例3.化合物m36的合成
[0881]
a.化合物m36的合成方案
[0882][0883]
b.化合物m36的合成程序
[0884]
用于制备化合物m20的一般程序
[0885][0886]
向装有n2的三颈圆底烧瓶中添加化合物1(70g，328mmol，1.00eq)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(61.2g，328.mmol，1eq)、k3po4(139g，657.19mmol，2eq)和tol.(700ml)。将混合物用n2吹扫并脱气3次。然后向溶液中添加ruphos(15.3g，32.8mmol，0.1eq)和pd2(dba)3(10.71g，16.43mmol，0.05eq)。将反应溶液用n2吹扫并脱气3次并升温至100℃。将其在100℃下搅拌16h。反应溶液变为黑色。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝2/1，起始材料rf＝0.70，产物rf＝0.30)指示起始材料被消耗并且形成新的点。将反应冷却至20℃。然后将其过滤以除去固体并用乙酸乙酯洗涤两次(1000ml和500ml)。将有机层合并并浓缩，得到粗固体。将固体与mtbe:
dcm(800ml，v/v＝10/1)的溶液一起搅拌16hr。然后将其过滤，得到固体，将其在油泵下干燥。获得m20(64g，201.03mmol，61.18％收率)，为灰白色固体。1h nmr:400mhz cdcl37.76(d,j＝8.8hz 1h),7.01(dd,j＝2.0hz,j＝8.8hz,1h),6.80(s,1h),5.21(s,2h),3.59-3.62(m,4h),3.35-3.38(m,4h),1.49(s,9h)。
[0887]
用于制备化合物m25的一般程序
[0888][0889]
向m-20(30.0g，1.0eq)在dcm(60ml)中的溶液中添加hcl/meoh(150ml，6.37eq，4m)。将混合物在25℃下搅拌16hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，rf＝0.0)指示反应物m20被完全消耗。将反应混合物减压浓缩以除去meoh和dcm。用dcm(200ml)洗涤粗产物。然后将其过滤并减压浓缩，得到化合物m-35(27g，粗品)，为白色固体。1h nmr:400mhz dmso-d69.43(s,1h),7.66(d,j＝8.4hz1h),7.13-7.18(m,2h),5.28(s,2h),3.60-3.63(m,4h),3.16-3.19(m,4h)。
[0890]
用于制备化合物m31的一般程序
[0891]
基于与实施例1中制备化合物2相同的程序制备化合物m31。
[0892]
用于制备化合物m32的一般程序
[0893]
基于与实施例1中制备化合物3相同的程序制备化合物m32。
[0894]
用于制备化合物m33的一般程序
[0895][0896]
向化合物m-32(80.0g，1.0eq)在dcm(50ml)中的溶液中添加dmap(21.1g，2.0eq)、m-25(28.4g，1.3eq)和edci(33.1g，2.0eq)。将混合物在25℃下搅拌16hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，rf＝0.60)指示反应物m-32被完全消耗。通过添加nahco3(800ml)淬灭反应混合物，并用dcm(800ml x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(800ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物，将其重新溶解在dcm(160ml)中并在剧烈搅拌下滴入acn(4800ml)中。通过过滤收集固体并减压干燥，得到化合物m-33(96.0g，85.1mmol，98.69％收率)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl37.78(d,j＝8.4hz1h),7.78(d,j＝8.4hz 1h),6.82(s,1h),6.63(s,2h),5.22(s,2h),3.97(t,j＝6.4hz 1h),3.41-3.98(m,8h),1.75-1.84(m,6h),1.26-1.48(m,96h),0.88(t,j＝6.4hz 9h)。
[0897]
用于制备化合物m34的一般程序
[0898][0899]
向m-33(116g，1.0eq)在thf(1160ml)中的溶液中添加naoh(20.56g，5.0eq)。将混合物在60℃下搅拌12hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，rf＝0.50)指示反应物1被完全消耗。将反应混合物减压浓缩以除去thf。将残余物用h2o 1.5l稀释。用hcl(1m)将溶液调节至ph＝5～6，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物与dcm、thf和acn共蒸发六次。获得化合物m-34(87g，75.93mmol，73.82％收率)，为浅黄色固体。1h nmr:400mhz cdcl38.01(d,j＝8.4hz 1h),7.22(s,1h),6.85(s,1h),6.75(d,j＝8.8hz,1h),6.68(s,2h),4.74(s,2h),3.97,\(t,j＝6.4hz,6h),3.41-3.98(m,8h),1.70-1.81(m,6h),1.26-1.48(m,96h),0.83(t,j＝6.4hz,9h)。
[0900]
用于制备化合物m35的一般程序
[0901][0902]
向化合物m-34(87g，1.0eq)在dcm(870ml)中的溶液中添加咪唑(14.96g，3.0eq)和tbdpscl(41.5ml，2.2eq)。将混合物在25℃下搅拌16hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，rf＝0.90)指示反应物m-34被完全消耗。通过添加nahco
3 600ml淬灭反应混合物，并用dcm(700ml x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(500ml x 2)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物，将其重新溶解在dcm(800ml)中并在剧烈搅拌下滴入acn(2.5l)中。将固体过滤并减压浓缩，得到化合物m-35(118g，粗品)，为黄色固体。hplc显示起始材料被完全消耗。
[0903]
用于制备化合物m36的一般程序
[0904]
[0905]
向化合物m-35(115g，1.0eq)在thf(345ml)和meoh(920ml)中的溶液中添加k2co3(24.72g，2.5eq)在h2o(345ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌16hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，rf＝0.43)指示化合物m-35被完全消耗。将反应混合物减压浓缩以除去四分之一溶剂。将残余物用盐水450ml稀释并用dcm(500ml x 4)萃取。将合并的有机层用盐水(500ml x 3)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(sio2，二氯甲烷/乙酸乙酯＝1/0至10/1)纯化。获得化合物m-36(25g，93％纯度)，为白色固体。1h nmr:400mhz cdcl37.99(d,j＝8.4hz,1h),7.67-7.69(m,4h),7.33-7.40(m,7h),6.75(dd,j＝2.0hz,j＝8.8hz,1h),6.63(s,2h),5.18(s,2h),3.97-4.00,(m,6h),3.38-3.98(m,8h),1.70-1.81(m,6h),1.26-1.48(m,90h),0.90(s,9h),0.83(t,j＝6.4hz,9h)。
[0906]
实施例4.化合物m40的合成
[0907]
a.m40合成方案
[0908][0909]
b.化合物m40的合成程序
[0910]
用于制备化合物m37的一般程序
[0911][0912]
在25℃下在n2下向化合物2-甲基-1,4-苯二甲酸(1.1eq)和化合物5(1.10eq)在
dcm(7v)中的混合物中一次性添加dmap(2.00eq)、edci(2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌2h。tlc显示起始材料被完全消耗。将反应混合物倒入etoh(50v)中，过滤并用etoh(10v)洗涤。获得化合物m37，为白色固体。
[0913]
用于制备化合物m38的一般程序
[0914][0915]
在25℃下在n2下向化合物m37(1.0eq)和aibn(4.0eq)在dcm(10v)中的混合物中添加nbs(2.0eq)。将混合物回流4h。tlc显示起始材料被完全消耗。冷却后，用饱和nahco3水溶液洗涤混合物。用mgso4干燥混合物，并将滤液浓缩为残余物，使其在acn中沉淀，得到白色固体m38。参见joc,2008,73,9125-9128。
[0916]
用于制备化合物m39的一般程序
[0917][0918]
在25℃下在n2下向化合物m38(1.0eq)在dcm(10v)中的溶液中添加agno2(3.0eq)。将混合物搅拌2h。tlc显示起始材料被完全消耗。用饱和nahco3水溶液洗涤混合物。用mgso4干燥混合物，并将滤液浓缩为残余物，使其在acn中沉淀，得到白色固体m39。参见synthesis1980,814-815。
[0919]
用于制备化合物m40的一般程序
[0920][0921]
在25℃下在n2下向化合物m39(1.0eq)在thf(10v)中的溶液中一次性缓慢添加1.0m naoh(5.0eq)的溶液。将混合物在25℃下搅拌并搅拌3h。tlc显示起始材料被完全消耗。浓缩并用h2o(50v)稀释，用1n hcl将ph调节至4～5。过滤并用h2o洗涤，直到ph为6～7。用acn洗涤。以72％收率和90％纯度获得化合物m40，为白色固体。
[0922]
实施例5.化合物m50的合成
[0923]
a.化合物m50的合成方案
[0924][0925]
b.化合物m50的合成程序
[0926]
用于制备化合物m-50-a的一般程序
[0927][0928]
向化合物m-18(2.0g，1.70mmol，1.00eq)在thf(16.0ml)中的溶液中添加咪唑(579.99mg，8.52mmol，5.00eq)和tbscl(1.28g，8.52mmol，1.04ml，5.00eq)。将混合物在25℃下搅拌2hr。hplc显示起始材料被完全消耗。将残余物用h2o(50ml)稀释并用dcm(2x30ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。获得化合物m-50-a(2.39g，粗品)，为白色固体。
[0929]
用于制备化合物m-50的一般程序
[0930][0931]
向化合物m-50-a(2.39g，1.70mmol，1.00eq)在thf(19.0ml)和meoh(2.30ml)中的溶液中添加k2co3(305.44mg，2.21mmol，1.30eq)在h2o(7.0ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌3hr。tlc(dcm/meoh＝20/1，起始材料rf＝0.50，rf＝0.30)表明起始材料被完全消耗。用1m khso4(5ml)将ph调节至5。将残余物用h2o(50ml)稀释并用dcm(2x30ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物与acn(30v，70.0ml)在25℃下研磨30min。过滤并浓缩。获得化合物m-50(1.00g，93.8％纯度，45.67％收率)，为白色固体。
[0932]
实施例6.化合物m60的合成
[0933]
a.化合物m60的合成方案
[0934][0935]
b.化合物m60的合成程序
[0936]
用于制备化合物m-60-a的一般程序
[0937][0938]
向化合物m-18(1.0g，0.85mmol，1.00eq)在dcm(8.0ml)中的溶液中添加咪唑(579.99mg，8.52mmol，10.0eq)和tipscl(1.64g，8.52mmol，10.00eq)。将混合物在25℃下搅拌8hr。hplc显示起始材料被完全消耗。将残余物用h2o(50ml)稀释并用dcm(2x30ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。获得化合物m-60-a(1.27g，粗品)，为白色固体。
[0939]
用于制备化合物m-60的一般程序
[0940][0941]
向化合物m-60-a(1.27g，0.85mmol，1.00eq)在thf(10.4ml)和meoh(1.30ml)中的溶液中添加k2co3(153.5mg，1.11mmol，1.30eq)在h2o(4.0ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌3hr。用1m khso4(3ml)将ph调节至5。将残余物用h2o(50ml)稀释并用dcm(2x30ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物与acn(30v，70.0ml)在25℃下研磨30min。过滤并浓缩，得到化合物m-60(0.90g，92％纯度，72.7％收率)，为白色固体。c
83h149
n2o8si

