用于幽门螺杆菌核酸提取的胃液样本前处理试剂及处理方法与流程

1.本发明涉及医学检验领域，特别是涉及用于检测幽门螺杆菌核酸检测的胃液样本的处理液，以及使用该处理液的方法。


背景技术：

2.幽门螺杆菌检测有以下几种方法：1.
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c/
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c尿素呼气试验，该方法便捷快速，准确性好，缺点是只能诊断是否感染了hp，不能检测耐药。
3.2.血清学检测方法。只能诊断既往是否感染，不能确定现在是否正在感染。
4.3.细菌分离培养，检测的金标准，缺点是技术要求高，劳动力密集，时效性不够，难以在实际中普及推广。
5.4.分子生物学检测方法，其优点是快速、准确，既能检测感染，也能判断耐药，检测样本可以是胃黏膜、胃液、粪便等。
6.胃液作为一种hp的检测标本，早在20多年前，我们国家就有相关的研究，作为一种无创的检测方法，其检测的价值非常值得肯定。（《胃液实时聚合酶链反应检测儿童幽门螺杆菌及宿主基因型的临床研究》、《pcr 检测慢性胃炎患儿胃液中幽门螺杆菌dna》）。然而，胃液的ph值在2.0左右，属于强酸性，其成分也较为复杂，包括胃酸、胃蛋白酶和其他消化酶，对后面的分子生物学相关检测影响巨大，因此样本前处理的方法是关键因素，对后续检测的准确性起到至关重要的作用。由于胃液的低ph，以及其成分的复杂性，所以需要针对性的样本处理方法，目前国内外还缺乏相关的研究。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题为：提供一种用于幽门螺杆菌核酸提取的胃液样本前处理试剂和方法。
8.本发明的技术方案为：用于幽门螺杆菌核酸提取的胃液样本前处理试剂，所述胃液样本前处理试剂组成为：5.0～15.0mm的三羟甲基氨基甲烷（tris），0.5～1.5mm的乙二胺四乙酸二钠（edta-na2），0.5%～3.0%（m/v）的二硫苏糖醇（dtt），0.5%～3.0%（m/v）的胰蛋白酶（parenzyme），ph为8.0。
9.进一步地，所述胃液样本前处理试剂组成为：10.0mm的三羟甲基氨基甲烷（tris），1.0mm的乙二胺四乙酸二钠（edta-na2），1.0%（m/v）的二硫苏糖醇（dtt），1.0%（m/v）的胰蛋白酶（parenzyme），ph为8.0。
10.三羟甲基氨基甲烷可以增加细胞的通透性，并提供缓冲作用；乙二胺四乙酸二钠能够螯合金属离子，使dna酶等失活；二硫苏糖醇具有还原性，能够裂解胃蛋白酶和消化酶，但其气味、刺激性和毒性都低于巯基乙醇；胰蛋白酶可以将蛋白质降解为肽，进一步降解为氨基酸。因为胃液的ph非常低，本发明中胃液处理液在配制过程中，使用氢氧化钠溶液将ph值调整为8.0，使其偏碱性，在实际使用中能够起到提升胃液ph值的作用，降低对后续核酸
提取的影响。
11.利用上述所述的胃液样本前处理试剂处理胃液样本的方法，包括如下步骤：（1）以体积计，取1份胃液样本，加入4份胃液样本前处理试剂，振荡混匀，室温下静置；（2）将步骤（1）静置后的混合液体离心，弃去上清；（3）在步骤（2）处理后的沉淀物中加入无菌生理盐水，振荡混匀，然后离心，弃去上清；（4）重复步骤（3）一次，最后得到的沉淀物用于下游核酸提取。
12.进一步地，步骤（1）中，静置的时间为5min。
13.进一步地，步骤（2）和步骤（3）中，离心条件为13200rpm离心5min。
14.采用本发明所建立的胃液样本前处理方法，能够很好的中和样本的强酸性，消化粘液物质和蛋白，经过后续核酸提取后，有助于提高胃液标本中幽门螺杆菌核酸检测的准确性。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明方法处理后的胃液标本，核酸浓度和纯度都高于生理盐水处理方法，后续扩增ct值更低。
附图说明
16.图1是实施实例1提取后幽门螺杆菌核酸的扩增结果。
具体实施方式
17.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
18.本发明中所用试剂名称解释如下：tris：三羟甲基氨基甲烷edta-na2：乙二胺四乙酸二钠dtt：二硫苏糖醇parenzyme：胰蛋白酶（parenzyme）胃液样本前处理试剂，包括三羟甲基氨基甲烷（tris）、乙二胺四乙酸二钠（edta-na2） 、二硫苏糖醇（dtt） 和胰蛋白酶（parenzyme），ph为8.0。
