治疗冠状病毒的化合物和方法

1.本发明涉及氯福克酚(clofoctol)在用于治疗由冠状病毒(特别是covid-19)引起的疾病中的用途。


背景技术：

2.冠状病毒属于冠状病毒(coronaviridae)科(嵌套病毒(nidovirales)目)，包括具有单链、正义rna基因组的病毒，大小约为26至32千碱基。冠状病毒科包括α冠状病毒(αcov)、β冠状病毒(βcov)、δ冠状病毒(δcov)和γ冠状病毒(γcov)。蝙蝠和啮齿动物被认为是αcov和βcov的宿主。目前，尚不清楚哪些动物是δcov和γcov的宿主。冠状病毒是根据它们在电子显微镜下的外观来命名的，由于在其包膜上存在刺突糖蛋白，这些病毒看起来覆盖着尖锐的结构围绕着它们，像花冠(corona)或王冠一样。
3.自21世纪初以来，三种冠状病毒已跨越物种屏障，在人中引起致死性的肺炎：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(mers-cov)和sars-cov-2(也称为2019-ncov)。sars-cov-2是有包膜的、正义、单链的rna病毒，属于βcov属，该属还包括sars-cov和mers-cov。sars-cov-2与蝙蝠sars样cov具有89％的核苷酸同一性，与人sars-cov具有82％的同一性。其他可以感染人的冠状病毒包括人冠状病毒nl63(hcov-nl63)、人冠状病毒oc43(hcov-oc43)、人冠状病毒hku1(hcov-hku1)和人冠状病毒229e(hcov-229e)。
4.冠状病毒进入宿主细胞是由跨膜刺突(s)糖蛋白介导的，该糖蛋白形成从病毒表面突出的同源三聚体。已经证明，除了直接膜融合之外，sars-cov还可以通过内吞途径进入细胞，这种内吞感染导致病毒基因表达(cell research 2008；18:290-301)。关于sars-cov-2，有人提出ace2(血管紧张素转换酶2)介导sars-cov-2s介导的进入细胞，使其成为这种新出现的冠状病毒的功能受体；sars-cov-2s与人ace2结合，其亲和力与sars-cov s相当(cell 2020；180：281-292)。还证明sars-cov-2使用跨膜蛋白酶serine 2(tmprss2)用于启动(prime)s蛋白(cell 2020；181：271-280)。
5.自sars-cov-2的出现以及相关疾病covid-19的爆发以来，已经测试了许多药物(无论是在研药物还是已经上市的药物)在治疗/缓解covid-19作用方面的潜在疗效。据发明人所知，当sars-cov-2可以以两种途径进入(即内吞进入和融合进入)细胞时，这些药物在受感染的组织中在可以达到的浓度(以可耐受的剂量)均未显示阻断病毒周期。
6.氯福克酚(2-(2,4-二氯苯基)-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚，cas编号37693-01-9，pubchem cid 2799)是抑菌抗生素，适用于治疗由革兰氏阳性菌引起的感染。氯福克酚首先描述在法国专利申请2101076中。该化合物随后被证明可以激活未折叠的蛋白质的反应通路，使其成为治疗前列腺癌的潜在候选药物(british journal of pharmacology2014；171:4478-4489)。最近，氯福克酚已被证明可激活ebv裂解基因表达(journal of virology 2019；93(20)：e00998-19)并通过激活klf13从而抑制神经胶质瘤干细胞的增殖(j clin invest.2019；129(8):3072-3085)。


技术实现要素：

7.现在已经发现，当sars-cov-2可以通过两种进入途径，即内吞进入和融合进入到细胞中时，氯福克酚阻断病毒周期。因此，已发现氯福克酚可以有效地抑制sars-cov-2引起的细胞病变效应，减少感染该病毒的细胞中的病毒载量。
8.因此，本发明涉及氯福克酚在用于预防或治疗由冠状病毒，如sars-cov、mers-cov、sars-cov-2、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1或hcov-229e引起的疾病中的用途。本发明还涉及治疗由冠状病毒，如sars-cov、mers-cov、sars-cov-2、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1或hcov-229e引起的疾病的方法，方法包括向需要其的受试者施用氯福克酚。