[m h

]的质量计算值为1330.1，实测值为1330.4。
[0942]
实施例7.由试剂m19合成寡核苷酸片段a
[0943]
a.寡核苷酸片段a的合成方案
[0944]
根据图2中描绘的合成方案合成片段a。
[0945]
b.由m19合成寡核苷酸片段a的程序
[0946]
用于制备化合物m19-片段i-u-dmtr的一般程序
[0947]
[0948]
向m19(20.00g，14.16mmol，1.00eq)和du(13.14g，21.24mmol，1.50eq)在dcm(200ml)中的溶液中添加dmap(3.46g，28.32mmol，2.00eq)和edci(5.43g，28.32mmol，2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌16hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝15:1，产物：rf＝0.70)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。将反应混合物用nahco3(5％水溶液，100ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，为3v。将粗品在剧烈搅拌下滴入meoh(600ml，30v)中。沉淀出所需产物。获得化合物m19-片段i-u-dmtr(27.00g，13.31mmol，94.54％收率)，为白色固体。
[0949]
用于制备化合物m19-片段i-u的一般程序
[0950][0951]
在0℃下向m19-片段i-u-dmtr(27.0g，13.31mmol，1.00eq)在dcm(170ml)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(8.15g，39.93mmol，9.64ml，3.00eq)和tfa(7.59g，66.55mmol，4.92ml，5.00eq)。将混合物在0℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝15:1，产物rf＝0.54)指示反应物被完全消耗并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。通过添加nahco3(5％水溶液，100ml)淬灭反应混合物，然后用dcm(100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml x 2)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗品重新溶解在dcm(30ml)中并在剧烈搅拌下滴入meoh/acn(3:1，450ml)中。沉淀出所需产物。获得化合物m19-片段i-u(15.00g，8.77mmol，65.51％收率和98.5％纯度)，为白色固体。
[0952]
用于制备化合物m19-片段i-uc的一般程序
[0953][0954]
向m19-片段i-u(15.00g，8.76mmol，1.00eq)和dc(12.12g，13.14mmol，1.50eq)在tol./ipac＝3:1(120ml)中的溶液中添加3ams(7.50g)并搅拌1hr。然后向混合物中添加dci(2.07g，17.55mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，产
物：rf＝0.53)指示反应物m19-片段i-u被完全消耗并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。向粗品中添加hx(2.64g，17.55mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌0.5hr，然后在0℃下向混合物中添加十二烷-1-硫醇(5.31g，26.31mmol，6.30ml，3.00eq)和tfa(15.00g，134.49mmol，9.75ml，15.00eq)。将混合物在0℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，产物：rf＝0.43)指示反应物被完全消耗并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。将反应混合物用nmi(175.2mmol，14ml，20.00eq)稀释至ph 7，过滤并减压浓缩，得到残余物。将滤液滴入acn(800ml)中，沉淀0.5h，用9cm布氏漏斗过滤3.5h，得到14.3g(98％收率，97.7％纯度)，为白色固体。
[0955]
用于制备化合物m19-片段i-ucc的一般程序
[0956][0957]
向m19-片段i-uc(19.00g，8.40mmol，1.00eq)和dc(11.55g，12.60mmol，1.50eq)在tol./ipac＝3:1(150ml)中的溶液中添加3a分子筛(7.5g)。将混合物搅拌1hr，然后添加dci(1.97g，16.80mmol，2.00eq)。然后将其在30℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，产物：rf＝0.53)指示化合物m19-片段i-uc被完全消耗并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。向混合物中添加hx(2.51g，16.80mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌0.5hr，然后在0℃下添加十二烷-1-硫醇(5.04g，25.20mmol，5.94ml，3.00eq)和tfa(14.16g，126mmol，9.21ml，15.00eq)。将混合物在0℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝15:1，产物：rf＝0.43)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。向反应混合物中添加nmi(168mmol，14.5ml，20.00eq)。将混合物滴入acn(800ml)中。使固体沉淀0.5h并用15cm布氏漏斗过滤2.0h，得到15.4g(94％收率，95.0％纯度)，为白色固体。
[0958]
用于制备化合物m19-片段i-uccc的一般程序
[0959][0960]
向m19-片段i-ucc(5.00g，1.78mmol，1.00eq)和dc(2.46g，2.67mmol，1.50eq)在tol./acn＝3:1(40ml)中的溶液中添加3ams(2.0g)。将混合物在30℃下搅拌1hr，然后添加dci(420.05mg，3.56mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝15:1，产物：rf＝0.53)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。向混合物中添加叔丁基过氧化氢(320.5mg，3.56mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌0.5hr，然后在0℃下添加十二烷-1-硫醇(1.08g，5.34mmol，1.28ml，3.00eq)和tfa(3.04g，26.68mmol，1.98ml，15.00eq)。将混合物在0℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，产物：rf＝0.43)指示反应完成并且形成一个新的斑点。通过在0℃下添加nahco3(2％)100ml和na2so3(2eq)淬灭反应混合物，过滤并用dcm(80ml x3)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml x2)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，将其在剧烈搅拌下滴入acn(200ml)中。沉淀出所需产物。将滤饼用acn(30ml*2)洗涤，用7cm布氏漏斗过滤1.5h，得到5.00g(84％收率，90.9％纯度)，为白色固体。
[0961]
用于制备寡核苷酸片段a的一般程序
[0962][0963]
向m19-片段i-uccc(4.00g，1.20mmol，1.00eq)和da(1.67g，1.79mmol，1.50eq)在tol./acn＝3:1(40ml)中的溶液中添加3ams(2.0g)。将混合物在30℃下搅拌1hr，然后添加dci(282.36mg，2.39mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，产物：rf＝0.53)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的，然后添加葡萄糖(0.5eq)。向混合物中添加hx(358.99mg，2.39mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌0.5hr，然后在0℃下添加十二烷-1-硫醇(725.66mg，3.59mmol，0.86ml，3.00eq)和tfa(2.04g，17.93mmol，1.33ml，15.00eq)。将混合物在0℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝15:1，产物：rf＝0.43)指示反应完成并且形成一个新的斑点。通过在0℃下添加nahco3(2％)80ml淬灭反应混合物，过滤并用dcm(50ml x3)萃取。将合并的有机层用盐水(80ml x2)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，将其在剧烈搅拌下滴入acn(200ml)中。沉淀出所需产物。将滤饼用acn(30ml*2)洗涤，用7cm布氏漏斗过滤1.5h，得到4.20g(85％收率，86.4％纯度)的片段a，为白色固体。
[0964]
实施例8.由试剂m19合成寡核苷酸片段b
[0965]
a.寡核苷酸片段b的合成方案
[0966]
根据图3中描绘的合成方案合成片段b。
[0967]
b.由m19合成寡核苷酸片段b的程序
[0968]
用于制备化合物m19-片段iii-c-dmtr的一般程序
[0969][0970]
向m19(20.00g，14.16mmol，1.00eq)和dc(13.76g，21.24mmol，1.50eq)在dcm(200ml)中的溶液中添加dmap(1.73g，14.16mmol，1.00eq)和edci(4.08g，21.24mmol，1.50eq)。将混合物在30℃下搅拌12hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：rf＝0.70)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。将反应混合物用nahco3(300ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，为5v，将其在剧烈搅拌下滴入acn/meoh(3:1，1000ml，50v)中。沉淀出所需产物。获得化合物m19-片段iii-c-dmtr(28.90g，14.15mmol，99.94％收率)，为白色固体。
[0971]
用于制备化合物m19-片段iii-c的一般程序
[0972][0973]
向m19-片段iii-c-dmtr(28.0g，13.72mmol，1.00eq)在dcm(250ml)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(8.32g，41.12mmol，9.84ml，3.00eq)和tfa(7.80g，68.56mmol，5.08ml，5.00eq)。将混合物在0℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：rf＝0.54)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。将反应混合物用nmi(9.00g，109.72mmol，8.76ml，8.00eq)稀释。将粗品在剧烈搅拌下滴入acn(900ml，30v)中。沉淀出所需产物。获得化合物m19-片段iii-c(23.00g，13.22mmol，96.42％收率)，为白色固体。
[0974]
用于制备化合物m19-片段iii-ct的一般程序
[0975][0976]
