一种银耳多糖及其应用

1.本发明属于多糖技术领域，具体涉及一种银耳多糖及其应用。


背景技术：

2.近年来，人民的生活水平不断提高，人们对美好生活有了更高的要求，女性对皮肤保养也越发注重，在市场需求的推动下，护肤品行业愈发聚焦于抗衰老、美白等功效。据研究表明多糖因具有良好的抗氧化、美白、吸湿、保湿等生物活性，常作为具有护肤功效物质而被添加在护肤品中。
3.银耳多糖是一种具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血压、降血脂、增强免疫等功能，且较为安全的天然活性成分。银耳多糖可广泛用于医疗、保健、食品加工、护肤美容、畜牧养殖等多方面领域。而且原材料来源广泛，可以为银耳多糖带来更大的应用空间，对进一步研究银耳多糖的理化性质和生物活性具有重要意义。随着多糖生物活性的开发，越来越多的研究致力于多糖对皮肤保湿、抗老化或美白作用。但关于银耳多糖的研究，大多数研究停留在多糖提取工艺优化、结构表征、抗氧化、抗癌、降血脂、降血糖以及增强机体免疫活性等方面，对于银耳多糖的护肤活性研究较少或不够深入。
4.申请号为cn201410475033.1的中国专利公开了一种银耳功能性多糖的制备方法及其应用，其以市售银耳为原料，所述制备方法包括步骤：混合、水提、碱提、透析、浓缩、沉淀、润洗和干燥，其最大程度地提高了银耳多糖的得率，而根据该方法制备而得的银耳多糖能够保持较高的抗氧化活性，可以应用于抗氧化食品和药物中。该方法也仅仅提及了银耳多糖在抗氧化物食品和药物中的应用。还有申请号为cn201910829061.1的中国专利公开了一种银耳功能性成分的提取方法，采用乙醇水溶液对银耳进行浸提、离心、浓缩、干燥得到类黄酮化合物；离心后得到的银耳滤渣通过酶解、过滤，得到含有少量小分子多糖、蛋白质和聚乙酰氨基葡萄糖的混合液，以及破壁过的银耳渣。将银耳渣经缓冲水溶液重复浸提两次、过滤，滤液经复合酶作用，除去蛋白质，通过半透膜除去无机盐，超滤膜浓缩，料液分次醇沉，分别得到聚乙酰氨基葡萄糖和银耳多糖。文本中提及该工艺工艺简单，主要采用生物酶作用技术，工艺条件温和，分段提取得到类黄酮化合物、聚乙酰氨基葡萄糖、银耳多糖，所得银耳功能性成分种类多、应用范围广，充分有效地利用了银耳，有利于银耳这一资源的充分开发。其中提及的应用也是泛泛而谈，并未具体提及具体应用以及效果如何。
5.因此，研究开发银耳多糖的更多特性，拓宽银耳多糖的应用领域，为银耳资源的开发利用程度提供帮助非常有必要。


技术实现要素：

6.本发明旨在解决上述技术问题，提供一种银耳多糖，其在制备护肤品、抑制黑色素瘤生长药物中的应用，有较好的功效。
7.本发明的技术方案为：
8.一种银耳多糖，其结构式为：
[0009][0010]
本发明的银耳多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
(1)将干制的银耳子实体粉碎后过60目筛，得到银耳干粉；将银耳干粉与蒸馏水按料液比1∶60g/ml(m/v)的比例搅拌均匀，加热煮沸2h得到多糖粗提液；待粗提液冷却至室温后，以5000r/min的转速离心5min，取上清液旋转蒸发至原上清液体积的1/10；后于浓缩液中加入其体积4倍体积浓度为95％乙醇溶液，搅拌5min后于4℃静置12h，沉淀冻干后得到银耳粗多糖ctp(其提取率为14.27％，总糖含量为82.19％，蛋白质含量为3.36％)；
[0012]