附图说明
9.图1和图3显示了不同浓度的氯福克酚对sars-cov-2感染的vero81细胞(未转导tmprss2基因(图1)或转导tmprss2基因(图3))的细胞病变效应的效果。
10.图2和图4显示了不同浓度的氯福克酚对sars-cov-2感染的vero81细胞(未转导tmprss2基因(图2)或转导tmprss2基因(图4))的生长提高的效果。
11.图5和图6显示了氯福克酚对sars-cov-2感染的vero81细胞以及sars-cov-2感染的tmprss2转导的vero81细胞中的sars-cov-2基因组复制的作用。
12.图7显示氯福克酚对sars-cov-2感染的vero81细胞以及sars-cov-2感染的tmprss2基因转导的vero81细胞中的sars-cov-2载量的作用。
13.图8显示氯福克酚对sars-cov-2感染的calu-3细胞中sars-cov-2的基因组复制的作用。
14.图9显示氯福克酚在c57bl/6j小鼠中的药代动力学。
15.图10显示氯福克酚对在k18-hace2转基因的c57bl/6j小鼠中的sars-cov-2感染的作用。
16.图11显示氯福克酚对使用两种不同的sars-cov-2变种感染的vero81细胞中sars-cov-2的基因组复制的作用。
17.图12显示氯福克酚对在huh-7细胞中hcov-229e-rluc病毒生长的抑制作用。
18.图13显示氯福克酚对受感染的vero81细胞(下曲线)和tmprss2转导的受感染的vero81细胞(上曲线)中病毒分泌的作用。
19.图14显示氯福克酚对受感染的vero81细胞(上曲线)和tmprss2转导的受感染的vero81细胞(下曲线)中病毒复制的作用。
20.图15显示氯福克酚对受感染的人支气管上皮细胞中病毒分泌的作用。
21.图16显示氯福克酚对受感染的人支气管上皮细胞中病毒分泌的作用。
具体实施方式
22.在本公开的上下文中，可以结合下文描述的各种实施方案。
23.在第一个方面，本发明涉及氯福克酚在用于预防或治疗由冠状病毒，如sars-cov、mers-cov、sars-cov-2、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1或hcov-229e引起的疾病中的用途。特别地，氯福克酚特别适用于预防或治疗冠状病毒，如sars-cov、mers-cov、sars-cov-2引起的疾病。
24.在一个实施方案中，冠状病毒是sars-cov-2，对应的疾病是covid-19。本领域技术人员应理解，sars-cov-2的变种包含在通用术语“sars-cov-2”中。此类变种的示例包括具有d614g突变的b.1变种，其传代(descends)产生b.1.1.7变种；b.1.526变种；b.1.351变种；b.1.1.248变种；尤其是b.1.427和b.1.429变种；变种b.1.617。
25.在一个实施方案中，氯福克酚与至少一种其他(小分子的或生物的)活性成分联合施用，该活性成分正在或已经用于研究治疗sars-cov、mers-cov或sars-cov-2。与氯福克酚的施用相比，至少一种其他活性成分的施用可以是同时的、相继的或过一段时间再施用。
26.在一个实施方案中，至少一种其他活性成分选自：
27.阿贝西利(abemaciclib)、二甲磺酸阿米三嗪(almitrine bismesylate)、阿莫地喹(amodiaquine)、阿纳金拉(anakinra)、血管紧张素1-7、阿尼芬净(anidulafungin)、阿哌沙班(apixaban)、阿司匹林、阿伐曲泊帕(avatrombopag)、阿奇霉素、巴尼韦单抗(bamlanivimab)、巴瑞替尼(baricitinib)、巴多昔芬(bazedoxifene)小檗胺(berbamine)、依匹哌唑(brexpiprazole)、溴己新(bromhexine)、卡莫司他(camostat)、卡那单抗(canakinumab)、卡西维单抗(casirivimab)、千金藤素(cepharanthine)、塞瑞替尼(ceritinib)、乙酰吡啶、氯喹、氯丙嗪、环索奈德(ciclesonide)、枸橼酸氯米芬(clomifene