2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1S,3R)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1H-异喹啉-2-基]乙酮的前药的制作方法

2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1s,3r)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基]乙酮的前药
发明领域
[0001]
本发明涉及2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1s,3r)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基]乙酮的前药。
[0002]
本发明还涉及用于制备这些前药的方法以及包括此类前药的药物组合物。
[0003]
发明背景
[0004]
作为wo2021/001288公布的国际专利申请n
°
pct/ep2020/068183公开了式(i)的2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1s,3r)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基]乙酮，
[0005][0006]
该化合物充当d1阳性别构调节剂并且因此作为用于治疗其中d1受体发挥作用的疾病的药剂具有益处。
[0007]
作为wo2021/001288公布的国际专利申请n
°
pct/ep2020/068183进一步公开了式(i)的化合物可以用于治疗和/或预防精神分裂症中的认知和阴性症状、与神经抑制剂疗法相关的认知损害、轻度认知损害(mci)、冲动、注意力缺陷多动障碍(adhd)、帕金森氏病和其他运动障碍、肌张力障碍、帕金森氏痴呆症、亨廷顿氏病、路易体痴呆症、阿尔茨海默氏病、药物成瘾、睡眠障碍、情感淡漠、创伤性脊髓损伤或神经性疼痛。
[0008]
因此，期望开发将适用于向患有上述疾病中的任一种的患者施用的式(i)的化合物的制剂。
[0009]
特别地，作为wo2021/001288公布的国际专利申请n
°
pct/ep2020/068183的实施例2.8.尤其公开了2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1s,3r)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基]乙酮的一水合物结晶形式。
[0010]
2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1s,3r)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基]乙酮的该一水合物结晶形式具有有限的溶解度，如果期望口服施用，这可能导致难以配制它和/或生物利用度低。
[0011]
因此，需要提高2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1s,3r)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基]乙酮的一水合物结晶形式的溶解度，以便将其掺入药物组合物中，特别是用于口服施用。
[0012]
发明概述
[0013]
本发明提供了2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1s,3r)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基]乙酮的前药，该前药由式(ii)或其药学上可接受的盐表示，
[0014][0015]
其中
[0016]
r1表示-p(＝o)(oh)2、-p(＝o)(om1)2、-p(＝o)(o-)2m2或-c(＝o)ra；
[0017]
ra表示被氨基取代的c
1-6
烷基；
[0018]
m1表示单价阳离子；和
[0019]
m2表示二价阳离子。
[0020]
因此，在另外的方面，本发明提供了药物组合物，其包含式(ii)的前药和药学上可接受的载体。
[0021]
作为wo2021/001288公布的国际专利申请n
°
pct/ep2020/068183公开了式(i)的化合物充当d1正向别构调节剂，并且因此作为用于治疗其中d1受体发挥作用的疾病的药剂具有益处。
[0022]
作为wo2021/001288公布的国际专利申请n
°
pct/ep2020/068183进一步公开了式(i)的化合物可以用于治疗和/或预防精神分裂症中的认知和阴性症状、与神经抑制剂疗法相关的认知损害、轻度认知损害(mci)、冲动、注意力缺陷多动障碍(adhd)、帕金森氏病和其他运动障碍、肌张力障碍、帕金森氏痴呆症、亨廷顿氏病、路易体痴呆症、阿尔茨海默氏病、药物成瘾、睡眠障碍、情感淡漠、创伤性脊髓损伤或神经性疼痛。
[0023]
因此，在另外的方面，本发明提供了式(ii)的前药、或其药物组合物，用于治疗和/或预防在精神分裂症中的认知和阴性症状、与神经抑制剂疗法相关的认知损害、轻度认知损害(mci)、冲动、注意力缺陷多动障碍(adhd)、帕金森氏病和其他运动障碍、肌张力障碍、帕金森氏痴呆症、亨廷顿氏病、路易体痴呆症、阿尔茨海默氏病、药物成瘾、睡眠障碍、情感淡漠、创伤性脊髓损伤或神经性疼痛。
附图说明
[0024]
图1表示三种不同动物的血浆中化合物(i)的浓度的曲线图，该曲线图以在施用如本文进一步描述的根据实施例7所制备的前药(ii-a)的混悬剂之后的时间为函数绘制。
[0025]
图2表示三种不同动物的血浆中化合物(i)和(ii-b)的各自浓度的曲线图，该曲线图以在施用如本文进一步描述的根据实施例7所制备的前药(ii-b)的混悬剂之后的时间为函数绘制。
[0026]
图3表示三种不同动物的血浆中化合物(i)的浓度的曲线图，该曲线图以在施用如本文进一步描述的根据实施例7所制备的前药(ii-c)的混悬剂之后的时间为函数绘制。
[0027]
发明详述
[0028]
如本文所使用的术语“前药”，当指式(i)的化合物的前药时，意指式(i)的化合物的官能衍生物，其在体内容易转化成所需的式(i)的化合物。根据本发明的式(i)的化合物的前药由如在此以上通常所定义的和如本文进一步描述的式(ii)的化合物表示。
[0029]
如本文所使用的术语“c
1-6
烷基”是指脂族烃基团，其可以是直链或支链的并且可以在链中包含1至6个碳原子。可以存在于本发明中使用的化合物上的合适的烷基包括直链和支链c
1-4
烷基。说明性c
1-6
烷基包括甲基、乙基、丙基和丁基。
[0030]
在根据本发明的第一实施方案中，r1表示-p(＝o)(oh)2。在根据本发明的第二实施方案中，r1表示-p(＝o)(om1)2。在根据本发明的第三实施方案中，r1表示-p(＝o)(o-)2m2。在根据本发明的第四实施方案中，r1表示c(＝o)ra。
[0031]
通常，m1表示碱金属阳离子。碱金属阳离子的合适实例是na