(2)再将粗多糖ctp与蒸馏水按料液比1∶30g/ml(m/v)的比例复溶，并于复溶液中加入其重量10％的质量浓度为10％的tca(三氯乙酸法)溶液，调节ph值至2.5，最后将其置于4℃环境下，静置12h，使得蛋白质析出；然后，将溶液以5000r/min的转速离心10min，除去蛋白质沉淀，取上清液备用；往上清液中加入其1/4体积的ab-8大孔树脂，并置于50℃电磁搅拌器中，以1000r/min的速度搅拌2h进行脱色；脱色结束后进行抽滤，除去大孔树脂，上清液于8000-14000da的透析袋4℃透析3d，每隔6h换一次水；将透析后的上清液浓缩、醇沉、冻干后得到银耳精多糖rtp；
[0013]
(3)将精多糖多糖rtp配制成5mg/ml的多糖溶液，过0.45μm的水性滤膜后使用离子交换柱对其进行分离，填料为deae-52纤维素，填料要先用蒸馏水浸泡后进行酸洗，再进行碱洗后进行装柱，后用超纯水洗至中性；先用超纯水按洗脱流速平衡好填料与洗脱液的接触面；以超纯水以及0.1m、0.3m、0.5m的nacl溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速为1.5ml/min，每管10ml，使用自动部分收集器收集洗脱液，用苯酚-硫酸法测定洗脱液糖含量，绘制对应的洗脱曲线，合并同一洗脱峰下的各管洗脱液，用蒸馏水透析3d，浓缩、冻干后得到单一洗脱峰的多糖样品；
[0014]
(4)将deae-52纤维素柱层析分离得到的单一洗脱峰组分，以超纯水复溶为5mg/ml的多糖样液，并过0.45μm的水性滤膜；在490nm处用苯酚-硫酸法测量每根管的吸光度，并绘制了洗脱曲线，如图1所示，得到了一个唯一的洗脱峰，洗脱液浓度为0.5m nacl溶液，将该峰下收集的洗脱液合并，浓缩、透析、冷冻干燥后获得分离纯化的银耳多糖tp组分；将deae-52纤维素柱层析得到的单一洗脱峰银耳多糖tp组分继续以sephadex g-200凝胶过滤柱洗脱，用0.5m的nacl溶液以0.5ml/min的流速连续洗脱；收集每根管20min；同样，对单一洗脱峰组分进行合并收集洗脱液，透析、冻干后得到银耳均一多糖tp1组分(其分子量568385da，总糖含量为86.38％，糖醛酸含量为34.35％)。
[0015]
本发明还提供所述银耳多糖在制备护肤品中的应用，优选地，本发明所述银耳多糖在制备具有美白活性和/或抑制弹性蛋白酶活性功能护肤品中的应用。通过酪氨酸酶抑
制实验，银耳多糖展现出良好的酪氨酸酶抑制活性，表明银耳多糖是具有美白作用潜质的生物大分子原料。在弹性蛋白酶抑制实验中，银耳多糖也展现出了较强的抑制能力。
[0016]
本发明还提供所述银耳多糖在制备抑制黑色素瘤细胞生成和/或生长药物中的应用，所述黑色素瘤的细胞包括黑色素瘤细胞b16-f10，本发明所述银耳多糖还提供在制备抑制黑色素瘤细胞内黑色素的生成药物中的应用，本发明还提供所述银耳多糖在制备抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性药物中的应用。通过试验，在探究银耳多糖对黑色素瘤细胞的影响中，申请人发现，银耳多糖不会对b16-f10细胞的生长形态产生影响，且对b16-f10细胞的增殖具有显著效果，进一步的实验同样表明，银耳多糖对b16-f10细胞内黑色素的生成具有抑制作用，对b16-f10细胞内的酪氨酸酶活性具有明显抑制效果。
[0017]
由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：
[0018]
本发明的银耳多糖可以用来制备护肤品，具有美白等良好功效，还能够抑制黑色素瘤生长，抑制黑色素瘤内黑色素的生成，可以用来制备抑制黑色素瘤生长药物，有利于银耳多糖在护肤领域产品的开发，拓宽银耳多糖的应用领域，为银耳资源的开发利用程度提供帮助。
附图说明
[0019]
图1为本发明实施例1中deae-52纤维素柱层析分离得到的单一洗脱峰组分的洗脱曲线。
[0020]