citrate)、考比司他(cobicistat)、氯康唑(croconazole)、环孢霉素、丹诺普韦(danoprevir)、地瑞那韦(darunavir)、地塞米松、洋地黄毒苷、地高辛、双氢青蒿素(dihydroartemisinine)、二氢藤黄酸(dihydrogambogic acid)、地尔硫卓、决奈达隆(dronedarone)、屈他维林(drotaverine)、依巴斯汀(ebastine)、艾曲波帕(eltrombopag)、依马帕单抗(emapalumab)、埃特司韦单抗(etesevimab)、依沙维林(ethaverine)、法匹拉韦(favipiravir)、芬戈莫德(fingolimod)、芬尼唑啉(flunarizine)、吉列替尼(gilteritinib)、三尖杉酯碱(harringtonine)、血卟啉、六氯酚、氢化可的松、羟氯喹、己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、尹德维单抗(imdevimab)、imu-838、干扰素β-1a、干扰素β-1b、isoosajin、异橙桑黄酮(isopomiferin)、异维a酸、伊伐卡托(ivacaftor)、伊维菌素(ivermectin)、js016、酮康唑、利多氟嗪(lidoflazine)、洛派丁胺(loperamide)、洛匹那韦(lopinavir)、氯雷他定、氯替泼诺依碳酸酯(loteprednol etabonate)、卢舒曲波帕(lusutrombopag)、ly-cov555、甲氟喹、甲基泼尼松龙、莫努匹韦、萘莫司他(nafamostat)、氯硝柳胺(niclosamide)、硝唑尼特(nitazoxanide)、高三尖杉酯碱(omacetaxine mepesuccinate)、奥沙金(osajin)、奥司他韦(oseltamivir)、奥希替尼(osimertinib)、奥替利单抗(otilimab)、哇巴因(ouabain)、奥昔康唑(oxiconazole)、羟氯柳苯胺(oxyclozanide)、奥扎莫德(ozanimod)、罂粟碱(papaverine)、聚乙二醇化干扰素λ、马来酸哌克西林(perhexiline maleate)、哌西达替尼(pexidartinib)、pf-07321332、非那吡啶(phenazopyridine)、聚多卡醇(polydocanol)、泊沙康唑(posaconazole)、泼尼松、重组人干扰素α1β、重组干扰素α-2b、瑞格拉非尼(regorafenib)、瑞德西韦(remdesivir)、利巴韦林、利托那韦、鲁索替尼(ruxolitinib)、西他列汀(sitagliptin)、索非布韦(sofosbuvir)、索尼德吉(sonidegib)、索拉非尼(sorafenib)、它莫昔芬(tamoxifen)、沙利度胺(thalidomide)、硫汞撒(thimerosal)、甲硫哒嗪(thioridazine)、胸腺素α1、替洛隆(tilorone)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、托珠单抗(tocilizumab)、托瑞米芬(toremifene)、曲帕拉醇(triparanol)、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)、乌米诺维(umifenovir)。
28.在一个实施方案中、氯福克酚以包含至少一种药学上可接受的赋形剂(除氯福克酚之外)的药物组合物的形式施用。赋形剂、药物组合物及其制备方法是本领域公知的(参见，例如handbook of pharmaceutical excipients，rowe等人，第七版，2012年6月；rules and guidance for pharma manufacturers and distributors 205，medecines and healthcare products regulatory agency，英国伦敦)。