向m19-片段iii-c(16.00g，9.20mmol，1.00eq)和dt(10.28g，13.80mmol，1.50eq)在tol./acn＝3:1(140ml)中的溶液中添加3ams(7.00g)并搅拌1hr。向混合物中添加dci(2.17g，18.40mmol，2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，产物：rf＝0.53)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。向反应混合物中添加hx(2.77g，18.42mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌0.5hr，然后在0℃下添加十二烷-1-硫醇(5.61g，27.70mmol，6.63ml，3.00eq)和tfa(10.53g，92.33mmol，6.84ml，10.00eq)。将混合物在0℃下搅拌0.5hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，产物：rf＝0.45)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。将反应混合物用nmi(11.37g，138.50mmol，11.04ml，15.00eq)稀释。将粗品滴入acn(500ml，30v)中，沉淀0.5h，用15cm布氏漏斗过滤1.5h，得到14.0g(93.30％收率，97.28％纯度)m19-片段iii-ct，为白色固体。
[0977]
用于制备化合物m19-片段iii-ctt的一般程序
[0978][0979]
向m19-片段iii-ct(15.00g，7.10mmol，1.00eq)和dt(7.93g，10.65mmol，1.50eq)在tol./acn＝3:1(120ml)中的溶液中添加3a分子筛(2.00g)。将混合物搅拌1hr，然后添加dci(1.68g，14.20mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝20:1，
产物：rf＝0.42)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。向粗品中添加hx(2.16g，14.37mmol，2.00eq)。将混合物在30℃下搅拌0.5hr，然后在0℃下添加十二烷-1-硫醇(4.37g，21.57mmol，5.17ml，3.00eq)和tfa(8.20g，71.90mmol，5.32ml，10.00eq)。将混合物在0℃下搅拌0.5hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：rf＝0.54)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。向反应混合物中添加nmi(8.86g，107.85mmol，8.60ml，15.00eq)稀释。将混合物滴入acn(200ml，30v)中，沉淀0.5h，用7cm布氏漏斗过滤1.0h，得到5.76g(96.60％收率，93.99％纯度)的m19-片段iii-ctt，为白色固体。
[0980]
用于制备化合物m19-片段iii-cttu-dmtr的一般程序
[0981][0982]
向m19-片段iii-ctt(10.5g，4.22mmol，1.00eq)和du(5.19g，6.34mmol，1.50eq)在tol./acn＝3:1(80ml)中的溶液中添加3a ms(0.5g)。将混合物在25℃下搅拌1hr，然后添加dci(997.52mg，8.45mmol，2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌1hr。tlc(二氯甲烷:甲醇＝10:1，产物：rf＝0.50)指示反应完成并且形成一个新的斑点。根据tlc，反应是彻底的。向粗品中添加hx(1.74g，8.46mmol，2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌0.5hr。将反应混合物过滤并减压浓缩，得到残余物，为5v，将其滴入acn(150ml，30v)中，沉淀0.5h，用7cm布氏漏斗过滤1.0h，得到4.22g的m19-片段iii-cttu-dmtr(92.5收率，91.7％纯度)，为白色固体。
[0983]
用于制备寡核苷酸片段b的一般程序
3)洗涤。将合并的有机层用盐水(100ml x 3)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物重新溶解在dcm(60.0ml)中并在剧烈搅拌下滴入meoh/acn(3/1，300ml)中。沉淀出所需产物，过滤并减压浓缩，得到残余物。获得m22-片段i-u-dmtr(5.20g，粗品)，为白色固体。
[0993]
用于制备化合物m22-片段i-u的一般程序
[0994][0995]
向m22-片段i-u-dmtr(5.10g，2.61mmol)在dcm(30.0ml)中的溶液中添加十二烷-1-硫醇(1.58g，7.83mmol，1.88ml)和tfa(2.38g，20.9mmol，1.55ml)。将混合物在0℃搅拌1h。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，产物：rf＝0.28)指示m22-片段i-u-dmtr被完全消耗并且形成两个新的斑点。通过在0℃下添加py(26.0eq)淬灭反应混合物，然后用dcm(150ml)稀释并用饱和nahco3水溶液(150ml x 4)洗涤。将合并的有机层用盐水(150ml x 3)洗涤，经无水na2so
4 na2so4(15.0g)干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将残余物通过柱色谱法(sio2，dcm/meoh＝150/1至100/1)纯化。获得m22-片段i-u(2.90g，64.6％收率，96.0％纯度)，为白色固体。
[0996]
用于制备化合物m22-片段i-uc的一般程序
[0997][0998]
向m22-片段i-u(2.00g，1.21mmol)和c-dmtr(1.67g，1.82mmol)在tol.(9.60ml)和ipac(2.40ml)中的溶液中添加dci(286mg，2.42mmol)和分子筛3a(2.00g)。将混合物在30℃下搅拌1h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20/1，产物：rf＝0.43)指示m22-片段i-u被完全消耗并且形成许多新的斑点。然后将氢化黄原素(365mg，2.42mmol)添加到反应混合物中。然后将混合物在30℃下搅拌0.5h。然后添加十二烷-1-硫醇(727mg，3.60mmol，860ul)和tfa(2.04g，18.0mmol，1.33ml)。将混合物在0℃搅拌1h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20/1，产物：rf＝0.34)指示m22-片段i-uc-dmtr被完全消耗并且形成许多新的斑点。通过添加nmi(20.0eq)淬灭反应混合物，然后过滤。然后将其用acn(300ml)研磨并过滤。获得m22-片段i-uc(2.64g，95.2％收率，95.1％纯度)，为白色固体。
[0999]
用于制备化合物m22-片段i-ucc的一般程序
[1000][1001]
向m22-片段i-uc(2.60g，1.18mmol)和c-dmtr(1.64g，1.77mmol)在tol.(12.6ml)和ipac(3.00ml)中的溶液中添加dci(279mg，2.36mmol)和分子筛3a(2.00g)。将混合物在30℃下搅拌1h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20/1，产物：rf＝0.48)指示m22-片段i-uc被完全消耗并且形成许多新的斑点。然后将氢化黄原素(358mg，2.38mmol)添加到反应混合物中。将混合物在30℃下搅拌0.5h。然后添加十二烷-1-硫醇(716mg，3.54mmol，846ul)和tfa(2.02g，17.7mmol，1.31ml)。将混合物在0℃搅拌1h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20/1，产物：rf＝0.41)指示m22-片段i-ucc-dmtr被完全消耗并且形成两个新的斑点。通过添加nmi(20.0eq)淬灭反应混合物，然后过滤。然后将其用acn(300ml)研磨并过滤。获得m22-片段i-ucc(3.23g，粗品)，为白色固体。
[1002]
用于制备化合物m22-片段i-uccc的一般程序
[1003]
[1004]
向m22-片段i-ucc(3.20g，1.16mmol)和c-dmtr(1.61g，1.74mmol)在tol.(15.4ml)和acn(3.80ml)中的溶液中添加dci(275mg，2.32mmol)和分子筛3a(1.50g)。将混合物在30℃下搅拌1h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20/1，两次，rf＝0.59)指示m22-片段i-ucc被完全消耗并且形成许多新的斑点。然后将叔丁基过氧化氢(5.50m，1.18mmol，106.85ul)添加到反应混合物中。将混合物在30℃下搅拌0.5h。然后添加十二烷-1-硫醇(711mg，3.52mmol，840ul)和tfa(2.00g，17.6mmol，1.30ml)。将混合物在0℃搅拌1h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20/1，三次，产物：rf＝0.54)指示m22-片段i-uccc-dmtr被完全消耗并且形成两个新的斑点。通过添加nmi(20.0eq)淬灭反应混合物，然后过滤。然后将其用acn(300ml)研磨并过滤。将白色固体减压浓缩，得到残余物。获得m22-片段i-uccc(3.60g，粗品)，为白色固体。
[1005]
用于制备寡核苷酸片段c的一般程序
[1006][1007]
向m22-片段i-uccc(3.40g，1.03mmol)和a-dmtr(1.45g，1.55mmol)在tol.(16.0ml)和acn(4.00ml)中的溶液中添加dci(244mg，2.06mmol)和分子筛3a(1.00g)。将混合物在30℃下搅拌1h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝15/1，三次，rf＝0.47)指示m22-片段i-uccc被完全消耗并且形成许多新的斑点。然后将氢化黄原素(307mg，2.04mmol)添加到反应混合物中。将混合物在30℃下搅拌0.5h。然后将十二烷-1-硫醇(615mg，3.04mmol，727ul)和tfa(1.73g，15.2mmol，1.12ml)添加到反应混合物中，并将混合物在0℃下搅拌1h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝15/1，三次，产物：rf＝0.45)指示m22-片段i-uccca-dmtr被完全消耗并且形成两个新的斑点。通过添加nmi(20.0eq)淬灭反应混合物，然后过滤。然后将其用acn(600ml)研磨并过滤。获得寡核苷酸片段c(3.90g，90.3％％收率和84.2％纯度)，为白色固体。
[1008]
实施例10.寡核苷酸片段d的合成
[1009]
a.寡核苷酸片段d的合成方案
[1010]
根据图5中描绘的合成方案合成片段d。
[1011]
b.寡核苷酸片段d的合成程序
[1012]
用于合成寡核苷酸片段d的程序与针对寡核苷酸片段a的合成所述的程序相似。
[1013]
实施例11.寡核苷酸片段e的合成
[1014]
a.寡核苷酸片段e的合成方案
[1015]
根据图6中描绘的合成方案合成片段e。
[1016]
b.寡核苷酸片段e的合成程序
[1017]
用于制备化合物e-2的一般程序
[1018][1019]
将化合物m19-片段i-u-dmtr(2.00g，1.17mmol，1.00eq)与无水dcm(12.0ml)和ch3cn(4.00ml)一起减压浓缩三次以除去水。在25℃下在ar下向化合物m19-片段i-u-dmtr(2.00g，1.17mmol，1.00eq)在dcm(16ml)中的溶液中一次性添加3a ms(1.60g)并搅拌0.5小时。添加dt-亚磷酰胺(1.31g，1.75mmol，1.5eq)和dci(276mg，2.34mmol，2.00eq)，并将混合物在25℃下搅拌1小时。hplc显示起始材料被完全消耗。将ddtt(480mg，2.34mmol，2.00eq)添加到反应溶液中。将混合物在25℃下搅拌0.5hr。hplc显示起始材料被完全消耗。将粗产物与acn(160ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物e-2(2.3g，964umol，83.0％收率)，为白色固体。c
137h198
n7o
22
pssina