图2为本发明本发明银耳均一多糖tp1高效凝胶渗透色谱。
[0021]
图3为本发明银耳均一多糖tp1傅里叶红外光谱图。
[0022]
图4为本发明银耳均一多糖tp1原子力显微图。
[0023]
图5为本发明银耳均一多糖tp1与i
2-ki反应物的紫外可见光谱图。
[0024]
图6为本发明银耳均一多糖tp1与刚果红反应曲线图。
[0025]
图7本发明银耳均一多糖tp1 gc-ms色谱图。
[0026]
图8本发明银耳均一多糖tp1的1hnmr谱图。
[0027]
图9本发明银耳均一多糖tp1的
13
c nmr谱图。
[0028]
图10本发明银耳均一多糖tp1的hsqc谱图。
[0029]
图11本发明银耳均一多糖tp1的hsqc谱图局部放大图。
[0030]
图12为本发明b16-f10细胞的电子显微镜4x照片，放大100倍，其中a为不添加tp的dmem高糖培养基组作为对照；b为添加10mg/ml tp1的dmem高糖培养基组；c为添加10mg/mlrtp的dmem高糖培养基组；d为添加10mg/ml ctp的dmem高糖培养基组，其它培养条件均相同。
[0031]
图13为本发明tp1对b16-f10细胞的增殖抑制活性。
[0032]
图14为本发明tp对b16-f10细胞内酪氨酸酶抑制活性
具体实施方式
[0033]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
[0034]
实施例1：银耳多糖的制备
[0035]
(1)将干制的银耳子实体粉碎后过60目筛，得到银耳干粉；将银耳干粉与蒸馏水按料液比1∶60g/ml(m/v)的比例搅拌均匀，加热煮沸2h得到多糖粗提液；待粗提液冷却至室温后，以5000r/min的转速离心5min，取上清液旋转蒸发至原上清液体积的1/10；后于浓缩液中加入其体积4倍体积浓度为95％乙醇溶液，搅拌5min后于4℃静置12h，沉淀冻干后得到银耳粗多糖ctp(其提取率为14.27％，总糖含量为82.19％，蛋白质含量为3.36％)；
[0036]
(2)再将银耳粗多糖ctp与蒸馏水按料液比1∶30(m/v)的比例复溶，并于复溶液中加入质量10％的tca(三氯乙酸法)溶液，调节ph值至2.5，最后将其置于4℃环境下，静置12h，使得蛋白质析出；然后，将溶液以5000r/min的转速离心10min，除去蛋白质沉淀，取上清液备用；往上清液中加入其1/4体积的ab-8大孔树脂，并置于50℃电磁搅拌器中，以1000r/min的速度搅拌2h进行脱色；脱色结束后进行抽滤，除去大孔树脂，上清液于8000-14000da的透析袋4℃透析3d，每隔6h换一次水；将透析后的上清液浓缩、醇沉、冻干后得到银耳精多糖rtp；
[0037]
(3)将银耳精多糖rtp配制成5mg/ml的多糖溶液，过0.45μm的水性滤膜后使用离子交换柱对其进行分离，填料为deae-52纤维素，填料要先用蒸馏水浸泡后进行酸洗，再进行碱洗后进行装柱，后用超纯水洗至中性；先用超纯水按洗脱流速平衡好填料与洗脱液的接触面；以超纯水以及0.1m、0.3m、0.5m的nacl溶液作为流动相进行梯度洗脱，流速为1.5ml/min，每管10ml，使用自动部分收集器收集洗脱液，用苯酚-硫酸法测定洗脱液糖含量，绘制对应的洗脱曲线，合并同一洗脱峰下的各管洗脱液，用蒸馏水透析3d，浓缩、冻干后得到单一洗脱峰的多糖样品；
[0038]