29.在另一方面，本发明涉及预防或治疗由冠状病毒，如sars-cov、mers-cov、sars-cov-2、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1或hcov-229e引起的疾病的方法，方法包括向需要其的受试者施用氯福克酚。在一些实施方案中，冠状病毒是sars-cov、mers-cov或sars-cov-2。在一些实施方案中，冠状病毒是sars-cov-2，对应的疾病是covid-19。
30.氯福克酚目前的施用途径是直肠途径。含有100mg、200mg或750mg的氯福克酚的栓剂可以用合适的药学上可接受的赋形剂制备。
31.在一个实施方案中，受试者患有一种或多种以下病症或疾病：超重、肥胖、糖尿病、高脂血症、动脉高血压、心血管疾病、慢性肾病、免疫抑制。
32.在一个实施方案中，该方法还包括向受试者施用至少一种其他活性成分。相对于氯福克酚的施用，至少一种其他活性成分的施用可以是同时的、相继的或过一段时间再施用。
33.在一个实施方案中，至少一种其他活性成分如上所定义。
34.氯福克酚已被证明可以抑制hsars-cov2在vero81细胞和tmprss2转导的vero81细胞中、以及在人calu-3细胞中的细胞病变效应。vero81细胞允许病毒以基于内吞作用的进入方式进入。当用tmprss2转导时，vero81细胞变为允许病毒以两种进入方式(内吞作用和融合)进入。还证明，氯福克酚抑制在相同细胞和人calu-3细胞中的该病毒的基因组复制，calu-3细胞也为该病毒提供两种进入方式。还证明氯福克酚减少感染该病毒的细胞(vero81细胞和转导tmprss2的vero81细胞)培养物中的病毒载量。已经进一步证明，氯福克酚减少sars-cov-2感染的小鼠(k18-hace2)肺部中的病毒载量。已经进一步证明，氯福克酚抑制sars-cov-2的2种不同变种的病毒基因组复制。已经进一步证明，氯福克酚抑制hcov-229e(α冠状病毒)的复制。
35.以下实施例为阐明目的包括在内，不应理解为以任何方式进行限制。
36.实施例
37.病毒分离与扩增
38.从患者样本中分离出人冠状病毒sars-cov2(hsars-cov2)，注释为βcov/法国/idf0372/2020。其在体外使用并在表达tmprss2的vero-81细胞中扩增，在平板中培养并孵育，直至细胞单层被完全破坏。sars-cov-2的谱系b1.1.7(gisaid登录号epi_isl_1653931)是体外使用的sars-cov-2的第二个变种。收获后，通过将上清液的连续10倍稀释液(10-1
至10-8
)分配至vero-81细胞(在补充有2％fbs(胎牛血清)的dmem上孵育)上进行病毒滴定。将板在37℃和5％co2条件下孵育5天。之后，使用倒置显微镜(zeiss primovert)检查平板，以评估在细胞培养物中病毒引起的细胞病变效应的程度。通过spearman和karber方法计算估计的病毒浓度，表示为log10 tcid
50
/ml(50％的组织培养物感染的剂量，即在50％的感染细胞中产生细胞病变效应的病毒量)。该方法的检测极限为1.5tcid
50
/ml。
39.sars-cov-2的hcov-19_ipl_法国株(ncbi mw575140)也用于体外和体内实验。将
病毒以moi 0.01接种，使其在表达tmprss2的vero-e6细胞中增殖。在感染后，在72小时收获细胞上清液介质，并以小等分在-80℃下冷冻储存。
40.tmprss2转导
41.用表达tmprss2的慢病毒转导vero-81细胞。将tmprss2克隆到ptrip载体中，根据制造商的说明，通过使用ptrip-tmprss2、phcmv-vsvg和hiv gag-pol以及turbofect
tm
(thermofischer)转染hek293t细胞，产生慢病毒载体。含有慢病毒载体的上清液用于转导细胞。然后，在转导后72小时，将细胞用于实验。
42.细胞病变效应的测量
43.细胞培养：
44.在37℃在5％co2的湿润气氛中，将vero细胞[ccl-81
tm
，ecacc，sigma-aldrich，法国，下文称为“vero81”细胞]在补充有10％的胎牛血清(fbs)和glutamax