[m na

]的质量计算值为2408.4，实测值为2408.4。
[1020]
用于制备化合物e-3的一般程序
[1021][1022]
在25℃下在n2下向化合物e-2(2.30g，964umol，1.00eq)在dcm(20.0ml)中的溶液中一次性添加c
12h25
sh(585mg，2.89mmol，693ul，3.00eq)。将tfa(1.32g，11.57mmol，856.38ul，12eq)添加到溶液中，并将混合物在0-5℃下搅拌并搅拌2小时。lcms显示起始材料被完全消耗。将nmi(1.19g，14.5mmol，1.15ml，15.0eq)添加到反应中并在0-5℃下搅拌0.5hr。将粗产物与acn(200ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化
合物e-3(2.00g，960umol，99％收率)，为白色固体。c
116h181
n7o
20
pssi

[m h

]的质量计算值为2083.3，实测值为2083.3。
[1023]
用于制备化合物e-4的一般程序
[1024][1025]
将化合物e-3(2.00g，959umol，1.00eq)与无水dcm(12.0ml)和acn(4.00ml)一起减压浓缩三次以除去水。在25℃下在ar下向化合物e-3(2.00g，959umol，1.00eq)在dcm(16ml)中的溶液中一次性添加3a ms(1.60g)并搅拌0.5hr。添加2'-ome a亚磷酰胺(1.28g，1.44mmol，1.50eq)和dci(227mg，1.92mmol，2.00eq)，并将混合物在25℃下搅拌1hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将ddtt(395mg，1.92mmol，2.00eq)添加到反应溶液中，并将混合物在25℃下搅拌0.5hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将粗产物与acn(160ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物e-4(2.11g，727umol，75.6％收率)，为白色固体。c158h219n13o28p2s2sina [m na ]的质量计算值为2923.5，实测值为2924.5。
[1026]
用于制备化合物e-5的一般程序
[1027][1028]
将化合物e-4(2.1g，723umol，1.00eq)与无水dcm(12.0ml)和acn(4.00ml)一起减压浓缩三次以除去水。在25℃下在n2下向化合物e-4(2.1g，723umol，1.00eq)在dcm(20.0ml)中的溶液中一次性添加c
12h25
sh(439mg，2.17mmol，520ul，3.00eq)。将tfa(990mg，8.68mmol，643ul，12.0eq)添加到溶液中，并将混合物在0-5℃下搅拌并搅拌2hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将nmi(891mg，10.8mmol，865ul，15eq)添加到反应中并在0-5℃下搅
拌0.5hr。将粗产物与acn(200ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物e-5(1.7g，653.77umol，90.37％收率)，为白色固体。c
137h202n13o26
p2s2si

[m h]的质量计算值为2599.3，实测值为2599.4。
[1029]
用于制备化合物e-6的一般程序
[1030][1031]
将化合物e-5(1.00g，385umol，1.00eq)与无水dcm(6.00ml)和acn(2.00ml)一起减压浓缩三次以除去水。在25℃下在ar下向化合物e-5(1.00g，385umol，1.00eq)在dcm(8.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(1.60g)并搅拌0.5hr。将5'-dmtro-2'-f u亚磷酰胺(440mg，577umol，1.50eq)和dci(90.8mg，769umol，2.00eq)添加到混合物中，并将混合物在25℃下搅拌1hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将ddtt(151mg，736umol，2.00eq)添加到反应溶液中，并将混合物在25℃下搅拌0.5hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将粗产物与acn(80ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物e-6(0.9g，273umol，74.3％收率)，为白色固体。c
170h233
fn
16o34
p3s3si

[m h]的质量计算值为3278.5118，实测值为3278.6255。
[1032]
用于制备片段e的一般程序
[1033][1034]
将化合物e-6(800mg，244umol，1.00eq)与无水dcm(6.00ml)和acn(2.00ml)一起减压浓缩三次以除去水。在25℃下在n2下向化合物e-6(800mg，244umol，1.00eq)在dcm(8.00ml)中的溶液中一次性添加c
12h25
sh(148mg，732umol，176ul，3.00eq)。将tfa(334mg，2.93mmol，217ul，12.0eq)添加到溶液中，并将混合物在0-5℃下搅拌并搅拌2hr。hrms显示起始材料被完全消耗。将nmi(300mg，3.66mmol，292ul，15.0eq)添加到反应中并在0-5℃下搅拌0.5hr。将粗产物与acn(80.0ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得片段e(600mg，201umol，82.6％收率)，为白色固体，c
149h214
fn
16o32
p3s3si

[m h]的hrms计算值为2976.3811，实测值为2976.3875。
[1035]
实施例12.寡核苷酸片段f的合成
[1036]
a.寡核苷酸片段f的合成方案
[1037]
根据图7中描绘的合成方案合成片段f。
[1038]
b.寡核苷酸片段f的合成程序
[1039]
用于制备化合物f-1的一般程序
[1040][1041]
将化合物e-1(0.5g，292.31umol，1.00eq)与无水dcm(4.0ml)和ch3cn(2.00ml)一起减压浓缩三次以除去水。在25℃下在ar下向化合物e-1(0.5g，292.31umol，1.00eq)在dcm(5.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(0.50g)并搅拌0.5hr。添加lna-t亚磷酰胺
(451.81mg，584.62umol，2.00eq)和dci(75.95mg，643.08umol，2.20eq)，并将混合物在25℃下搅拌1hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将ddtt(480mg，2.34mmol，2.00eq)添加到反应溶液中，并将混合物在25℃下搅拌0.5hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将粗产物与acn(50ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物f-1(2.3g，964umol，83.0％收率)，为白色固体。
[1042]
用于制备片段f的一般程序
[1043][1044]
将用nh3·
h2o(2.00ml)饱和的化合物f-1(50mg，19.23umol，1.00eq)的溶液在4ml的密封管中在70℃下搅拌16小时。无需任何纯化并将反应混合物过滤，得到滤液用于lcms。通过lcms证实片段f：c
45h50
n4o
16
ps-[m-h

]的hrms计算值为965.2686，实测值为965.2846。
[1045]
实施例13.寡核苷酸片段g的合成
[1046]
a.寡核苷酸片段g的合成方案
[1047]
根据以下描绘的合成方案合成片段g。
[1048][1049]
b.寡核苷酸片段g的合成程序
[1050]
将化合物e-1(500mg，292umol，1.00eq)与无水dcm(4.0ml)和acn(2.00ml)一起减压浓缩三次以除去水。在25℃下在ar下向化合物e-1(500mg，292umol，1.00eq)在dcm(4.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(500mg)并搅拌0.5hr。将2'-otbs a亚磷酰胺(578mg，585umol，2.00eq)和dci(75.9mg，643umol，2.20eq)添加到上述混合物中，并将混合物在25℃下搅拌1hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将ddtt(480mg，2.34mmol，2.00eq)添加到反应溶液中，并将混合物在25℃下搅拌0.5hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将粗产物与acn(40ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得片段g(700mg，266umol，91.1％收率)，为白色固体。c150h216n10o22pssi2 [m h ]的质量计算值为
2628.5043，实测值为2628.5959。
[1051]
实施例14.寡核苷酸片段h的合成
[1052]
a.寡核苷酸片段h的合成方案
[1053]
根据以下描绘的合成方案合成片段h：
[1054][1055]
b.寡核苷酸片段h的合成程序
[1056]
用于制备化合物h-1的一般程序
[1057][1058]
向化合物m-50(0.8g，621.08umol，1.00eq)和5'-dmtr-dexoy c-3'-oh(804.57mg，1.24mmol，2.00eq)在dcm(6.0ml)中的溶液中添加dmap(113.82mg，931.62umol，1.50eq)。将混合物在25℃下搅拌0.5h并添加edci(238.12mg，1.24mmol，2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌3hr。hplc显示起始材料被完全消耗。将残余物用h2o(50ml)稀释并用dcm(2x30ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物与etoh(30v，30.0ml)在25℃下研磨30min。将粗产物与acn(30v，30.0ml)在25℃下研磨30min。过滤并浓缩。获得化合物h-1(0.8g，0.41mmol，92.0％纯度，67.17％收率)，为白色固体。c
118h179
n5o
14
si2 [m 2h