(4)将deae-52纤维素柱层析分离得到的单一洗脱峰组分，以超纯水复溶为5mg/ml的多糖样液，并过0.45μm的水性滤膜；在490nm处用苯酚-硫酸法测量每根管的吸光度，并绘制了洗脱曲线，如图1所示，得到了一个唯一的洗脱峰，洗脱液浓度为0.5m nacl溶液，将该峰下收集的洗脱液合并，浓缩、透析、冷冻干燥后获得分离纯化的银耳多糖tp组分；将deae-52纤维素柱层析得到的单一洗脱峰银耳多糖tp组分继续以sephadex g-200凝胶过滤柱洗脱，用0.5m的nacl溶液以0.5ml/min的流速连续洗脱；收集每根管20min；同样，对单一洗脱峰组分进行合并收集洗脱液，透析、冻干后得到银耳均一多糖tp1(总糖含量为86.38％，糖醛酸含量为34.35％)，将tp1复溶后，配制成1mg/ml溶液，在200-400nm波长范围内通过紫外扫谱，发现无吸收峰，且使用考马斯亮蓝法和福林酚法也仍未测出蛋白含量，说明此时tp1已不含游离的蛋白质和核酸类物质，银耳均一多糖tp1基本成分如表1所示。
[0039]
表1银耳均一多糖tp1的基本成分
[0040]
总糖含量还原糖含量糖醛酸含量蛋白质含量水分含量86.38
±
0.06％nd34.35
±
2.70％nd7.09
±
0.28％
[0041]
实施例2：银耳均一多糖tp1的结构鉴定
[0042]
通过hpgpc测定实施例1的银耳均一多糖tp1分子量和纯度。精密称取实施例1的银耳多糖tp样品和标准品(不同相对分子质量的葡聚糖)，分别配制成5mg/ml质量浓度的溶液，并以12000r/min离心10min，取上清液并用0.22μm的水性滤膜过滤，然后将标准品和样品溶液转置于1.8ml棕色进样小瓶中备用。色谱柱为：brt105-104-102串联凝胶柱(8
×
300mm)；样品的进样量控制为20μl/次，以0.05m nacl溶液为流动性，0.6ml/min流速洗脱，色谱柱温度为40℃，并使用ri-10a示差检测器进行检测。银耳均一多糖tp1的分子质量测定结果如图2所示，仅有唯一的分子量峰，46.5min为流动相(0.05m nacl溶液)的峰，依据样品的相对保留时间计算得到银耳均一多糖tp1分子量为568385da。
[0043]
使用ic测定tp样品的单糖组成。精密称量5mg tp样品置于安瓿瓶中，加入3m的tfa 2ml，120℃条件下水解3h。将酸水解后的样品溶液转移至离心管中，用氮吹仪吹干，后加入5ml超纯水，涡旋混匀。接着，吸取50μl混匀后的样品溶液，加入950μl超纯水，以12000r/min转速离心5min。取上清液进ic分析。色谱条件为：dionex carbopactm pa20(3
×
150mm)色谱柱；流动相为a:h2o，b:15mmnaoh，c:15mm naoh和100mm过氧乙酸钠混合溶液；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。银耳均一多糖tp1的离子色谱分析如图3所示，根据峰面积计算出银耳均一多糖tp1各单糖的摩尔比为：甘露糖∶岩藻糖∶木糖∶葡萄糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖∶甘露糖醛酸＝0.367∶0.229∶0.217∶0.127∶0.046∶0.007∶0.007，其中，葡萄糖醛酸与甘露糖之比为0.125。
[0044]
使用傅里叶变换红外光谱对实施例1的银耳均一多糖tp1的官能团进行识别，银耳均一多糖tp1的红外光谱分析结果如图3所示。吸收带在3600-3200cm-1
是-oh的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。3390cm-1
是o-h的伸缩振动吸收峰，表明存在分子间和分子内氢键，是糖类的特征峰。在2929cm-1
处有一个吸收峰，可能归属于c-h伸缩振动。在1635cm-1
处有一个吸收峰，可能归属于结晶水。在1558cm-1
处、1540cm-1
处有吸收峰，可能归属于c＝o伸缩振动。在1455cm-1