tm
的杜尔贝科氏(dulbecco’s)改良的伊格尔(eagle)介质(dmem)中培养。
[0045]
在37℃在5％co2中，将huh-7细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清(fbs，eurobio)的杜尔贝科氏改良的伊格尔介质(dmem，gibco)中培养。
[0046]
calu-3细胞(clinisciences，ep-cl-0054)在补充有glutamax(gibco)和10％的热灭活fbs的最极限必需介质(gibco，mem)中生长。
[0047]
在37℃在5％co2中，将vero-e6细胞(atcc，crl-1586)在补充有10％的热灭活的胎牛血清(fbs，eurobio)的杜尔贝科氏改良的伊格尔介质(dmem，gibco)中培养。
[0048]
测试的化合物：在dmso中以所需的浓度制备氯福克酚溶液，以达到实验期望的浓度。将溶液分配至活细胞上。dmso的最大浓度为0.15％。
[0049]
细胞感染：在添加不同浓度的氯福克酚或对照溶剂之后，使得细胞被感染。感染复数为0.01。
[0050]
试剂：赫斯特染料33342、三盐酸盐、三水合物(参考号h3570，thermofischer)和碘化丙锭(参考号p1304mp，thermofisher)分别以10μg/ml和1μg/ml的浓度分别用于监测氯福克酚的病毒细胞病变效应(cpe)。在72小时的孵育时间后，添加这些试剂。
[0051]
通过分析pi阳性细胞核的百分比、替代病毒对细胞施加的毒性、以及细胞核的数量对应于病毒施加的细胞生长抑制，获得结果。
[0052]
病毒基因组复制的测量
[0053]
细胞培养：在37℃在5％co2的湿润气氛中，将vero81细胞和转导有tmprss2的vero-81细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)和glutamax
tm
的杜尔贝科氏改良的伊格尔介质(dmem)中培养。
[0054]
测试的化合物：在dmso中以所需的浓度制备氯福克酚溶液，以达到实验期望的浓度。将溶液分配至活细胞上。dmso的最大浓度为0.15％。
[0055]
细胞感染：在添加不同浓度的氯福克酚或对照溶剂之后，使得细胞被感染。感染复数为0.25。
[0056]
通过对与总细胞rna相关的病毒rna(病毒载量的替代)进行计量(dosing)，获得结果。
[0057]
rna计量(dosing)：孵育6小时后，按照制造商的建议使用nucleospin rna试剂盒(macherey-nagel)提取总细胞rna，并通过定量rt-pcr测量sars-cov-2基因组。使用高容量
cdna逆转录试剂盒(applied biosystems)对rna进行逆转录。然后使用在quantstudio3中taqman通用pcr反应混合物(applied biosystems)进行实时pcr。使用针对e基因的开放阅读框的引物和探针(who操作方案)。通过使用体外转录rna对应扩增子创建标准曲线。
[0058]
体外病毒载量的测定
[0059]
以0.25的moi感染vero-81和vero-81-tmprss2细胞1小时，然后用pbs冲洗细胞3次，并在浓度递增的氯福克酚存在下进一步孵育16小时。对于每个条件，以一式两份进行。收集细胞上清液，通过tcid
50
方法测量病毒滴度。
[0060]
在小鼠肺部中病毒载量的测定
[0061]
为了确定肺部的病毒载量，使用mixer mill mm 400(retsch)(15分钟
–
15hz)在含有1ml的pbs的lysing matrix d管(mpbio)中对一半的右肺叶进行均质化。以11,000rpm离心5分钟后，收集澄清的上清液用于病毒滴定。在含有1％青霉素/链霉素的dmem中稀释上清液，将稀释液转移至96孔板中的vero-e6细胞中，用于tcid
50
测定。
[0062]
通过rtqpcr评估基因的表达
[0063]
使用nucleospin rna试剂盒中的1ml ra1缓冲液(含有20mm的tcep)，将右肺叶的一半均质化。使用来自macherey nagel的nucleospin rna提取组织匀浆中的总rna。用60μl的水将rna洗脱。