19.其中，所述三羟甲基氨基甲烷（tris）含量为5.0～15.0mm，优选地为10.0mm；所述edta-na2含量为0.5～1.5mm，优选地为1.0mm；所述二硫苏糖醇（dtt）含量为0.5%～3.0%（m/v），优选地为1.0%；所述胰蛋白酶（parenzyme）（胰蛋白酶（parenzyme）（parenzyme））含量为0.5%～3.0%（m/v），优选地为1.0%。
20.实施例1 胃液样本处理方法对比取10个胃液样本，每个样本取等体积两份，一份使用普通生理盐水处理法，一份使用本发明中的方法进行处理，最后采用qiaamp dna mini kit（51306）试剂盒进行核酸提取，进行核酸浓度和纯度测试对比。同时对所提取到的核酸进行幽门螺杆菌基因扩增检测，对比检测结果。
21.1. 生理盐水胃液处理方法：（1）取400μl胃液，置于2.0ml离心管中，加入1.6ml无菌生理盐水，振荡混匀，室温下静置5min。
22.（2）将上一步混合液体13200rpm 离心5min，弃去上清。
23.（3）在沉淀物中加入1ml无菌生理盐水，振荡混匀，然后13200rpm 离心5min，弃去上清。
24.（4）重复以上步骤一次，最后得到的沉淀物用于下游核酸提取。
25.2. 本发明胃液处理方法：（1）取400μl胃液，置于2.0ml离心管中，加入1.6ml本发明处理液（10.0mm 三羟甲基氨基甲烷（tris） 1.0mm乙二胺四乙酸二钠（edta-na2） 1.0% （m/v）二硫苏糖醇（dtt） 1.0%（m/v）胰蛋白酶（parenzyme），ph为8.0，振荡混匀，室温下静置5min。
26.（2）将上一步混合液体13200rpm 离心5min，弃去上清。
27.（3）在沉淀物中加入1ml无菌生理盐水，振荡混匀，然后13200rpm 离心5min，弃去上清。
28.（4）重复步骤（3）一次，最后得到的沉淀物用于下游核酸提取。
29.表1 两种方法核酸浓度测试对比
30.根据两种提取方法的对比结果，本发明方法处理后的胃液标本，核酸浓度和纯度都高于生理盐水处理方法。
31.根据幽门螺杆菌特异基因荧光pcr扩增结果，同一样本中，本发明的扩增效果要优于生理盐水处理方法，其扩增ct值更小。
32.实施例2 不同浓度配方胃液核酸提取效果对比取10个胃液样本，分别使用不同浓度的胃液处理液进行前处理后（方法同实施例1），进行核酸浓度、纯度测试，并进行幽门螺杆菌核酸扩增检测，对比扩增ct值。
33.配方1：5.0mm 三羟甲基氨基甲烷（tris） 0.5mm乙二胺四乙酸二钠（edta-na2） 0.5% 二硫苏糖醇（dtt） 0.5%胰蛋白酶（parenzyme），ph为8.0；配方2：10.0mm 三羟甲基氨基甲烷（tris） 1.0mm乙二胺四乙酸二钠（edta-na2） 1.0% 二硫苏糖醇（dtt） 1.0%胰蛋白酶（parenzyme），ph为8.0；配方3：15.0mm 三羟甲基氨基甲烷（tris） 1.5mm乙二胺四乙酸二钠（edta-na2） 3.0% 二硫苏糖醇（dtt） 3.0%胰蛋白酶（parenzyme），ph为8.0；表2不同浓度配方胃液核酸提取效果对比
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对比数据显示，3种配方处理方法均可很好的提取到胃液中的幽门螺杆菌核酸，配方2核酸提取浓度和纯度更高，荧光pcr检测ct值更小。
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实施例3本发明方法和生理盐水处理后胃液中hp克拉霉素耐药突变基因检测选择30例
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c尿素呼气试验阳性的感染者来源的胃液，分别使用生理盐水和本发明中的方法进行前处理，采用qiaampdnaminikit（51306）试剂盒进行核酸提取，检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药相关基因23srrna的突变情况，对比两种方法处理后胃液中hp克拉霉素的耐药率的阳性率。
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表3本发明方法与生理盐水方法处理后胃液中hp克拉霉素耐药检测对比
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结果显示本发明方法与生理盐水前处理后，胃液hp克拉霉素耐药率粪便为36.67%和30.00%，生理盐水处理后有3个样本出现敏感和耐药无法区分的情况，说明本方面方法前处理后的hp克拉霉素检测效果更准确。