处有吸收峰，可能归属于c-h变角振动。在1417cm-1
处、1243cm-1
处、1133cm-1
处、1066cm-1
处有吸收峰，可能归属于c-o伸缩振动。在1338cm-1
处有吸收峰，可能归属于c＝o对称伸缩振动。根据这几组特征峰，可以初步判断tp1是多糖类化合物。此外，在917cm-1
处有吸收峰，可能归属于吡喃环的非对称环伸缩振动。在894cm-1
处有吸收峰，可能归属于吡喃环的β-端基差向异构的c-h变角振动。综上，tp1可能是具有β-型糖苷键连接的多糖。
[0045]
应用原子力显微镜(atomic force microscope，afm)观察银耳均一多糖tp1的分子形态。将5μl 10μg/ml的tp样品溶液滴加到云母片表面上。使样品溶液自然风干12h后，后用原子力显微镜扫描云母片表面的样品。图像的分辨率为256
×
256像素。如图4所示，图4-a为5μm传感高度下tp1的原子力显微图，可以看出tp1分子呈光滑的圆形颗粒状。有部分不规则块状物，可能是因tp1含有糖醛酸带负电，云母片本身也带负电导致的分子聚集，或者是多糖分子存在太多支链所致由图4-b(1μm传感高度下)可看出tp1分子中有较多柔顺线条缠绕，似蛛网状，进一步证明tp1分子中存在较多支链。通过afm数据分析软件nanoscope8.0分析计算样品的直径大小和表面粗糙度。tp1直径大小为6.44～33.70nm，粗糙度为0.34nm～0.92nm。表明tp1是由多个更小分子聚集而成，且具有多支链的酸性大分子。
[0046]
对银耳均一多糖tp1进行碘-碘化钾反应分析。将银耳均一多糖tp1样品配制为1mg/ml质量浓度的溶液，后与碘试剂(含0.02％i2的0.2％ki溶液)混匀，于300-600nm波长范围内测定其吸收光谱。结果如图5所示，tp1与i
2-ki的反应物最大吸收峰在350.5nm，而565nm处并没有最大吸收，说明tp1可能存在较长的侧链和较多的分支。这与tp1单糖组成复杂、红外分析分子键较多、afm微观形态结构复杂相一致。另外，tp1与i
2-ki反应呈阴性，说明不含淀粉支链。
[0047]
通过刚果红实验对tp1的三股螺旋结构进行测定。将2ml质量浓度为2.5mg/ml的tp1溶液与2ml 80μmol/l浓度的刚果红试剂混合均匀，后向混合溶液中逐滴加入4mol/l的naoh溶液，依次让溶液中naoh浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/l，分别在400-600nm波长范围进行紫外扫描，测定样品在各碱性条件下的最大吸收波长。以等量蒸馏水代替tp溶液作为空白对照。如图6所示，随着naoh的浓度升高，刚果红与tp1形成的络合物的最大吸收波长相应增大，即最大吸收波长同刚果红相比发生相对位移。且刚果红与tp1形成的络合物颜色加深，变为紫红色。说明tp1具有三螺旋结构，是具有复杂结构的多糖。
[0048]
多糖样品甲基化等衍生后，gc-ms测其连接方式。准确称量tp样品2mg置于玻璃反应瓶中，后加入1ml无水二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)，接着快速加入甲基化试剂a(20mg naoh粉末)，封闭，在超声作用下溶解，再加入甲基化试剂b液(0.4ml ch3i)。在磁力搅拌水浴30℃反应60min反应。最后将2ml超纯水加入到上述混合物中终止甲基化反应。取甲基化后的多糖，加入1ml的2m tfa水解90min，后用旋转蒸发仪蒸干。残基加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8h，加入冰醋酸中和，旋蒸，101℃烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却。