[0064]
使用高容量cdna archive试剂盒(life technologies,usa)逆转录rna。使用基于sybr green的实时pcr和quantstudio
tm
12k flex的实时pcr系统(applied biosystems
tm
，美国)，按照制造商的操作建议扩增所得cdna。使用编码甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)的基因进行相对定量。使用primer express软件(applied biosystems，villebon-sur-yvette，法国)设计特异性引物，订购自eurofins scientifics(ebersberg，德国)。通过比较(a)目的基因和管家基因(δct)的pcr循环阈值(ct)、以及(b)处理组和对照组的δct值(δδct)以确定相对mrna水平(2
δδct
)。数据针对gapdh基因的表达进行归一化，并表示为相对于在空白对照处理的小鼠中的平均基因表达水平的增加倍数。病毒载量表达为相对gapdh表达水平(δct)归一化的病毒rna。
[0065]
实施例1
[0066]
通过加入一定浓度范围的氯福克酚，之后进行1：3的稀释，然后使用hsars-cov2以moi 0.01(感染复数(moi)0.01意味着使用的病毒量为每1个细胞0.01个病毒)感染达72小时，以评估氯福克酚对被hsars-cov2感染的vero81细胞的效果。进行有两次技术重复的生物重复。
[0067]
结果是通过分析pi阳性细胞核的百分比获得，表示为相对于阳性(0％感染细胞)和阴性(100％感染细胞)对照限定的量度(scale)的cpe百分比。从图1中可以看出，氯福克酚将cpe减低95％(ic
95
)时的浓度为9.2μm。
[0068]
实施例2
[0069]
通过加入一定浓度范围的氯福克酚，之后进行1：3的稀释，然后使用hsars-cov2以moi 0.01感染72小时，以评估氯福克酚对被hsars-cov2感染的vero81细胞的效果。一式两份或以一式三份技术重复进行生物实验。
[0070]
通过分析活细胞的数量获得结果，该活细胞的数量表示为，相对于由正常细胞生长(未感染的对照)和无细胞生长(感染的对照)所限定的量度，细胞生长提高的百分比。从
图2中可以看出，观察到在氯福克酚的最大反应的95％(ec
95
)时，氯福克酚的浓度估计为21μm。
[0071]
实施例3
[0072]
通过加入一定浓度范围的氯福克酚，之后进行1：3的稀释，然后使用hsars-cov2以moi 0.01感染72小时，以评估氯福克酚对hsars-cov2感染的tmprss2转导的vero81细胞的效果。一式三份进行生物实验。
[0073]
结果是通过分析pi阳性细胞核的百分比获得，表示为相对于阳性(0％感染细胞)和阴性(100％感染细胞)对照所限定的量度，cpe的百分比。从图3可以看出，氯福克酚的ic
95
为8.7μm。
[0074]
实施例4
[0075]
通过加入一定浓度范围的氯福克酚，之后进行1：3的稀释，然后使用hsars-cov2以moi 0.01感染72小时，以评估氯福克酚对被hsars-cov2感染的tmprss2转导的vero81细胞的效果。一式三份进行生物实验。
[0076]
通过分析活细胞的数量获得结果，该活细胞的数量表示为相对于由正常细胞生长(未感染的对照)和无细胞生长(感染的对照)所限定的量度，细胞生长提高的百分比。从图4中可以看出，氯福克酚的估计ec
95
为25μm。
[0077]
实施例5
[0078]
通过加入一定浓度范围的氯福克酚，之后进行1：2,5的稀释，然后使用hsars-cov2以moi 0.25感染6小时，以评估氯福克酚对被hsars-cov2感染的vero81和tmprss2转导的vero81细胞的效果。一式两份进行生物实验。
[0079]
通过对病毒rna进行计量(dosing)获得结果，病毒载量表示为病毒rna与样本总rna(rnat)的比率。从图5可以看出，氯福克酚的ic
95
为11μm。
[0080]
实施例1至5中的结果表明，氯福克酚的ic
95