和k

。
[0032]
通常，m2表示碱土金属阳离子。碱土金属阳离子的合适的实例是ca

。
[0033]
通常，ra表示被氨基取代的c
1-6
烷基。在第一实施方案中，ra表示(氨基)丁基。在第二实施方案中，ra表示(氨基)戊基。
[0034]
根据本发明的式(ii)的化合物的说明性实例由式(ii-a)、(ii-b)和(ii-c)的化合物表示。
[0035][0036]
在第一实施方案中，本发明涉及式(ii-a)的前药。
[0037]
在第二实施方案中，本发明涉及式(ii-b)的前药。
[0038]
在第三实施方案中，本发明涉及式(ii-c)的前药。
[0039]
在第四实施方案中，本发明涉及式(ii-a)的化合物的盐。在该实施方案的一个方面，本发明涉及式(ii-a)的化合物的二钠盐，其对应于式(ii)的化合物，其中r1表示-p(＝o)(om1)2并且m1表示na

。
[0040]
在该实施方案的另一方面，本发明涉及式(ii-a)的化合物的钙盐，其对应于式(ii)的化合物，其中r1表示p(＝o)(o-)2m2并且m2表示ca

。
[0041]
根据本发明，由式(ii)表示的前药通常是比式(i)的化合物的一水合物的结晶形式(在本文中称为式(ia)的化合物)更可溶的。当需要制备药物组合物(特别是用于口服施用)时，此种提高的溶解度是特别有利的，因为可以获得更高的生物利用度。当需要固体制剂时，这也可以允许减少剂量并且因此减小有待使用的片剂尺寸。
[0042]
实施例的表1示出根据本发明实施例所获得的式(ii)的化合物与式(ia)的化合物之间的溶解度数据的比较，示出最小20倍的增加，无论使用何种介质。
[0043]
可以将根据本发明的前药另外地与药学上可接受的赋形剂诸如稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂或载体组合以形成合适的药物组合物。
[0044]
为了制备此种药物组合物，根据技术人员已知的常规药物配混技术将根据本发明的前药与药物稀释剂或载体紧密掺合。
[0045]
合适的稀释剂和载体可以采取多种形式，这取决于期望的施用途径，例如，口服、直肠、胃肠外或鼻内。
[0046]
适用于口服施用的药物组合物可以是固体或液体，并且可以呈例如片剂、丸剂、糖衣丸、明胶胶囊、溶液剂、糖浆剂、咀嚼胶等形式。
[0047]
为此，可以将活性成分与惰性稀释剂或无毒的药学上可接受的载体诸如淀粉或乳糖混合。任选地，这些药物组合物还可以含有粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶，崩解剂诸如交联羧甲基纤维素钠或交联聚维酮海藻酸，润滑剂诸如硬脂酸镁，助流剂诸如胶体二氧化硅，甜味剂诸如蔗糖或糖精，或着色剂或调味剂诸如薄荷或水杨酸甲酯，以及包衣剂诸如(i、ii、amb ii、qx或ez)。
[0048]
本发明还设想到了可以以可控的方式释放活性物质的组合物。可以用于胃肠外施用的药物组合物呈常规形式，诸如通常包含在安瓿、一次性注射器、玻璃或塑料小瓶或输注容器中的水性或油性溶液剂或混悬剂。
[0049]
除了前药之外，这些溶液剂或混悬剂还可以任选地含有无菌稀释剂诸如注射用水、生理盐水溶液、油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗菌剂诸如苄醇，抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂诸如乙二胺四乙酸，缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节摩尔渗透压浓度的药剂诸如氯化钠或右旋糖，以及稠化剂(viscosifying agent)诸如甲基纤维素、羟丙基纤维素(hpc-ssl)、羟丙甲纤维素(hpmc)并且最后是稳定剂诸如80、pvpva、pvp和pva。
[0050]
这些药物形式使用药剂师常规使用的方法制备。
[0051]
根据本发明的式(ii)的前药在药物组合物中的量可以落入宽的浓度范围内，并且取决于多种因素，诸如患者的性别、年龄、体重和医疗状况，以及施用方法。因此，用于口服施用的前药的量通常占相对于组合物的总重量约0.5重量％至约80重量％，合适地占相对于组合物的总重量约20重量％至约60重量％。
[0052]
作为wo2021/001288公布的国际专利申请n
°
pct/ep2020/068183描述了式(i)的化合物可以用于治疗其中d1受体发挥作用的疾病和/或障碍并且特别是精神分裂症中的认知和阴性症状、与神经抑制剂疗法相关的认知损害、轻度认知损害(mci)、冲动、注意力缺陷多动障碍(adhd)、帕金森氏病和其他运动障碍、肌张力障碍、帕金森氏痴呆症、亨廷顿氏病、路
易体痴呆症、阿尔茨海默氏病、药物成瘾、睡眠障碍、情感淡漠、创伤性脊髓损伤或神经性疼痛。