]/2的质量计算值为959.1，实测值为960。
[1059]
用于制备化合物h-2的一般程序
[1060][1061]
在0-5℃下向化合物h-1(2.0g，1.04mmol，1.00eq)在dcm(16.0ml)中的溶液中添加c
12h25
sh(274.40mg，1.36mmol，324.74ul，1.30eq)和dca(1.08g，8.34mmol，685.20ul，8.00eq)。将混合物在0-5℃下搅拌2.5hr并添加nmi(856.20mg，10.43mmol，831.26ul，10.00eq)。将混合物在0-5℃下搅拌0.5hr。将残余物用nahco4/h2o(50ml)稀释并用dcm(2x30ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物与acn(30v，60.0ml)在25℃下研磨30min。过滤并浓缩。获得化合物h-2(1.4g，713.26umol，82.3％纯度，68.4％收率)，为白色固体。c
97h160
n5o
12
si

[m h

]的质量计算值为1615.1，实测值为1615.6。
[1062]
用于制备化合物h-3的一般程序
[1063][1064]
将化合物h-2(900mg，557umol，1.00eq)与无水dcm(8.0ml)和acn(2.00ml)一起减压浓缩三次以除去水。在25℃下在ar下向化合物h-2(900mg，557umol，1.00eq)在dcm(8.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(800mg)并搅拌0.5hr。将5'-dmtr-dexoy t-3'-亚磷酰胺(830mg，1.11mmol，2.00eq)和dci(197.4mg，1.67mmol，3.0eq)添加到上述混合物中。将混合物在25℃下搅拌1hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将ddtt(343mg，1.67mmol，3.00eq)添加到反应溶液中。将混合物在25℃下搅拌0.5hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将粗产物与acn(40ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物h-3(600mg，145.85mmol，47.3％收率)，为白色固体。c
110h176
n8o
18
pssi

[m-dmtr h

]的质量计算值为1988.2，实测值为1989.0。
[1065]
用于制备片段h的一般程序
[1066][1067]
向化合物h-3(0.2g，87.29umol，1.00eq)在thf(1.6ml)中的溶液中添加咪唑(118.86mg，1.75mmol，20.0eq)和吡啶/氢氟化物(24.94mg，872.95umol，70％纯度，10.0eq)在thf(0.6ml)中的溶液。将混合物在0-5℃下搅拌20hr(化合物h-3以》95％的转化率转化为片段h)。通过lcms证实片段h的结构。c
51h54
n6o
13
ps

[m h

]的质量计算值为1021.3，实测值为1021.4。
[1068]
实施例15.寡核苷酸片段j的合成
[1069]
a.寡核苷酸片段j的合成方案
[1070]
根据图8中描绘的合成方案合成片段j。
[1071]
b.寡核苷酸片段j的合成程序
[1072]
用于制备化合物j-2的一般程序
[1073][1074]
将化合物h-2(500mg，0.309umol，1.00eq)与无水dcm(8.0ml)和acn(2.00ml)一起
减压浓缩三次以除去水。在25℃在ar下向化合物h-2(500mg，0.309mmol，1.00eq)在dcm(5.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(500mg)并搅拌0.5hr。将5'-dmtr-moe-accc-3'-亚磷酰胺(化合物j-1(合成程序描述于wo2020/227618第[0332]-[0333]段，该内容通过引用并入本文)，1590mg，0.62mmol，2.00eq)和dci(110mg，0.927mmol，3.0eq)添加到上述混合物中，并将混合物在25℃下搅拌1hr。将ddtt(254mg，1.23mmol，4.00eq)添加到反应溶液中，并将混合物在25℃下搅拌0.5hr。将粗产物与acn(50ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物j-2(770mg，61％收率)，为白色固体。c
210h285n23o46
p4s3si

[m 2h

]/2的质量计算值为2057.4，实测值为2058.0。
[1075]
用于制备片段j的一般程序
[1076][1077]
将用nh3·
h2o(2.00ml)饱和的化合物j-2(50mg)的溶液在4ml的密封管中在65℃下搅拌8小时。无需任何纯化并将反应混合物过滤，得到滤液用于lcms。片段j：c
83h109n17o34
p4s3[m-2h]/2的质量计算值为1053.8，实测值为1054.4。
[1078]
实施例16.寡核苷酸片段k的合成
[1079]
a.寡核苷酸片段k的合成方案
[1080]
根据图9中描绘的合成方案合成片段k。
[1081]
b.寡核苷酸片段k的合成程序
[1082]
用于制备化合物k-1的一般程序
[1083][1084]
向化合物m-60(0.9g，676umol，1.00eq)和5'-dmtr-dexoy c-3'-oh(876.5mg，1.35mmol，2.00eq)在dcm(10.0ml)中的溶液中添加dmap(124mg，1.01mmol，1.50eq)。将混合物在25℃下搅拌0.5h并添加edci(260mg，1.35mmol，2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌3hr。hplc显示起始材料被完全消耗。将残余物用h2o(50ml)稀释并用dcm(2x20ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物与etoh(30v，30.0ml)在25℃下研磨30min。将粗产物与acn(30v，30.0ml)在25℃下研磨30min。过滤并浓缩。获得化合物k-1(1.2g，0.56mmol，82.4％收率)，为白色固体。c
121h184
n5o
14
si

[m 2h

]/2的质量计算值为980.7，实测值为981.1。
[1085]
用于制备化合物k-2的一般程序
[1086][1087]
在0-5℃下向化合物k-1(2.0g，1.04mmol，1.00eq)在dcm(16.0ml)中的溶液中添加c
12h25
sh(274.40mg，1.36mmol，324.74ul，1.30eq)和dca(1.08g，8.34mmol，685.20ul，8.00eq)。将混合物在0-5℃下搅拌2.5hr并添加nmi(856.20mg，10.43mmol，831.26ul，10.00eq)。将混合物在0-5℃下搅拌0.5hr。将残余物用nahco4/h2o(50ml)稀释并用dcm(2x30ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。将粗产物与acn(30v，60.0ml)在25℃下研磨30min。过滤并浓缩。获得化合物k-2(1.4g，713.26umol，68.4％收率)，为白色固体。c
100h166
n5o
12
si

[m h

]的质量计算值为1657.2，实测值为1657.9。
[1088]
用于制备化合物k-3的一般程序
[1089][1090]
将化合物k-2(1.0g，603umol，1.00eq)与无水dcm(8.0ml)和acn(2.00ml)一起减压浓缩两次以除去水。在25℃下在ar下向化合物k-2(1.0g，603umol，1.00eq)在dcm(8.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(800mg)并搅拌0.5hr。将5'-dmtr-dexoy t-3'-亚磷酰胺(898mg，1.21mmol，2.00eq)和dci(213.7mg，1.81mmol，3.0eq)添加到上述混合物中。将混合物在25℃下搅拌1hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将ddtt(372mg，1.81mmol，3.00eq)添加到反应溶液中，并将混合物在25℃下搅拌0.5hr。将粗产物与acn(40ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物k-3(1.20g，77.3％收率)，为白色固体。c
113h182
n8o
18
pssi

[m-dmtr h

]的质量计算值为2031.3，实测值为2031.0。
[1091]
用于制备片段k的一般程序
[1092][1093]
向化合物k-3(0.2g，85.7umol，1.00eq)在thf(1.6ml)中的溶液中添加咪唑(116.7mg，1.71mmol，20.0eq)和吡啶/氢氟化物(24.5mg，857.2umol，70％纯度，10.0eq)在thf(0.6ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌20hr(化合物k-3以》95％的转化率转化为片段k)。通过lcms证实片段k的结构。c
51h53
n6nao
13
ps