在约9μm至约11μm之间，即，与接受肺部切除手术或接受全肺切除术(pneumonectomy)的患者人肺组织中(其中，在手术前或在手术期间施用氯福克酚)报道的氯福克酚cmax(约250μm)相比，该值低约25倍(journal of antimicrobial chemotherapy 1987；19:679-683)。同样，氯福克酚的ec
95
从约21μm至约25μm，即，该值比在人肺组织中报告的cmax(见上文)低约10倍。
[0081]
实施例6
[0082]
在增加浓度的氯福克酚存在下，以0.25的moi感染vero-81和vero-81-tmprss2细胞6小时。然后，提取总rna，通过rt-qpcr对病毒rna进行定量。结果通过总rna的量进行归一化，表示为以一式两份进行的三个独立实验的平均值。结果显示在图6中，从中可以看出氯福克酚抑制sars-cov-2的基因组复制。
[0083]
实施例7
[0084]
使用sars-cov-2以0.25的moi感染vero-81和vero-81-tmprss2细胞。1小时后，除去接种物，用pbs洗涤细胞，然后用氯福克酚处理。然后，将细胞进一步孵育16小时。此后，收集上清液，并对分泌的传染性病毒的量进行定量。虚线表示检测限(1.5tcid
50
/ml)。这些数据表示三个独立实验的平均值(n＝3)。对于每种条件，以一式两份进行实验。结果如图7所示，从中可以看出，随着氯福克酚浓度增加，sars-cov-2载量降低。
[0085]
实施例8
[0086]
在增加浓度的氯福克酚存在下，以0.25的moi感染calu-3细胞24小时。然后，提取总细胞的rna，通过rt-qpcr对病毒rna进行定量。结果显示在图8中，从中可以看出，氯福克酚抑制sars-cov-2在calu-3细胞中的复制。
[0087]
实施例6至8中的结果表明，氯福克酚显示出针对sars-cov2的抗病毒活性。
[0088]
实施例9
[0089]
氯福克酚稀释在氯化钠溶液中(1.75％终浓度的rh40(07076，sigma)和1.4％终浓度的乙醇)，用于腹膜内注射。对8至10周龄的雌性c57bl/6j小鼠用单剂量的氯福克酚(62.5mg/kg)进行i.p.处理，在之后在不同的时间点处死(图9，左图)。在单独的实验中，小鼠每天两次使用氯福克酚的剂量(62.5mg/kg)通过i.p.处理，持续两天，最后一次注射后1小时，处死小鼠(图9，右图)。处理小鼠的血浆和肺中氯福克酚的浓度通过如下测量：收集血浆样本和肺组织，用无水乙醇处理，比率分别为1比10和1比50。肺组织用机械裂解系统(tissue lyzer ii)进行匀浆。在注入lc-ms/ms之前，通过离心获得上清液。使用uplc系统acquity i class(waters)结合三重四极质谱仪xevo tqd(waters)分析样本。置于40℃的柱子是acquity beh c8 50*2.1mm，1.7μm柱(waters)，使用以下流动相：5mm甲酸铵的水溶液(ph 3.75)作为溶剂(a)和5mm甲酸铵的乙腈溶液(ph3.75)作为溶剂(b)。图9所示的结果表示以一式三份(肺)或一式两份(血浆)进行的三个独立实验的平均值。可以看出，氯福克酚以非常显著的水平分布在肺中。
[0090]
实施例10
[0091]
八周龄的雌性k18-表达人ace2的c57bl/6小鼠(b6.cg-tg(k18-hace2)2prlmn/j)购自jackson laboratory。为了感染，小鼠通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)进行麻醉，然后用50μl的dmem进行鼻内感染，所述dmem含有5
×
102tcid
50
的sars-cov-2的hcov-19_ipl_法国株(ncbi mw575140)(或者在对照样本中不含)。所有实验均符合现行的国家和机构法规以及道德准则。这些操作方案得到了机构伦理委员会“comit
é
d'ethique en experimentation animale”(ceea)75，北加莱海峡(法国)的批准。
[0092]
在使用sars-cov-2通过i.n.接种(每只小鼠5
×
102tcid
50