[0053]
因此，在另外的方面，本发明提供了如本文所描述的式(ii)的前药、或其药物组合物，用于治疗和/或预防在精神分裂症中的认知和阴性症状、与神经抑制剂疗法相关的认知损害、轻度认知损害(mci)、冲动、注意力缺陷多动障碍(adhd)、帕金森氏病和其他运动障碍、肌张力障碍、帕金森氏痴呆症、亨廷顿氏病、路易体痴呆症、阿尔茨海默氏病、药物成瘾、睡眠障碍、情感淡漠、创伤性脊髓损伤或神经性疼痛。
[0054]
在具体方面，本发明提供了根据本发明的式(ii)的前药、或其药物组合物，用于治疗帕金森氏病和其他运动障碍、阿尔茨海默氏病、或精神分裂症中的认知和阴性症状。
[0055]
式(i)的化合物可以通过涉及使式(a)的中间体与式(b)的中间体反应的方法制备，
[0056][0057]
可以使中间体(b)在(2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(hbtu)或本领域技术人员已知的另一种偶联剂的存在下，在合适的溶剂(例如二甲基甲酰胺)中用过量的碱(例如n,n-二异丙基乙胺)方便地与式(a)的中间体反应。
[0058]
式(b)的中间体可以通过涉及式(iv)的中间体的反应的方法制备，
[0059][0060]
其中
[0061]
z表示卤素或1-羟基-1-甲基乙基；
[0062]
ra表示叔丁基二甲基甲硅烷基；和
[0063]
rc表示氢或叔丁氧羰基。
[0064]
在第一步骤中，式(iv)的中间体，其中z表示溴，并且rc表示氢，本文之后称为中间体(iva)，可以根据本领域技术人员已知的方法用适当的保护基团保护以得到式(iv)的化合物，其中z表示溴并且rc表示叔丁氧羰基，本文之后称为中间体(ivb)。
[0065]
在第二步骤中，根据所附实施例中所描述的方法，可以例如在n-buli的存在下，在合适的溶剂例如四氢呋喃中，在低温下，在干燥丙酮的存在下，在连续流下进行金属-卤素交换反应，以得到如以上所描述的相应中间体(iv)，其中z表示1-羟基-1-甲基乙基，本文之后称为中间体(ivc)。
[0066]
然后可以首先根据本领域技术人员已知的方法或如所附实施例中进一步描述的
方法对叔丁氧羰基(boc)基团(rc)进行脱保护，随后对在boc基团脱保护期间所形成的三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基(ra)进行脱保护，以得到中间体(b)。
[0067]
式(iva)的中间体可以通过涉及式(v)的中间体的反应的方法制备，其中y是卤素，例如溴，并且ra如以上对于式(iv)的中间体所定义。
[0068][0069]
反应在甲基氯化镁的存在下，在合适的溶剂例如四氢呋喃中，在低温下方便地进行。
[0070]
中间体(v)可以通过涉及式(vi)的中间体的反应的两步法制备，
[0071][0072]
其中y如以上对于式(v)的中间体所定义，并且ra表示氢或叔丁基-二甲基甲硅烷基。
[0073]
在第一步骤中，使其中ra表示氢的中间体(vi)与叔丁基二甲基甲硅烷基氯在室温下在合适的碱例如4-二甲基氨基-吡啶的存在下反应，以得到其中ra表示叔丁基-二甲基甲硅烷基的中间体(vi)。
[0074]
在第二步骤中，使其中ra表示叔丁基-二甲基甲硅烷基的中间体(vi)与n-氯代琥珀酰亚胺(ncs)在合适的溶剂例如thf中反应，以得到中间体(v)。
[0075]
其中ra表示氢的中间体(vi)可以通过涉及式(vii)的中间体的方法制备，其中y如以上对于中间体(v)所定义。
[0076][0077]
反应在强碱例如氢氧化钠的存在下，在合适的溶剂例如乙醇和水的混合物中，在高温下方便地进行。
[0078]
式(vii)的中间体可以通过涉及中间体(viii)的反应的方法制备，
[0079][0080]
其中y如上文对于式(v)的中间体所定义。
[0081]
反应在三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯和多聚甲醛的存在下，在合适的溶剂例如二氯甲烷中方便地进行。
[0082]
中间体(viii)可以通过涉及可商购中间体(ix)的两步法制备，
[0083][0084]
其中y如以上对于中间体(v)所定义。
[0085]
反应根据所附实施例中所描述的方法或根据本领域技术人员已知的方法方便地进行。
[0086]
式(a)的中间体可以通过涉及式(x)的中间体的反应的多步骤方法制备，
[0087][0088]
其中
[0089]
r1表示氯、氨基、或硝基；和
[0090]
rb表示氢或叔丁基。
[0091]
在第一步骤中，将式(x)的中间体(其中r1表示硝基并且rb表示叔丁基，本文之后称为中间体(xa))还原成相应的中间体(x)(其中r1表示氨基并且rb表示叔丁基，本文之后称为中间体(xb))。反应在高压下，在合适的溶剂例如甲醇中通过pd/c催化的氢化方便地进行。