然后加入3ml甲苯，减压浓缩蒸干，重复4～5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3ml ch2cl2溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。ch2cl2层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10ml，放入液相小瓶。分析采用shimadzu gcms-qp 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；gc-ms条件：rxi-5sil ms色谱柱30mm
×
0.25mm
×
0.25μm；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1ml/min。tp1的糖苷键组成分析结果如图7所示。将tp1先甲基化后水解以形成糖醇乙酸酯衍生物，再通过gc-ms分析，根据保留时间和质谱中的特征碎片进行结构鉴定。tp1甲基化结果显示其存在3个主要残基，分别是(1
→
4,6)连接的α型甘露糖(22.6％)，(1
→
3)连接的α型岩藻糖(22.6％)和(1
→
4)连接的β型葡萄糖(21.6％)，其支链的糖残基主要含有(1
→
3)连接的β型木糖(6.4％)，(1
→
4)连接的甘露糖(1.5％)以及(1
→
)连接的半乳糖(1.3％)。结合单糖结果分析，得出tp1是以(1
→
4,6)连接的α型甘露糖为主链，(1
→
3)连接的α型岩藻糖，(1
→
4)连接的β型葡萄糖，(1
→
3)连接的β型木糖为主要支链，以及含有少量半乳糖、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸支链构成的酸性杂多糖。
[0049]
通过nmr进一步对tp的结构特性进行分析。称取tp样品50mg，将其溶于0.5ml的重水中并冷冻干燥。随后将冻干粉再次溶于0.5ml的重水中，并继续冷冻干燥，重复以上过程数次，直至充分交换活泼氢。最后将样品溶于0.5ml的重水中，置于以600mhz的核磁共振仪测定1hnmr谱、
13
c nmr谱、hh-cosy谱、hsqc谱、noesy谱。
[0050]
如图8所示，1h nmr谱信号主要集中在3.0-5.5ppm之间。δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ5.48、5.31、5.11、5.09、4.45、4.42、4.36的信号峰集中分布在4.3～5.5ppm区域内，岩藻糖的甲基质子峰δ1.15ppm。
[0051]
如图9所示，碳谱分析在
13
c nmr(201mhz,d2o)：核磁碳谱信号主要集中在60-120ppm之间。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰δ104.76、103.48、103.02、102.94、102.21、101.1、98.71ppm异头碳区域主要在δ93～105之间，而糖非异头碳主要信号峰分布在60～85ppm区域。岩藻糖的甲基碳信号峰在δ16.9ppm。
[0052]
对键合方式进行推导：
[0053]