[m na

]的质量计算值为1043.3，实测值为1043.9。
[1094]
实施例17.用于制备片段l的h磷酸盐化学
[1095]
a.片段l的合成方案
[1096]
根据以下描绘的合成方案合成片段l：
[1097][1098]
b.寡核苷酸片段l的合成程序
[1099]
用于制备片段l的一般程序
[1100]
将化合物l-1(0.5g，0.70mmol，3.00eq)、新戊酰氯(85mg，0.70mmol，3.0eq)在吡啶(5ml)中的混合物在0℃下搅拌1h，添加化合物e-1(402mg，235.1mmol，1.0eq)，并将反应混合物在0℃下搅拌2.0h。在0-5℃下将碘(120mg，0.47mmol，2.00eq)和吡啶(121mg，1.53mmol，6.5eq)在thf/h2o(3ml，5:1,v/v)中的溶液逐滴添加到反应混合物中并在0-5℃下搅拌1h。在0-5℃下逐滴添加na2s2o3(116mg，0.47mmol，2.00eq)的4wt％水溶液并在15-25℃下搅拌10min。添加etoac(50ml)并剧烈搅拌30min。分离顶部有机层，用5wt％nahco3溶液(2x30ml)、盐水(30ml)洗涤，经mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物与acn(40ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得片段l(400mg)，为白色固体。c
134h195
n6o
23
psi[m]/2的质量计算值为1157.6，实测值为1157.6。
[1101]
实施例18.手性寡核苷酸片段m的合成
[1102]
a.手性寡核苷酸片段m的合成方案
[1103]
根据以下描绘的合成方案合成手性寡核苷酸片段m：
[1104][1105]
b.寡核苷酸片段m的合成程序
[1106]
用于制备化合物m-3的一般程序
[1107][1108]
将化合物m-1(134.7mg，140.3umol，1.00eq)与无水dcm(5.0ml)和acn(10.00ml)一
起减压浓缩两次以除去水。在25℃下在ar下向化合物m-1(134.7mg，140.3umol，1.00eq)和化合物m-2(160mg，93.5ummol，1.0eq)在dcm(2.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(200mg)并搅拌0.5hr。将buok(1.0m，281ul，3.00eq)添加到上述混合物中。将混合物在25℃下搅拌1hr。lcms显示起始材料被完全消耗。将混合物过滤并用dcm(0.5ml)洗涤。将粗产物与acn(20ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得手性片段m(175mg，69.9umol，74.7％收率)，为白色固体。c
120h189n9022
pssi

[m-dmtr h

]的质量计算值为2200.3，实测值为2200.1。
31
p nmr(162mhz,cdcl3)δ58.6ppm。
[1109]
用于制备片段m的一般程序
[1110][1111]
将用nh3·
h2o(2.00ml)饱和的化合物m-3(30mg)的溶液在4ml的密封管中在65℃下搅拌16小时。无需任何纯化并将反应混合物过滤，得到滤液用于lcms。通过lcms证实片段m。c
47h56
n7o
16
p-[m-h-]的hrms计算值为1036.3169，实测值为1036.3502。
[1112]
实施例19.手性寡核苷酸片段n的合成
[1113]
a.手性寡核苷酸片段n的合成方案
[1114]
根据以下描绘的合成方案合成手性寡核苷酸片段n：
[1115][1116]
用于制备化合物n-2的一般程序
[1117][1118]
将化合物m19-片段i-u(200mg，117umol，1.00eq)与无水dcm(1.0ml)和dcm(3.0ml)一起减压浓缩两次以除去水。在25℃下在ar下向化合物m19-片段i-u(200mg，117umol，1.00eq)和化合物n-1(68mg，152ummol，1.30eq)在dcm(2.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(200mg)并搅拌0.5hr。将dbu(23mg，152umol，1.30eq)添加到上述混合物中，并将混合物在25℃下搅拌1hr。将混合物过滤并用dcm(1.0ml)洗涤。将粗产物与acn(30ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物n-2(215mg，84.6umol，84.6％收率)，为白色固体。
[1119]
用于制备片段n的一般程序
[1120][1121]
将化合物n-2(109.4mg，153umol，1.50eq)与无水ch3cn(1.0ml)和dcm(3.0ml)一起减压浓缩两次以除去水。在25℃下在ar下向化合物5(109.4mg，153umol，1.50eq)和5'-dmtr-moe g-3'-oh(200mg，102.2umol，1.0eq)在dcm(2.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(200mg)并搅拌0.5hr。将buok(1.0m，307ul，3.0eq)添加到上述混合物中，并将混合物在25℃下搅拌1hr。将混合物过滤并用dcm(1.0ml)洗涤。将粗产物与acn(25ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得手性片段n(175mg，54.1umol，68.1％收率)，为白色固体。c
120h189n9022
pssi

[m-dmtr h

]的质量计算值为2200.3，实测值为2200.1。
31
p nmr(162mhz,cdcl3)δ58.6ppm。
[1122]
实施例20.寡核苷酸片段o的合成
[1123]
a.寡核苷酸片段o的合成方案
[1124]
根据图10中描绘的合成方案合成寡核苷酸片段n。
[1125]
b.寡核苷酸片段o的合成程序
[1126]
用于制备化合物o-1的一般程序
[1127][1128]
将5'-dmtro-c-otbdps-3'(5.0g，5.2mmol，1.00当量)、nh3
·
h2o(25％，3.6g，
[1129]
26.0mmol，5.00当量)和thf(40ml)的溶液在20
±
5℃下搅拌1.0h(hlpc指示5'-dmtro-c-otbdps-3'的转化率为42.8％)。将混合物浓缩，得到粗产物的残余物，将其通过硅胶色谱法(0-10％ thf的dcm溶液作为洗脱剂)纯化。获得化合物o-1，为淡黄色固体(1.6g，36.0％收率)。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ8.02(s,1h),7.90(d,j＝9.0hz,1h),7.64(d,j＝9.0hz,2h),7.58-7.09(m,22h),6.93-6.72(m,5h),5.96(s,1h),4.33(t,j＝4.5hz,1h),4.12(s,1h),3.63(t,j＝3.0hz,1h),3.39(s,2h),3.34(t,j＝3.0hz,2h),3.28-3.19(m,2h),3.18(s,3h),3.05-2.93(m,1h),1.39(s,3h),0.94(s,9h).13c{1h}nmr(75mhz,dmso-d6)δ168.4,165.8,158.6,155.3,114.9,135.9,135.7,135.4,133.1,130.2,128.6,128.2,128.1,127.9,113.7,102.0,87.8,86.5,82.5,81.7,71.7,71.4,69.2,63.1,58.6,55.5,27.1,19.3,13.3。c50h58n3o8si [m h] 的hrms计算值为856.3988，实测值为856.4009。
[1130]
用于制备化合物o-2的一般程序
[1131][1132]
在25℃下在下向化合物o-1(498mg，0.64mmol，1.50eq)和化合物m19(600mg，0.42mmol，1.0eq)在dcm(5.00ml)中的溶液中添加dipea(186mg，3.4eq)、hbtu(549mg、3.4eq)和hobt(192mg，3.4eq)并搅拌4小时。将粗产物与acn(40ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物o-2(700mg，0.32mmol，76.7％收率)，为白色固体。c
137h196n5013
pssi
2
[m h

]的质量计算值为2175.4363，实测值为2175.4373。
[1133]
用于制备化合物o-3的一般程序
[1134][1135]
在0-5℃下向化合物o-2(650mg，0.298mmol，1.00eq)在dcm(6.0ml)中的溶液中添加c
12h25
sh(180mg，3.0eq)和dca(339mg，10.0eq)。将混合物在0-5℃下搅拌2.5小时并添加nmi(293.5mg，12.00eq)。将混合物在0-5℃下搅拌0.5hr。将残余物用nahco4/h2o(50ml)稀释并用dcm(2x30ml)萃取。将粗产物与acn(40.0ml)在25℃下研磨30min。过滤并浓缩。获得化合物o-3(500mg，89％收率)，为白色固体。c
116h178
n5o
11
si
2
[m h

]的质量计算值为1874.3，实测值为1874.1。
[1136]
用于制备化合物o-5的一般程序
[1137][1138]
将化合物o-3(0.25g，133umol，1.00eq)与无水dcm(4.0ml)和acn(4.00ml)一起减压浓缩两次以除去水。在25℃下在ar下向化合物o-3(0.25g，133umol，1.00eq)在dcm(4.00ml)中的溶液中一次性添加3a ms(200mg)并搅拌0.5hr。将化合物o-5(816mg，0.4mmol，3.00eq)和dci(50mg，426umol，3.2eq)添加到上述混合物中。将混合物在25℃下搅拌1hr。将ddtt(60mg，292umol，2.20eq)添加到反应溶液中，并将混合物在25℃下搅拌0.5hr。将粗产物与acn(40ml)在25℃下研磨1hr。将混合物过滤并将滤饼真空浓缩。获得化合物o-5(0.25g，50％收率)，为白色固体。
[1139]
用于制备片段o的一般程序
[1140][1141]
将用nh3·
h2o(2.00ml)饱和的化合物o-5(20mg)的溶液在4ml的密封管中在65℃下搅拌20小时。无需任何纯化并将反应混合物过滤，得到滤液用于lcms。通过lcms证实片段o。c
74h91n12o31
p4s
4-[m-h-]的hrms计算值为1895.3752，实测值为1895.3716。
[1142]
实施例21.单体片段p的合成
[1143]
a.单体片段p的合成方案
[1144][1145]
b.片段p的合成程序
[1146]
用于制备化合物p-5的一般程序
[1147][1148]
在25℃下在下向化合物p-4((合成程序描述于european journal of organic chemistry(2003),(12),2327-2335，该文献通过引用并入本文)，1.0g，2.47mmol，1.0eq)和5'-dmtr-moe c-3'-oh(1.78g，2.47mmol，1.0eq)在dcm(20.0ml)中的溶液中添加edcl(947mg，2.0eq)和dmap(453mg，1.5eq)并搅拌24小时。将混合物真空浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷/etoac 5:1至3:1)纯化。获得化合物p-5，为白色固体(1.7g，1.48mmol，60％收率)。c
66h69n3011
si