[0092]
通过添加浓盐酸和亚硝酸钠，随后进一步添加盐酸和氯化铜(ii)，将中间体(xb)转化成相应的中间体(x)，其中r1表示氯并且rb表示氢，本文之后称为中间体(xc)。反应在低温下方便地进行。
[0093]
然后，中间体(a)可以根据所附实施例中所描述的方法或根据本领域技术人员已知的方法，通过与n-氯代琥珀酰亚胺反应直接由中间体(xc)获得。
[0094]
式(xa)的中间体可以通过涉及式(xi)的中间体的方法制备，
[0095][0096]
其中r2表示氢或甲基。
[0097]
在第一步骤中，使式(xi)的可商购中间体(其中r2表示氢，本文之后称为中间体(xia))与碘甲烷在强碱例如氢氧化钾的存在下，在合适的溶剂例如二甲基甲酰胺中反应。然后使所得中间体(xi)(其中r2表示甲基，本文之后称为中间体(xib))与2-氯乙酸叔丁酯在叔丁醇钾的存在下，在合适的溶剂例如四氢呋喃中，在低温下反应，以得到中间体(xa)。
[0098]
式(ii)的前药可以通过式(i)的化合物的官能团转换获得。
[0099]
其中r1表示-p(＝o)(oh)2的式(ii)的化合物根据实施例3中进一步描述的程序或本领域技术人员已知的任何其他方法制备。
[0100]
其中r1表示-p(＝o)(om1)2或-p(＝o)(o-)2m2的式(ii)的化合物可以根据对本领域技术人员常规的方法由其中r1表示-p(＝o)(oh)2的式(ii)化合物通过与碱反应获得。
[0101]
式(ii)的化合物，其中r1表示c(＝o)ra；并且ra表示被氨基取代的c
1-6
烷基，典型地由式(i)的化合物以两步程序制备。
[0102]
(i)使式(i)的化合物与被氨基取代的c
1-6
烷基的相应羧酸反应，其中氨基受合适的保护基团保护。此种羧酸通常是可商购的。
[0103]
反应在室温下在合适的溶剂诸如二氯甲烷中方便地进行。
[0104]
(ii)根据本领域技术人员已知的常规方法，例如通过与酸反应，去除作为步骤(i)的结果所获得的化合物的氨基基团的保护基团。
[0105]
在由以上所描述的用于制备根据本发明的化合物的任何方法获得产物的混合物的情况下，可以通过常规方法诸如制备型hplc；或柱色谱法利用例如二氧化硅和/或氧化铝连同适当的溶剂体系，在适当阶段从中分离期望的产物。
[0106]
在上述用于制备根据本发明的化合物的方法产生立体异构体的混合物的情况下，可以通过常规技术分离这些异构体。特别地，在期望获得式(i)的化合物的特定对映异构体的情况下，这可以使用用于拆分对映异构体的任何合适的常规程序从相应的对映异构体混合物中产生。因此，例如，非对映异构体衍生物例如盐可以通过式(i)的对映异构体的混合物例如外消旋体和适当的手性化合物例如手性碱的反应产生。然后可以通过任何方便的手段，例如通过结晶，来分离非对映异构体，并且例如通过在其中非对映异构体是盐的情况下用酸处理来回收期望的对映异构体。在另一拆分方法中，可以使用手性hplc分离式(i)的外消旋体。此外，如果期望，则可以通过在以上所描述的方法之一中使用合适的手性中间体来获得特定的对映异构体。可替代地，特定的对映异构体可以通过进行对映异构体特异性酶促生物转化来获得，例如使用酯酶进行酯水解，并且然后仅将对映异构体纯的水解的酸从未反应的酯对映体中纯化出来。在期望获得本发明的特定几何异构体的情况下，色谱法、重结晶和其他常规分离程序也可以用于中间体或最终产物。可替代地，可以根据本领域技术人员已知的方法、或根据所附实施例中所描述的方法，在酸或碱的存在下，使非期望的对映
异构体被外消旋成期望的对映异构体。
[0107]
在任何以上合成顺序期间，可能需要和/或期望保护任何相关分子上的敏感性或反应性基团。这可以借助于常规保护基团来实现，诸如描述于protective groups in organic chemistry,ed.j.f.w.mcomie,plenum press,1973；和t.w.greene&p.g.m.wuts,protective groups in organic synthesis,john wiley&sons,第3版,1999中的那些。可以利用本领域中已知的方法在任何方便的后续阶段去除保护基团。
实施例
[0108]
缩写/经常出现的试剂
[0109]
ac：乙酰基
[0110]
acn：乙腈
[0111]
盐水：饱和氯化钠水溶液
[0112]
nbu：正丁基
[0113]
tbu：叔丁基
[0114]
cv：柱体积
[0115]
dcc：二环己基碳二亚胺
[0116]
dcm：二氯甲烷
[0117]
dmap：4-二甲基氨基吡啶
[0118]
dmf：n,n-二甲基甲酰胺
[0119]
dmso：二甲基亚砜
[0120]
es