以d糖苷键为例，通过hsqc图谱(如图9所示)，可以观察到d糖苷键的异头碳信号为δ98.71，hsqc图谱中对应的异头氢信号是δ5.48，通过hh-cosy，h1-2的信号为5.48/3.69；h2-3的信号为3.69/4.77；h3-4的信号为3.77/3.53；h4-5的信号为3.53/4.32；h5-6的信号为4.32/1.32；我们可以推断出h1，h2，h3，h4，h5，h6分别为δ5.48、3.69、3.77、3.53、4.32、1.15，对应的c1-6为98.71、78.15、70.01、73.7、67.54、16.9。结合单糖组分和甲基化分析结构，推断该糖苷键d的信号应归属于糖苷键
→
2)-α-l-fucp-(1
→
。
[0054]
根据类似规律并结合noesy谱(如图10)、hsqc图谱(如图9)、hsqc谱局部放大图(如图11)，对所有糖苷键信号进行归属(见表2)：
[0055]
表2银耳均一多糖tp1糖苷键信号进行归属表
[0056][0057][0058]
根据hsqc和noesy图谱对糖苷键的连接方式进行解析。主链分析：
[0059]
首先，在bc谱中，糖苷键a的异头氢与其自身的c3有相关信号峰；在noe中，糖苷键a的异头氢与其自身的h3有相关信号峰；表明存在3a1
→
3a1
→
的链接方式。
[0060]
再者，在bc谱中，糖苷键a的异头氢与糖苷键b的c3有相关信号峰；在noe中，糖苷键a的异头氢与糖苷键b的h3有相关信号峰；表明存在3a1
→
3b1
→
的链接方式。
[0061]
同时，在bc谱中，糖苷键b的异头氢与其自身的c3有相关信号峰；在noe中，糖苷键b的异头氢与其自身的h3有相关信号峰；表明存在3b1
→
3b1
→
的链接方式。
[0062]
最后，在bc谱中，糖苷键b的异头氢与糖苷键a的c3有相关信号峰；在noe中，糖苷键b的异头氢与糖苷键a的h3有相关信号峰；表明存在3b1
→
3a1
→
的链接方式。
[0063]
主链推断为：
→
3a1
→
3a1
→
3b1
→
3b1
→
[0064]
支链分析：
[0065]
在noe中，糖苷键c的异头氢与自身的h2有相关信号峰,表明存在2c1
→
2c1
→
的链
接方式；糖苷键c的异头氢与糖苷键b的h2有相关信号峰,表明存在2c1
→
2b1
→
的链接方式.
[0066]
再者，在noe中，糖苷键g的异头氢与糖苷键c的h2有相关信号峰,表明存在g1
→
2c1
→
的链接方式.
[0067]
同时发现，在noe中，糖苷键f的异头氢与糖苷键d的h4有相关信号峰,糖苷键d的异头氢与糖苷键e的h3有相关信号峰,糖苷键e的异头氢与糖苷键b的h2有相关信号峰,表明存在f1
→
4d1
→
3e1
→
2b1
→
的链接方式.
[0068]
综上所述，我们可以推断，该多糖的主要糖苷键结构方式为：
[0069][0070]
实施例3：银耳多糖对b16-f10细胞的影响
[0071]
1、试验方法：
[0072]
(1)细胞形态学观察：将细胞分散为1
×
105个细胞每孔，在6孔板中培养。然后将tp样品与培养基混合，以换液的形式对b16-f10细胞进行干预培养24h。所有细胞均在37℃，含5％的co2，加湿的培养箱中进行孵育。用倒置显微镜(xd-202，中国上海财空光学仪器有限公司)观察tp1在b16-f10细胞中诱导的形态学变化，并用scopeimage 9.0软件以100倍放大率拍摄。
[0073]
(2)细胞增殖抑制能力的测定：使用cck-8测定法测量样品对b16-f10细胞增殖的抑制活性即将细胞接种在96孔板中(每孔5
×
103个细胞)，并放置于37℃，含有5％的co2细胞培养箱中。培养24h后，加入10μl合适浓度的样品并继续培养24h，然后加入cck-8溶液(10μl)，将细胞再培养4h，最后在450nm处测量吸光度。使用曲酸作为阳性对照。细胞增殖抑制能力以ic
50
值(mg/ml)表示。
[0074]
(3)细胞内黑色素生成抑制能力的测定：将b16-f10细胞分散于6孔板中，以每孔2
×