[m h

]的质量计算值为1108.4，实测值为1108.4。
[1149]
用于制备片段p的一般程序
[1150][1151]
向化合物p-5(0.5g，0.45mmol，1.00eq)在thf(1.0ml)中的溶液中添加咪唑(614.2mg，9.02mmol，20.0eq)和吡啶/氢氟化物(128.9mg，4.5mmol，70％纯度，10.0eq)在thf(2.0ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌20hr(化合物p-5以》95％的转化率转化为片段p)。
[1152]
c.单体片段p的另选合成方案
[1153][1154]
d.片段p的另选合成程序
[1155]
用于制备化合物p-5'的一般程序
[1156][1157]
在25℃下在下向化合物p-4'(1.0g，2.92mmol，1.0eq)和5'-dmtr-moe c-3'-oh(2.10g，2.92mmol，1.0eq)在dcm(10.0ml)中的溶液中添加edcl(2.80g，5.0eq)和dmap(0.71g，2.0eq)并搅拌24小时。将混合物真空浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷/etoac 5:1至3:1)纯化。获得化合物p-5'，为白色固体(1.97g，90％收率)。c61h67n3011si [m h ]的质量计算值为1046.4，实测值为1046.4。
[1158]
用于制备片段p的一般程序
[1159][1160]
向化合物p-5'(0.3g，0.29mmol，1.00eq)在thf(1.0ml)中的溶液中添加咪唑(390.2mg，5.73mmol，20.0eq)和吡啶/氢氟化物(81.9mg，2.9mmol，70％纯度，10.0eq)在thf(2.0ml)中的溶液。将混合物在25℃下搅拌20小时，并且化合物p-5'以～60％的转化率转化为片段p。
[1161]
e.单体片段p的另选合成方案
[1162][1163]
用于制备化合物p-5*的一般程序
[1164][1165]
在25℃下在下向化合物p-4*(2.12g，6.23mmol，1.5eq)和5'-dmtr-moe c-3'-oh(3.0g，4.16mmol，1.0eq)在dcm(20.0ml)中的溶液中添加edcl(1.59g，2.0eq)和dmap(1.02g，2.0eq)并搅拌24小时。将混合物真空浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷/etoac 5:1至3:1)纯化。获得化合物p-5*，为粘性油状物(2.5g，93％收率)。c
61h65n3011
si

[m h

]的质量计算值为1046.4，实测值为1044.4。
[1166]
用于制备片段p的一般程序
[1167][1168]
向化合物p-5*(0.15g，0.145mmol，1.00eq)在thf(1.0ml)中的溶液中添加咪唑(195.1mg，2.87mmol，20.0eq)和吡啶/氢氟化物(41mg，1.45mmol，70％纯度，10.0eq)在thf(2.0ml)中的溶液。将混合物在50℃下搅拌6hr，并且化合物p-5*以～90％的转化率转化为片段p。
[1169]
实施例22.由m40合成寡核苷酸片段b
[1170]
a.由m40合成寡核苷酸片段b的方案
[1171]
根据图11中描绘的合成方案合成片段b。
[1172]
b.由试剂m40合成寡核苷酸片段b的程序
[1173]
用于由试剂m40合成寡核苷酸片段b的程序与针对由m19合成寡核苷酸片段b所述的程序相似，除了m40的选择性脱保护的最后一步。m40的选择性脱保护的程序如下所述。
[1174]
m40的选择性脱保护的程序
[1175][1176]
在氢气氛下，将dmtro-uttc-om40(1.0eq)和碳载钯(10wt％)在四氢呋喃和甲醇(0.05m，v/v，3:1)中的混合物在室温下剧烈搅拌1小时。过滤并浓缩反应混合物，得到残余物，使其在mtbe中沉淀，得到所需产物。获得片段b，为淡黄色固体，收率为70.5％且纯度为85.2％。
[1177]
实施例23.用于制备p＝o连键的一锅程序
[1178]
a.用于制备p＝o连键的一锅程序方案
[1179][1180]
b.用于制备p＝o连键的程序
[1181]
将化合物1(12g，10mmol，1.00eq)、moe c亚磷酰胺(11.16g，12mmol，1.20eq)和ms(12.0g)在ch3cn/dcm(100ml，v/v＝1:3)中的混合物在20-30℃下搅拌1h，添加dci(1.94g，15mmol，1.50eq)，并将反应混合物在20-30℃下搅拌1.0h(hplc指示反应转化率》
99.5％)。添加h2o(40mg，2mmol，0.2eq)，并将混合物在25℃下搅拌30min。在0-5℃下将nmi(1.35g，15mmol，1.5eq)、bpo(3.89g，11mmol，1.1eq)和碘(278mg的dcm溶液，6ml，1mmol，0.1eq)添加到反应混合物中并在0-5℃下搅拌1h。添加哌嗪(652mg，7mmol，0.7eq)，并将混合物在0-5℃下搅拌30min。添加十二烷-1-硫醇(6.64g，3.0eq)和ms(10.0g)，并将混合物在0-10℃下搅拌60min。在0-5℃下逐滴添加tfa(13.7g，110mmol，11.00eq)并在10-20℃下搅拌60min。在0-5℃下添加nmi(9.88g，110mmol，11.0eq)并在0-5℃下搅拌10min。将反应混合物过滤以除去ms，并在剧烈搅拌下添加到5％ nahco3溶液(120ml)中。添加etoac(120ml)和mtbe(120ml)并剧烈搅拌10min。分离有机层，用5％ nahco3水溶液(120ml)、h2o(120ml)、盐水(120ml)洗涤，经mgso4(24g)干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物溶解在etoac(36ml)中并缓慢添加到庚烷/tbme(216l，1:1，v/v)的混合物中。将沉淀的产物过滤，用庚烷/tbme(2x400ml，1:1，v/v)洗涤，并在20-30℃下真空干燥16h，得到化合物3，为白色固体(14.3g，80.1％收率)。c
82h97
n11o
24
p2ssi

[m h]