：电喷雾正电离
[0121]
et：乙基
[0122]
etoh：乙醇
[0123]
et2o：乙醚
[0124]
etoac：乙酸乙酯
[0125]
h：小时
[0126]
hplc：高效液相色谱
[0127]
ipac：乙酸异丙酯
[0128]
lc：液相色谱
[0129]
lcms：液相色谱质谱
[0130]
me：甲基
[0131]
meoh：甲醇
[0132]
min.：分钟
[0133]
ncs：n-氯代琥珀酰亚胺
[0134]
nmr：核磁共振
[0135]
ipr：异丙基
[0136]
iproh：异丙醇
[0137]
p-tsa：对甲苯磺酸
[0138]
rt：室温
[0139]
rt：保留时间
[0140]
sfc：超临界流体色谱
[0141]
spe：固相萃取
[0142]
t-buok：叔丁醇钾
[0143]
tbs：叔丁基二甲基甲硅烷基
[0144]
tea：三乙胺
[0145]
tfa：三氟乙酸
[0146]
thf：四氢呋喃
[0147]
tlc：薄层色谱
[0148]
tms：三甲基甲硅烷基
[0149]
uplc：超高效液相色谱
[0150]
iupac名称已经使用biovia draw版本19.1(2019)和20.1(2020)生成。
[0151]
1.分析方法
[0152]
涉及空气或水分敏感性试剂的所有反应均在氮气或氩气气氛下使用干燥的溶剂和玻璃器皿进行。需要微波辐射的实验在用操作软件版本2.0升级的biotage initiator sixty微波炉上进行。运行实验以尽可能快地达到所需温度(最大辐射功率：400w，无外部冷却)。通常使用商业溶剂和试剂而无需进一步纯化，在适当时包括无水溶剂(通常地，来自aldrich chemical company的sure-seal
tm
产品或来自acros organics的acroseal
tm
)。通常，反应后进行薄层色谱、hplc或质谱分析。
[0153]
以lcms模式的质谱测量使用如下不同的方法和仪器进行：
[0154]-碱性lcms方法1：
[0155]
使用qda waters简单四极质谱仪用于lcms分析。该光谱仪配备有esi源和具有二极管阵列检测器(210至400nm)的uplc acquity classic。在具有碱性洗脱的正/负模式下，在m/z 70至800的全ms扫描中获取数据。反相分离在waters acquity uplc beh c18 1.7μm(2.1x50mm)柱上在45℃下进行，用于碱性洗脱。用h2o/acn/甲酸铵(95/5/63mg/l) 100μl/l nh4oh(溶剂a)和acn/h2o/甲酸铵(95/5/63mg/l) 100μl/l nh4oh(溶剂b)进行梯度洗脱。进样体积：1μl。在ms中全流量。
[0156][0157]
可以将一些反应混合物使用分离器相柱(来自biotage)、酸性柱或捕获和释放spe(固相萃取)柱进行处理。粗材料可以通过正相色谱、制备型tlc、(酸性或碱性)反相色谱、手性分离研磨或重结晶进行纯化。
[0158]
使用硅胶柱(100:200筛目硅胶或用于正相柱色谱系统的柱，诸如来自的isolera
tm four或teledyne isco combinormal phase)进行正相色谱。
[0159]
产物通常在真空下干燥，然后进行最终分析并且进行生物学测试。
[0160]
nmr谱图在配有运行topspin 3.2软件的windows 7professional工作站和5mm双共振宽带探针(pabbi 1
h/
19
f-bb z-grd z82021/0075)或1mm三共振探针(patxi 1
h/d-13
c/
15
n z-grd z868301/004)的bruker avanceiii 400mhz-ultrashield nmr spectrometer上记录。
[0161]
化学位移是指来自氘代溶剂(dmso-d6、meoh-d4或cdcl3)的残余质子的信号。化学位移以百万分率(ppm)给出并且耦合常数(j)以赫兹(hz)给出。自旋多重性作为宽峰(br)、单峰(s)、双重峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)和多重峰(m)给出。
[0162]
所有最终产物均通过lcms在碱性和酸性模式两者下进行分析，如下：
[0163]-碱性lcms方法2：
[0164]
使用qda waters简单四极质谱仪用于lcms分析。该光谱仪配备有esi源和具有二极管阵列检测器(210至400nm)的uplc acquity classic。在具有碱性洗脱的正/负模式下，在m/z 70至800的全ms扫描中获取数据。反相分离在waters acquity uplc beh c18 1.7μm(2.1x100 mm)柱上在45℃下进行，用于碱性洗脱。用h2o/acn/甲酸铵(95/5/63mg/l) 100μl/l nh4oh(溶剂a)和acn/h2o/甲酸铵(95/5/63mg/l) 100μl/l nh4oh(溶剂b)进行梯度洗脱。进样体积：1μl。在ms中全流量。
[0165]
时间(min)a(％)b(％)流量(ml/min)09910.40.89910.4
5.3001000.45.3501000.57.3001000.57.359910.499010.4
[0166]-酸性lcms方法：
[0167]
使用qda waters简单四极质谱仪用于lcms分析。该光谱仪配备有esi源和具有二极管阵列检测器(210至400nm)的uplc acquity hclass。在具有酸性洗脱的正/负模式下，在m/z 70至800的全ms扫描中获取数据。反相分离在waters acquity uplc hss t3 1.8μm(2.1x100 mm)柱上在45℃下进行，用于酸性洗脱。用h2o/acn/tfa(95/5/0.05％)(溶剂a)和acn(溶剂b)进行梯度洗脱。
[0168][0169]
2.2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)-1-[(1s,3r)-3-(羟基甲基)-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-2-基]乙酮(ia)的一水合物结晶形式的制备
[0170]
式(ia)的化合物通过应用共同未决的国际专利申请wo 2021/001288(通过引用并入本文)的实施例2中所描述的相同合成方法来制备。
[0171]
还应用以下重结晶方案作为第2.8部分中所公开的重结晶方案的替代方案：
[0172]
对溶解在240ml的二甲基亚砜中的5.00g粗材料进行重结晶。将溶液加热至40℃，然后在p3烧结玻璃上过滤。将反应器和过滤器用35ml二甲基亚砜冲洗。将滤液转移至干净的反应器中并且加热至85℃。经30分钟缓慢加入110ml的水。然后将250mg的化合物(ia)(0.5％w/w，一水合物物形式)添加至反应混合物中。将混合物在85℃下搅拌2h30，同时结晶物质从溶液中析出，然后经12小时缓慢冷却至20℃。将悬浮液过滤，并且将滤饼依次用几份水冲洗并且然后用150ml的乙酸乙酯冲洗。将滤饼在50℃-60℃下在真空下干燥。获得呈46.9g的灰白色粉末的化合物(ia)。收率＝94％
[0173]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.65(dd,j＝9.0,2.2hz,1h),7.52(dd,j＝9.0,2.1hz,1h),7.37(ddd,j＝19.6,7.6,1.7hz,1h),7.25
–
7.03(m,2h),5.30(q,j＝6.5hz,0.3h),
5.16
–
4.99(m,1.7h),4.99
–
4.84(m,0.7h),4.63
–
4.30(m,3.3h),4.17
–
3.93(m,4h),3.28(dt,j＝10.5,5.1hz,1.3h),3.10
–
2.85(m,1.7h),1.56(dd,j＝13.2,6.9hz,6.7h),1.24(d,j＝6.5hz,2.3h)。
[0174]
3.式(ii-a)的化合物-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基二氢磷酸酯及其二钠(ii-a-na)和钙(ii-a-ca)盐的制备
[0175][0176]
3.1.中间体(a1)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基磷酸二苄酯的合成
[0177]
在室温下，向(ia)(10.0g，20.0mmol)在dcm(210ml)中的悬浮液中依次添加二苄基n,n-二异丙基亚磷酰胺(10.8ml，31.5mmol)、咪唑(1.43g，21.0mmol)和咪唑盐酸盐(3.29g，31.5mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌2h。然后经45min分两部分添加过氧化氢(35％w/w，在水中，10.4ml，128mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1h30。然后将反应混合物用饱和亚硫酸氢钠溶液(200ml)洗涤，并且将水相用dcm萃取两次。将合并的有机相用盐水洗涤，经mgso4干燥并且真空浓缩直至干燥以得到淡黄色油。将粗产物通过快速色谱法biotage isolera four(100g sfar硅胶柱，以庚烷:etoac 70:30至20:80的梯度，经15cv)纯化。收集最纯的级分，并且将溶剂蒸发(30℃)直至干燥以得到呈白色固体的[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基磷酸二苄酯(a1)(11.9g，16.2mmol，81％收率)。
[0178]
碱性lcms方法1：在1.71min处1个峰，(es