104个细胞的密度培养。培养24h后，移除培养基。后加入含有α-msh(200nm)和不同浓度的tp的培养基，孵育72小时。孵育结束后，用冰冷的pbs冲洗，后加入1ml 0.25％的胰蛋白酶进行消化。最后，将消化后的细胞转移到含有10％的二甲基亚砜的500μl氢氧化钠(1n)中浸泡，并置于80℃水浴锅保温1h，以促进黑色素溶解。最后，在450nm处记录溶液的吸光度(as)，以不含多糖样品培养的细胞为空白组(a0)，阳性对照为曲酸。并用公式(1-1)计算黑色素含量。
[0075][0076]
(4)细胞内酪氨酸酶活性抑制能力的测定：将b16-f10细胞置于96孔板中(100μl/孔)，调整密度为1
×
105个细胞/ml。后置于37℃培养箱中(含5％co2，适宜湿度)培养12h。培
养结束后，将细胞置于含200nmα-msh和不同浓度的tp的培养基中孵育72h。孵育结束后用pbs冲洗除去培养基，之后将细胞与1％triton x-100(90μl/孔)混合。将这些板置于-80℃冻结30min。解冻后，每孔加入10μl l-dopa(15mm)，继续放回培养箱孵育120min，最后于475nm处测定吸光度(as)，以不含多糖样品培养的细胞为空白组(a0)，阳性对照为曲酸。细胞内酪氨酸酶活性参照公式(1-1)进行计算。
[0077]
2、试验结果
[0078]
黑色素瘤是始于癌变的黑色素细胞或其前体的一类免疫原性较高、侵袭能力较强且十分常见的恶性肿瘤疾病，一旦发病即为恶性，普遍在皮肤黏膜和色素膜等处发病，经血液及淋巴管向机体各处迁移。受限于目前传统的放疗、化疗、生物和免疫治疗等医治技术手段，患者医治效果不佳，预后差，所以，探求高效低毒的新型药物来提升对黑色素瘤的疗效是当今研究的重点方向。
[0079]
由图12可看出tp对b16-f10细胞形态无明显影响。tp干预组(b，c和d)与对照组(a)的细胞，都有规律地均匀分布于视野，细胞大小类似、呈椭圆形或短小的梭型，细胞外周清晰、立体感强而发亮。
[0080]
由图13可知，随着tp浓度的升高，其对b16-f10细胞的增殖抑制能力增强。尤其是ctp展现出最强的抑制能力，其ic
50
值为0.17mg/ml。其次，rtp也展现出与ctp无差别(p》0.05)的抑制能力(ic
50
值＝0.19mg/ml)。此外，tp1也展现出较强的抑制能力(ic
50
值＝0.84mg/ml)，但远弱于(p《0.05)rtp和ctp的活性。虽然三种tp对b16-f10细胞的增殖抑制能力弱于阳性对照组曲酸(ic
50
值＝0.013mg/ml)，但其对b16-f10细胞的增殖具有明显的抑制作用。
[0081]
由图14可知，与细胞内黑色素生成抑制活性类似，tp对b16-f10细胞内酪氨酸酶抑制活性呈浓度梯度依赖增强。ctp仍表现出最强的抑制活性，其ic
50
值为1.51mg/ml。rtp活性略弱于ctp，其ic
50
值为3.77mg/ml。tp1活性较弱。同样的，三种tp的活性仍弱于阳性对照组曲酸(ic
50
值＝0.17mg/ml)。
[0082]
综上，本发明的银耳多糖对黑色素瘤细胞b16-f10的增殖、细胞内黑色素的生成、细胞内酪氨酸酶活性均有一定的抑制作用，说明银耳多糖可在制备抑制黑色素瘤生成和/或生长药物中的应用、其中黑色素瘤的细胞包括黑色素瘤细胞b16-f10，还可在制备抑制黑色素瘤细胞内黑色素的生成药物中的应用，还可在制备抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性药物中的应用。
[0083]
需要说明是，本发明提及的tp为银耳多糖。
[0084]
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。