)后的1小时和8小时、以及在感染后1天(一天两次)，使用氯福克酚(62.5mg/kg)或载剂i.p.处理小鼠(图10，左图)。在感染后的第2天和第4天处死动物。通过滴定vero-81细胞(图10，中图)和通过rt-qpcr(图10，右图)(感染后第2天)确定病毒载量。
[0093]
可以看出，氯福克酚处理显著减少小鼠中的sars-cov-2感染。
[0094]
实施例11
[0095]
使用含有d614g突变的sars-cov-2谱系b1(sars-cov-2/人/fra/lille_vero-tmprss2/2020)或sars-cov-2的谱系b1.1.7(gisaid登录号epi_isl_1653931)感染vero-81细胞。病毒基因组通过rt-qpcr进行定量。结果通过总rna的量进行归一化，表示为以一式两份进行的三个独立实验的平均值。从图11可以看出，氯福克酚抑制sars-cov-2变种的基因组复制。
[0096]
实施例12
[0097]
在不同浓度的氯福克酚存在下，使用hcov-229e-rluc感染huh-7细胞。感染后7小时，裂解细胞并定量荧光素酶的活性。结果显示在图12中，表示为对照的百分比，代表一式三份进行的三个独立实验的平均值。误差条代表平均值的标准误差(error)(sem)。从图12
可以看出，氯福克酚对与sars-cov2不同的冠状病毒hcov-229e具有活性。
[0098]
以上实施例1至12中的数据证明，氯福克酚在预防或治疗由冠状病毒(如covid-19)引起的疾病中的价值。
[0099]
实施例13
[0100]
在含有10％胎牛血清的dmem介质中，用hsars-cov-2以0.25的moi感染vero81细胞和tmprss2转导的vero-81细胞。1小时后，除去接种物，用pbs洗涤细胞，然后用不同浓度的氯福克酚处理。然后，将细胞在5％co2的湿润气氛中在37℃孵育16小时。此后，收集上清液，通过tcid
50
评估其中分泌的病毒量，表示为log10 tcid
50
/ml。图13中报告的数据表示两种不同经历(experience)(n＝2)的平均值。对于每个条件，以一式两份进行。图中虚线表示该方法的检测限为1.5tcid
50
/ml。
[0101]
从图13可以看出，氯福克酚抑制受感染的细胞分泌hsars-cov-2。
[0102]
实施例14
[0103]
在不同浓度的氯福克酚存在下，在含有10％胎牛血清的dmem介质中使用hsars-cov-2以0.25的moi感染vero81细胞和tmprss2转导的vero-81细胞。6小时后，去除接种物并裂解细胞，以允许使用nucleospin rna试剂盒(macherey-nagel)按照制造商的说明提取总rna。通过定量rt-pcr，使用针对e基因的开放阅读框的引物和探针(who操作方案)测量sars-cov-2基因组。结果通过每个样本的rna总量进行归一化，表示为未处理对照的百分比，如图14所示。实验进行了两次(n＝2)。在每个实验中，对于每个条件以一式两份进行。
[0104]
从图14可以看出，氯福克酚抑制hsars-cov2在受感染的细胞中的复制。
[0105]
实施例15
[0106]
人支气管上皮细胞(mucilair
tm
，可从epithelix公司获得)通过氯福克酚的顶极施用进行处理。首先用含有不同浓度的氯福克酚的培养介质洗涤上皮细胞，然后使用hsars-cov-2以moi 0.2感染上皮细胞1小时(仍然存在氯福克酚)。然后，去除接种物并用pbs洗涤上皮细胞，之后在顶极加入25μl的含有不同浓度氯福克酚的培养介质。在37℃孵育72小时后，在上皮细胞的顶极加入200μl的mucilair
tm
培养介质，在孵育5分钟后收获。这些上清液用于定量分泌的病毒的量，如tcid
50
评估。结果显示在图15中，其中虚线表示瑞德西韦(remdisivir)的检测限。此外，在通过rt-qpcr进行基因组定量之前，使用nucleospin rna试剂盒(macherey-nagel)提取总rna。由于可用的总rna量很少，结果无法归一，如图16所示。图15和图16中的数据代表一式三份技术重复的平均值和标准偏差(deviation)(n＝3)。
[0107]
从图15和图16中可以看出，30μm的氯福克酚使得在体外的人支气管上皮细胞的粘液中测量的病毒滴度减少超过100倍。这得到病毒rna定量降低的证实。