)：758/760[m na]

，458/460[m-(bno)2p(o)oh h]

，87％纯度。
[0179]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.67(dd,j＝13.6,9.0hz,1h),7.52(dd,j＝20.8,9.0hz,1h),7.45
–
6.91(m,13h),5.39(d,j＝6.7hz,0.35h),5.18
–
4.92(m,3.70h),4.91
–
4.82(m,1.81h),4.65(m,0.76h),4.34(dd,j＝52.2,16.5hz,1.35h),4.15
–
3.83(m,4.68h),3.75(dt,j＝11.7,6.2hz,0.47h),3.53(q,j＝9.0hz,0.67h),3.12(m,1.40h),1.61
–
1.48
(m,6.73h),1.29
–
1.13(m,2.29h)。
[0180]
3.2.化合物(ii-a)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基二氢磷酸酯的合成
[0181]
在300ml的玻璃parr反应器中引入[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基磷酸二苄酯(a1)(11.5g，15.6mmol)、thf(141ml)和钯(5％，在jm型87l碳糊上，764mg，0.359mmol)，并且将反应混合物在4巴的h2下搅拌3h。然后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，并且用thf(200ml)洗脱滤饼。将滤液真空浓缩直至干燥以得到白色固体。将该粗混合物通过反相制备型hplc gilson碱性模式(ymc triart-500g-10μm-76,5x200mm，梯度洗脱acn/(5ml nh4oh，在1000ml水中)20/80至50/50)纯化。收集最纯的级分并且直接冷冻干燥以得到白色固体。将该白色固体通过反相快速色谱法biotage isolera four在酸性条件中(按份1.0g，c18 snap 60g凝胶柱，以在水/甲酸(ph～5)中20％至50％ acn的梯度，经12cv)第二次纯化。收集最纯的级分并且直接冷冻干燥以得到呈白色固体的[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基二氢磷酸酯(ii-a)(6.07g，10.9mmol，70％收率)。
[0182]
碱性lcms方法2：在4.00min处1个峰，(es

)：554/556[m-h]-，97％纯度。
[0183]
酸性lcms方法：在2.30min处1个峰，(es

)：554/556[m-h]-，97％纯度。
[0184]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.70
–
7.62(m,1h),7.52(t,j＝8.7hz,1h),7.43
–
7.32(m,1h),7.27
–
7.06(m,2h),5.36(d,j＝6.8hz,0.35h),5.05(q,j＝6.5hz,0.65h),4.78
–
4.30(m,2.96h),4.11(dd,j＝14.9,6.0hz,1.14h),4.02(s,3.36h),3.07(m,1.65h),2.88(m,0.42h),1.62
–
1.48(m,7.2h),1.23(d,j＝6.4hz,1.9h)。
[0185]
使用在10ml乙醇/戊烷(10/1)溶液中的100mg的化合物优化(ii-a)的结晶。3周之后，获得白色晶体(20mg，20％收率)。使用10ml乙醇/戊烷(10/1)，在被分为5个140mg批次的700mg上进行按比例放大的结晶。3周之后，获得[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基二氢磷酸酯(ii-ax)的白色晶体(203mg，29％收率，5个实验的组合)。
[0186]
3.3.化合物(ii-a-na)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基磷酸酯二钠的合成
[0187]
在0℃下，向[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基二氢磷酸酯(ii-a)(1.0当量，275mg，0.490mmol)在水(0.1m，5ml)中的溶液中添加氢氧化钠溶液(2.0当量，1ml，1mmol，1m溶液)，并且将反应在室温下搅拌1h。将反应混合物冷冻干燥过夜以得到呈浅黄色固体的[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基磷酸酯二钠(ii-a-na)(250mg，0,402mmol，82％收率)。
[0188]1h nmr(400mhz,d2o)δ7.53
–
7.40(m,3h),7.27(m,1h),7.13(d,j＝7.4hz,1h),5.39(s,0.16h),5.26(d,j＝6.8hz,0.31h),5.11(q,j＝6.5hz,1h),4.76(d,j＝9.4hz,2h),4.57(d,j＝17.5hz,2h),4.44
–
4.25(m,1h),3.95(d,j＝4.1hz,3h),3.75
–
3.61(m,1h),3.33
–
3.21(m,1h),3.16(d,j＝14.1hz,1h),3.06(d,j＝15.9hz,0.32h),2.94
–
2.82(m,0.37h),1.68(d,j＝3.5hz,3h),1.62(d,j＝6.7hz,1h),1.55(d,j＝9.4hz,3h),1.28(d,j＝6.6hz,
2h)。
[0189]
3.4.化合物(ii-a-ca)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基磷酸酯钙的合成
[0190]
在0℃下，向[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基二氢磷酸酯(ii-a)(1.0当量，100mg，0.178mmol)在水(0.1m，2ml)中的溶液中添加氢氧化钙(1.0当量，14mg，0.183mmol)，并且将反应在室温下搅拌1h。将反应混合物冷冻干燥过夜以得到呈白色固体的[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基磷酸酯钙(ii-a-ca)(110mg，0,179mmol，100％收率)。
[0191]1h nmr(400mhz,d2o)δ7.49
–
7.37(m,3h),7.22(m,1h),7.10(d,j＝7.6hz,1h),5.35(s,0.10h),5.28
–
5.21(m,0.58h),5.07(q,j＝6.5hz,1h),4.52(d,j＝17.5hz,2h),4.44
–
4.25(m,1h),3.95(d,j＝4.1hz,3h),3.75
–
3.61(m,1h),3.33
–
3.21(m,1h),3.16(d,j＝14.1hz,1h),3.06(d,j＝15.9hz,0.32h),2.94
–
2.82(m,0.37h),1.68(d,j＝3.5hz,3h),1.62(d,j＝6.7hz,1h),1.55(d,j＝9.4hz,3h),1.28(d,j＝6.6hz,2h)。
[0192]
4.化合物(ii-b)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酸酯的制备
[0193][0194]
4.1.中间体(a2)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-甲基-丁酸酯的合成
[0195]
在室温下，向(ia)(8.00g，16.2mmol)在dcm(170ml)中的溶液中添加(2s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-甲基-丁酸(boc-l-缬氨酸，7.30g，33.2mmol)、dmap(1.00g，8.40mmol)和dcc(6.93g，33.6mmol)，并且将混合物在室温下搅拌18h。然后，添加nahco3的饱和溶液，并且将水层用dcm萃取(3次)。将合并的有机层用盐水洗涤，经mgso4干燥，过滤并且蒸发直至干燥以得到白色固体。将该粗混合物通过反相制备型hplc gilson碱性模式(ymc triart-500g-10μm-76,5x200mm，梯度洗脱acn/(5ml nh4oh，在1000ml水中)60/40至90/10)纯化。收集最纯的级分浓缩至干燥以得到呈白色固体的[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-甲基-丁酸酯(a2)(10.0g，14.8mmol，91％收率)。
[0196]
碱性lcms方法1：在1.78min处1个峰，(es

)：675/677[m h]

，575/577[m-boc h]