的hrms计算值为1742.5751，实测值为1742.5732。
[1182]
c.不同氧化试剂的比较
[1183]
在用于制备p＝o连键的一锅程序(偶联/氧化/脱三苯甲基化)中测试了几种氧化试剂，包括碘/吡啶、mcpba、bpo和tbuooh。显示反应产物3以及副产物1和2的方案在图12中描绘。每种氧化试剂的性能在下表2中总结。
[1184][1185]
氧化试剂bpo和tbuooh在用于制备寡核苷酸中的p＝o连键的一锅程序中表现出比碘/吡啶和mcpba优越的氧化性能。当在一锅程序中使用bpo或tbuooh时，它们都比碘/吡啶和mcpba产生更少的副产物。另外，一锅程序对于碘/吡啶是不成功的，因为在进行脱三苯甲基化步骤之前需要额外的纯化步骤来除去吡啶。
[1186]
实施例24.寡核苷酸i的合成
[1187][1188]
步骤1：化合物i-3的合成
[1189][1190]
在ar下向第一圆底烧瓶(rbf)中添加化合物i-2(1eq)。通过在25-30℃下与(dcm/acn＝3:1，4v)共蒸发将其干燥三次。然后将dcm/acn＝2:1(6v)添加到rbf中，随后在25-30℃下在1h内添加3a ms(5％)。然后在ar下将化合物i-1(1.5eq)添加到第二rbf中，并在25-30℃下通过与(acn 4v)共蒸发干燥三次。将dcm(2v)添加到第二rbf中，并在20-25℃下将第二rbf中的所得溶液逐滴添加到第一rbf中，然后添加dci(2eq)。将所得混合物在25-30℃下搅拌1h。取样进行分析。然后向反应混合物中添加ddtt(2eq)。将混合物在25-30℃下搅拌0.5h。取样进行分析。然后过滤混合物以除去ms，用dcm(2v x 2)洗涤。在20℃下在0.5h内将所得溶液缓慢添加到acn(50v)中。通过过滤收集固体，用acn(5v x 2)洗涤，得到化合物i-3，为白色固体。
[1191]
步骤2：化合物i-3的脱三苯甲基化
[1192][1193]
在ar下将化合物i-3(1eq)添加到rbf中，然后在0-5℃下在ar下添加dcm(7v)，并在20-25℃下在1h内添加3a ms(5％)。然后向混合物中添加c
12h25
sh(2eq)，然后在0-5℃下在2h内逐滴添加tca(10eq)。取样进行分析。在0-5℃下添加py(12eq)。过滤混合物以除去ms并用dcm(2v x 2)洗涤。通过添加nahco3(4％wt，10v)将ph值调节至7～8。然后将混合物用dcm(2v x 2)萃取。将有机层经无水mgso4干燥，过滤，并用dcm(2v x 2)洗涤。将滤液浓缩至～5v，在20℃在0.5h内将其缓慢添加到acn(50v)中。通过过滤收集固体并用acn(5v x 2)洗涤，得到化合物i-4，为白色固体。
[1194]
步骤3：化合物i-6的合成
[1195][1196]
在ar下将化合物i-4(1eq)添加到第一rbf中。通过在25-30℃下与dcm/acn(3:1，4v)共蒸发将其干燥三次。然后将dcm/acn(2:1，6v)添加到rbf中，随后在25-30下在1h内添加3a ms(5％)。在ar下将化合物i-5(1.5eq)添加到第二rbf中。通过在25-30℃下与acn(4v)共蒸发将混合物干燥三次，然后添加dcm(2v)。在20-25℃下将第二rbf中的所得溶液逐滴转移到第一rbf中，然后添加dci(2eq)。将所得混合物在25-30℃下搅拌1h。取出样本进行分析。将ddtt(2eq)添加到rbf中。将所得混合物在25-30℃下搅拌0.5h。取出样本进行分析。然后过滤反应混合物以除去ms，用dcm(2v x 2)洗涤。在20℃下在0.5h内将所得溶液缓慢添加到acn(50v)中。通过过滤收集固体并用acn(5v x 2)洗涤，得到化合物i-6，为白色固体。
[1197]
步骤4：化合物i-6的脱三苯甲基化
[1198][1199]
在ar下将化合物i-6(1eq)添加到圆底烧瓶(rbf)中，然后在0-5℃下在ar下添加dcm(7v)，并在20-25℃下在1h内添加3a ms(5％)。然后向混合物中添加c
12h25
sh(3eq)，然后在0-5℃下在2h内逐滴添加tca(12eq)。取出样本进行分析。然后在0-5℃下将py(15eq)添加到rbf中。过滤混合物以除去ms并用dcm(2v x 2)洗涤。通过添加nahco3(4％wt，10v)将ph值调节至7～8。然后将其用dcm(2v x 2)萃取。将有机层经无水mgso4干燥，过滤，并用dcm(2v x 2)洗涤。将滤液浓缩至～5v，在20℃在0.5h内将其缓慢添加到acn(50v)中。通过过滤收集固体并用acn(5v x 2)洗涤，得到化合物i-7，为白色固体。
[1200]
步骤5：寡核苷酸i的合成
[1201][1202]
在ar下将化合物i-7(1eq)添加到第一rbf中。通过在25-30℃下与dcm/acn(3:1，4v)共蒸发将其干燥三次。然后将dcm/acn(3:1，10v)添加到rbf中，随后在25-30下在1h内添加3a ms(5％)。在ar下将化合物i-8(1.7eq)添加到第二rbf中。通过在25-30℃下与acn(4v)共蒸发将混合物干燥三次，然后添加dcm(2v)。在20-25℃下将第二rbf中的所得溶液逐滴转移到第一rbf中，然后添加dci(2.5eq)。将所得混合物在25-30℃下搅拌1h。取出样本进行分析。将ddtt(2eq)添加到rbf中。将所得混合物在25-30℃下搅拌0.5h。取出样本进行分析。然后过滤反应混合物以除去ms，用dcm(2v x 2)洗涤。在20℃下在0.5h内将所得溶液缓慢添加到acn(50v)中。通过过滤收集固体并用acn(5v x 2)洗涤，得到3.1g寡核苷酸i(76.4％收率，69％ uv纯度)，为白色固体。
[1203]
实施例25.寡核苷酸i的大规模合成
[1204]
a.寡核苷酸i的合成方案
[1205]
根据图13中描绘的合成方案以50克规模合成寡核苷酸i。
[1206]
b.寡核苷酸i的合成程序
[1207]
用于制备化合物i-2的一般程序
[1208][1209]
在n2气氛在将片段1p(24.0g，14.1mmol)、片段5(44.1g，17.2mmol)、ms(5g/100ml，12g)和dcm(240ml)的混合物在20-25℃下搅拌1.0h。添加dci(6.6g，56.4mmol)并将
反应混合物在20-30℃下搅拌1.0h。添加ddtt(7.2g，35.25mmol)并将反应混合物在20-25℃下搅拌30min。添加十二烷-1-硫醇(9.94g，49.3mmol)并将反应混合物在0
±
5℃下搅拌10min。缓慢添加tfa(14.4g，126.9mmol)并将反应混合物在0
±
5℃下搅拌1.0h。在10min内添加nmi(12.7g，155.1mmol)，并将反应混合物过滤以除去ms，通过旋转蒸发仪浓缩至约100ml，并在0
±
5℃下在剧烈搅动下在30min内添加到ch3cn(2.6l)中。将沉淀的产物过滤，用acn(2x100ml)洗涤并在20-30℃下真空干燥16h，得到化合物i-2，为白色固体(46.7g，85.1％收率)。
[1210]
用于制备化合物i-3的一般程序
[1211][1212]
在n2气氛下将化合物i-2(44.0g，11.3mmol)、化合物i-1(40.8g，15.9mmol)、ms(44g)和acn/dcm(440ml，1:3,v/v)的混合物在20-25℃下搅拌1.0h。添加dci(6.66g，56.5mmol)，并将反应混合物搅拌1.0h。添加ddtt(5.1g，34.9mmol)并将反应混合物在20-25℃下搅拌30min。过滤反应混合物并用dcm(2x50ml)洗涤ms滤饼。将合并的滤液在旋转蒸发仪上浓缩至约200ml，并在0
±
5℃下在剧烈搅动下在30min内添加acn(2l)中。将沉淀的产物过滤，用acn(2x100ml)洗涤并在20-30℃下真空干燥12h，得到化合物i-3，为浅黄色固体(71.4g，98.6％收率)。
[1213]
用于制备化合物i-4的一般程序
[1214][1215]
在n2气氛下将化合物i-3(69.0g，10.8mmol)、ms(71.0g)和dcm(480ml)的混合物在20-25℃下搅拌1.0h并冷却至0
±
5℃。添加十二烷-1-硫醇(5.6g，27mmol)并将反应混合物在0℃下搅拌10min。缓慢添加tfa(13.6g，118.8mmol)并将反应混合物在0
±
5℃下搅拌1.5。在10min内添加nmi(11.5g，140.4mmol)，将反应混合物过滤以除去ms，在旋转蒸发仪上浓缩至约200ml并在0
±
5℃下在剧烈搅动下在30min内添加到acn(2.5l)中。将沉淀的产物过滤，用acn(2x172ml)洗涤并在20-30℃下真空干燥14h，得到化合物i-4，为白色固体(55.86g，85.0％收率)。
[1216]
用于制备化合物i-6的一般程序
[1217][1218]
在n2气氛下将化合物i-4(39.9g，6.55mmol)、化合物i-5(18.8g，9.17mmol)、ms(40g)和acn/dcm(400ml，1:3,v/v)的混合物在20-25℃下搅拌1.0h。添加dci(3.87g，32.8mmol)，并将反应混合物搅拌1.0h。添加ddtt(2.96g，14.4mmol)并将反应混合物在20-25℃下搅拌30min。添加dcm(100ml)并过滤反应混合物，并用dcm(2x30ml)洗涤ms滤饼。将合并的滤液在旋转蒸发仪上浓缩至约200ml，并在0
±
5℃下在剧烈搅动下在30min内缓慢添加到acn(1.36l)中。将沉淀的产物过滤，用acn(3x100ml)洗涤并在20-30℃下真空干燥12h，得到化合物i-6，为浅黄色固体(49.8g，94.3％收率)。
[1219]
用于制备化合物i-7的一般程序
[1220][1221]
在n2气氛下将化合物i-6(50.0g，6.20mmol)、ms(18.0g)和dcm(350ml)的混合物在20-25℃下搅拌1.0h并冷却至0
±
5℃。添加十二烷-1-硫醇(3.77g，18.6mmol)，并将反应混合物在0℃下搅拌10min。缓慢添加tfa(9.19g，80.6mmol)并将反应混合物在0
±
5℃下搅拌1.5h。在10min内添加nmi(8.14g，99.2mmol)，并过滤反应混合物，并用dcm洗涤ms滤饼。将合并的滤液在旋转蒸发仪上浓缩至约200ml，并在0
±
5℃下在剧烈搅动下在30min内添加到acn(2.65l)中。将沉淀的产物过滤，用acn(3x150ml)洗涤并在20-30℃下真空干燥14h，得到化合物i-7，为白色固体(45.9g，95.3％收率)。
[1222]
用于制备寡核苷酸i的一般程序
[1223][1224]
在n2气氛下将化合物i-7(42.0g，5.41mmol)、化合物i-8(23.9g，9.74mmol)、ms(42g)和dcm/ch3cn(400ml，3:1,v/v)的混合物在20-25℃下搅拌1.0h。添加dci(3.2g，27.05mmol)，并将反应混合物搅拌1.0h。添加ddtt(2.45g，11.9mmol)并将反应混合物在20-25℃下搅拌30min。添加dcm(200ml)并过滤反应混合物，并用dcm(2x50ml)洗涤ms滤饼。将合并的反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩至约300ml，并在0
±
5℃下在剧烈搅动下在30min内缓慢添加到acn(2.50l)中。将沉淀的产物过滤，用acn(2x150ml)洗涤并在20-30℃下真空干燥14h，得到寡核苷酸i，为浅黄色固体(51.6g，94.1％收率)。
[1225]
寡核苷酸i的表征：将寡核苷酸i(100.0mg)和30％ nh4oh(2ml)在4ml耐压烧瓶中的混合物在65℃下搅拌4h。在lcms中检查所得化合物。通过lcms证实寡核苷酸i的结构。c
231h318n53o118
p
17s15
/4-[m]/4的hrms计算值为1682.0，实测值为1682.1。
[1226]
具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人在不脱离本公开的一般概念的情况下可以通过应用本领域技术范围内的知识容易地针对此类具体实施方案的各种应用进行修改和/或改编，而无需过度实验。因此，基于本文所呈现的教导内容和指导内容，此类改编和修改意图落入所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解，本文的措词或术语用于描述而非限制目的，因此本说明书的术语或措辞将由技术人员根据教导内容和指导内容来解释。
[1227]
本公开的广度和范围不应受任何上述例示性实施方案的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物来限定。