，98％纯度。
[0197]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.67(d,j＝9.1hz,1h),7.53(d,j＝9.0hz,1h),7.44
–
7.33(m,1h),7.28
–
7.02(m,2.45h),6.87(d,j＝8.8hz,0.35h),5.39(q,j＝6.5hz,0.38h),
5.23
–
4.85(m,1.50h),4.83
–
4.35(m,2.93h),4.19
–
3.73(m,5.64h),3.72
–
3.43(m,2h),3.20
–
3.12(m,1h),1.97(q,j＝6.8hz,0.53h),1.71(q,j＝6.6hz,0.49h),1.62
–
1.46(m,7.45h),1.35(d,j＝13.4hz,9h),1.25(d,j＝6.5hz,2h),0.82(m,4h),0.69(dd,j＝18.2,6.8hz,2h)。
[0198]
4.2.化合物(ii-b)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酸酯的合成
[0199]
在室温下，向[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-甲基-丁酸酯(a2)(10.0g，14.8mmol)在2-丙醇(100ml)中的溶液中添加盐酸(37％，在水中，36.2ml，434mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌30min。然后向所得混合物中添加dcm和nahco3的饱和溶液，直至ph达到7-8并且分离各层。将水层用dcm萃取两次。然后，将合并的有机层经mgso4干燥，过滤并且浓缩至干燥以得到白色固体。将该粗混合物通过反相制备型hplc gilson碱性模式(ymc triart-500g-10μm-76,5x200mm，梯度洗脱acn/(5ml nh4oh，在1000ml水中)50/50至100/0)纯化。收集最纯的级分浓缩至干燥以得到呈白色固体的标题产物。将产物在etoac/戊烷5:2(35ml/g)的混合物中重结晶，以得到呈白色晶体的[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酸酯(ii-b)(3.30g，5.75mmol，39％收率)。
[0200]
碱性lcms方法2：在4.59min处1个峰，(es

)：575/577[m h]

，98％纯度。
[0201]
酸性lcms方法：在4.45min处1个峰，(es

)：575/577[m h]

，99％纯度。
[0202]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.67(dd,j＝9.1,1.2hz,1h),7.53(dd,j＝9.0,1.6hz,1h),7.36(ddd,j＝7.5,5.4,1.5hz,1h),7.28
–
7.07(m,2h),5.40(d,j＝6.6hz,0.43h),5.07(d,j＝7.8hz,1h),5.00(s,0.41h),4.77(m,0.58h),4.70
–
4.35(m,2.26h),4.20
–
3.81(m,5h),3.51(dd,j＝11.1,7.8hz,0.56h),3.42(dd,j＝10.3,7.8hz,0.45h),3.20
–
3.07(m,1.38h),2.78(d,j＝4.9hz,0.41h),1.82(dq,j＝13.2,6.8hz,0.44h),1.70
–
1.35(m,9.31h),1.24(d,j＝6.5hz,1.62h),0.85(d,j＝6.9hz,1.81h),0.77(dd,j＝6.8,5.3hz,3h),0.66(d,j＝6.8hz,1.46h)。
[0203]
5.化合物(ii-c)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-氨基-4-甲基-戊酸酯的合成
[0204][0205]
5.1.中间体(a3)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-甲基-戊酸酯的合成
[0206]
在室温下，向(2s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-甲基-戊酸(boc-l-亮氨酸，9.50g，40.3mmol)和(ia)(10.0g，20.2mmol)在dcm(200ml)中的悬浮液中添加dmap(1.24g，10.1mmol)和dcc(8.35g，40.5mmol)，并且将所得反应混合物在室温下搅拌18h。在lcms监测示出不完全转化之后，向反应混合物中添加额外的dcc(2.09g，10.1mmol)和(2s)-2,4-二甲基戊酸(2.39g，10.1mmol)，并且将所得反应混合物在室温下搅拌20h。在lcms监测示出完全转化之后，将反应混合物用水和dcm稀释并且分离各层。将有机层用饱和nh4cl水溶液、饱和nahco3水溶液、水、盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并且浓缩以得到粗品。将粗品通过快速色谱法biotage isolera four(固体负载在硅藻土上，220g sfar硅胶，以庚烷/etoac 100/0至40/60的梯度)纯化。收集含有期望化合物的级分并且浓缩以得到残余物，然后将其通过快速色谱法biotage isolera four(液体负载在dcm中，220g sfar硅胶，以dcm/etoac 100/0至80/20的梯度)纯化。将含有期望产物的级分合并，并且在减压下部分地蒸发直至去除所有dcm以得到悬浮液，将其过滤以得到溶液，将所述溶液浓缩以得到呈白色固体的[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-甲基-戊酸酯(a3)(11.3g，16.4mmol，81％收率)。
[0207]
碱性lcms方法2：在1.82min处1个峰，(es

)：589[m h-boc]

，98％纯度。
[0208]
酸性lcms方法：在1.82min处1个峰，(es

)：589[m h-boc]

，98％纯度。
[0209]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.42(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),7.35(m,1h),7.24
–
7.16(m,2h),7.07(dd,j＝16.3,7.4hz,1h),5.27(m,1h),4.86(d,j＝8.3hz,0.5h),4.83
–
4.78(m,0.5h),4.71(m,0.5h),4.67
–
4.52(m,2.5h),4.43(dd,j＝11.1,3.6hz,0.5h),4.38
–
4.23(m,1h),4.21
–
4.15(m,0.5h),4.10(m,0.5h),3.98(d,j＝3.2hz,3h),3.65(t,j＝10.1hz,0.5h),3.45
–
3.26(m,1h),3.16(ddd,j＝30.0,16.1,5.3hz,1h),1.82
–
1.46(m,10.5h),1.42(d,j＝2.5hz,9h),1.38(d,j＝6.5hz,1.5h),0.91(d,j＝6.4hz,3h),0.82(dd,j＝10.8,6.5hz,3h)。
[0210]
5.2.化合物(ii-c)-[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-氨基-4-甲基-戊酸酯的合成
[0211]
在0℃下，向[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-甲基-戊酸酯(a3)(10.0g，14.5mmol)在2-丙醇(150ml)中的溶液中添加盐酸(37％w/w，在水中，36.2ml，434mmol)，并且将反应混合物经8天从4℃至室温搅拌。将反应混合物用dcm(600ml)稀释，然后缓慢添加饱和nahco3水溶液直至ph＝8。分离各层，并且将水层用dcm(2
×
400ml)萃取。将合并的有机层用半饱和nacl水溶液(800ml)、盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并且浓缩以得到粗品。将粗品通过快速色谱法biotage isolera four(液体负载在dcm中，220g sfar硅胶，以庚烷/etoac/meoh 50/50/0至0/100/0然后0/100/0至0/90/10的梯度)纯化两次以得到白色固体。将固体溶解在etoac(100ml)中并且用戊烷(250ml)稀释。将整个混合物在35℃下搅拌30min直至获得澄清溶液。允许溶液冷却至室温并且在室温下以150rpm搅拌6天以得到白色悬浮液，将其过滤。将固体在室温下在高真空下干燥24h以得到呈白色晶体的[(1s,3r)-2-[2-(3,5-二氯-1-甲基-吲唑-4-基)乙酰基]-5-(1-羟基-1-甲
基-乙基)-1-甲基-3,4-二氢-1h-异喹啉-3-基]甲基(2s)-2-氨基-4-甲基-戊酸酯(ii-c)(2.56g，4.35mmol，30％收率)。
[0212]
碱性lcms方法2：在4.80min处1个峰，(es

)：589[m h]

，100％纯度。
[0213]
酸性lcms方法：在3.93min处1个峰，(es

)：589[m h]

，100％纯度。
[0214]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.67(d,j＝9.0hz,1h),7.52(dd,j＝9.0,1.4hz,1h),7.37(ddd,j＝8.0,4.0,1.5hz,1h),7.27
–
7.08(m,2h),5.40(q,j＝6.5hz,0.45h),5.13
–
4.96(m,1.55h),4.73(dq,j＝8.0,3.9hz,0.55h),4.68
–
4.46(m,2h),4.39(d,j＝16.7hz,0.45h),4.18(dd,j＝11.0,4.6hz,0.55h),4.14
–
3.93(m,4h),3.88(dd,j＝10.4,2.9hz,0.45h),3.40(ddd,j＝18.2,10.7,8.4hz,1h),3.28(m,0.55h),3.15(dd,j＝16.6,4.7hz,1h),3.00(dd,j＝9.1,5.3hz,0.45h),1.81
–
1.44(m,10h),1.41
–
1.06(m,4h),0.87
–
0.74(m,6h)。
[0215]
6.式(ii-a)、(ii-ax)、(ii-b)和(i)的化合物的溶解度
[0216]
根据实施例2.12.获得的式(ia)的化合物和根据实施例3.2.和4.2.分别获得的式(ii-a)、(ii-ax)和(ii-b)的化合物的溶解度在使用烧瓶振荡法的同时在不同介质中确定。将对于(ii-ax)和(ii-b)相当于5mg/ml的式(i)的化合物的浓度和对于(ii-a)相当于1mg/ml的式(i)的化合物的浓度的过量固体悬浮于5ml的缓冲液/生物相关介质中，如表1中具体描述的，并且在配备有旋转混合器的气候室中在室温或37℃(如以下所示)下在密封玻璃小瓶(10ml)中温育24h。假定24h的时间点已达到溶解度，此时将悬浮液通过0.45-μm超自由过滤器(merck millipore)过滤，并且通过hplc确定药物含量。一式三份(n＝3)确定化合物(ia)、(ii-a)、(ii-ax)和(ii-b)的溶解度，并且计算平均值。
[0217]
所测试的介质分别是水、磷酸盐缓冲液、fassgf、fassif-v2和fessif-v2。fassg是禁食条件的胃液。fassgf在ph 1.6下制备并且含有0.08mm牛磺胆酸盐、0.02mm磷脂、34mm钠和59mm氯化物。fassif-v2和fessif-v2分别是禁食和进食状态的生物相关介质。fassif-v2在ph 6.5下制备并且含有3mm牛磺胆酸盐、0.2mm磷脂、106mm钠、69mm氯化物和19mm马来酸。fessif-v2在ph 5.8下制备并且含有10mm牛磺胆酸盐、2mm磷脂、0.8mm油酸盐、5mm甘油单油酸酯、218mm钠、125mm氯化物和55mm马来酸。
[0218]
表1
[0219][0220][0221]
上文所获得的结果表明，与式(ia)的化合物相比，前药(ii-a)、(ii-ax)和(ii-b)的溶解度最小增加20倍，无论使用何种介质。
[0222]
7.(ii-a)、(ii-b)和(ii-c)的混悬剂的体内生物利用度。
[0223]
7.1.(ii-a)、(ii-b)和(ii-c)的液体混悬剂
[0224]
以下混悬剂中所使用的制剂媒介物是1％(w/v)甲基纤维素(400cps)、0.1％(重量/体积)80、0.1％(w/v)消泡剂1510us在水中的25mm磷酸盐缓冲液ph 3.0中的混合物。
[0225]
将式(ii)的化合物在超声发生器系统(covaris s220x)的容器中称重，并且添加如以上所描述的制剂媒介物，以使式(ii)的化合物的浓度达到0.72g/ml。
[0226]
通过在1分钟期间超声处理使溶液均质化，重复3次。
[0227]
7.2.施用和生物利用度测量。
[0228]
如以上段落7.1中所描述的，以相当于3mg/kg的式(i)的化合物的单次口服剂量，向三只雄性sprague-dawley大鼠施用(ii-a)、(ii-b)和(ii-c)的各自混悬剂。
[0229]
给药后0.12h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h和8h收集血浆样品。
[0230]
通过lc/ms(液相色谱/质谱)定量化合物(i)和各自化合物(ii-a)、(ii-b)和(ii-c)的血浆浓度。
[0231]
图1和3表明，所有前药(ii-a)和(ii-c)完全裂解成在血流中循环的式(i)的化合物。
[0232]
图2表明，前药(ii-b)部分地裂解成式(i)的化合物。