一种具有抗菌性能的人工模拟酶及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及口腔护理用品技术领域，具体涉及一种具有抗菌性能的人工模拟酶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.龋齿是人类广泛流传的一种慢性病，尤其在青少年和儿童发病率极高，研究表明龋齿发病主要是由于致龋菌在口腔中的生长和产酸，牙面的粘附和聚集等，对于这种细菌形成的慢性疾病，人们最常用的方法通过药物治疗和口腔清洁预防。
3.在过去几十年中，人们已经进行了很多防治龋齿药物的研究，并研制出了许多防治龋病的药物。例如青霉素、红霉素、四环素及螺旋霉素等抗生素类,这些药物虽具有一定的防龋效果,但长期使用可引起口腔及肠道菌群失调而导致其他疾病。除了使用上述抗生素类药物防龋，免疫防龋研究已有40年的历史,积累了大量的理论与实践成果。针对口腔正常菌群,口腔中本来就存在着针对它们的特异性抗体，但这种天然免疫诱导的抗体不足以将病原体清除,所以需要通过接种疫苗将抗体提高到治疗或预防水平,或者直接给予特异性抗体以对抗病原体。免疫防龋面临着增强免疫原性与生物活性的问题,也会导致口腔细菌的耐药性的产生。除了上述两种手段之外，应用氟化物预防龋齿是目前口腔护理用品最流行的手段，但是会存在氟化物的不稳定性，以及高浓度氟浓度的毒副作用，产生多种口腔中耐氟菌株等问题。因此，如何能够克服上述防龋手段的局限，寻求一种简便、经济、有效的防龋方法，是众多龋病研究者追求的目标，亟需寻找到一种安全有效的防龋新材料以替代上述防龋手段。


技术实现要素：

4.本发明意在提供一种具有抗菌性能的人工模拟酶在口腔护理用品中的应用，以解决现有口腔护理用品采用抑菌防龋方式存在安全性不理想且易产生药物抗性的技术问题。本发明提供了一种超细钯纳米酶材料，该钯纳米酶通过类过氧化氢酶活性抑制口腔中有害细菌的生长，抑制细菌产酸，从而达到预防龋齿的效果。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种具有抗菌性能的人工模拟酶在制备口腔护理用品中的应用，所述人工模拟酶由如下方法制备：钯源在含有表面活性剂和还原剂的反应体系中，经反应获得钯纳米酶。
7.本方案还提供了一种含有人工模拟酶的牙膏，以质量份数计，其配方为：保湿剂41-80份、摩擦剂10-30份、钯纳米酶0.05-0.5份、增稠剂0.1-1.5份、表面活性剂0.5-1.5份、香精0.5-1.5份、磷酸盐缓冲液1-6份、余量为水。
8.本方案还提供了一种制备含有人工模拟酶的牙膏的方法，将钯纳米酶和磷酸盐缓冲液混合，以50-150rpm的转速搅拌10-30min，获得活化后的钯纳米酶分散液；将保湿剂和增稠剂混合均质，再加入表面活性剂、活化后的钯纳米酶分散液、余量水，并均匀搅拌，得到混合物a；在混合物a中加入摩擦剂，均质后抽真空，再加入香精，搅拌均质并脱气，获得牙
膏。
9.本方案还提供了一种具有抗菌性能的人工模拟酶，其具四面体结构，粒径为40-80nm,水动力尺寸为62-106nm，表面电位为-34
±
6mv。
10.本方案还提供了一种具有抗菌性能的人工模拟酶在制备活性氧清除制剂、抑菌抗菌制剂、细菌产酸抑制剂或预防龋齿的制剂中的应用。
11.本方案还提供了一种制备具有抗菌性能的人工模拟酶的方法，包括以下依次进行的步骤：
12.s1：将表面活性剂和还原剂分散于水中，获得混合溶液；
13.s2：搅拌并加热混合溶液然后加入钯源溶液；60-90℃反应2-6h，获得钯纳米酶。
14.进一步，钯源在含有表面活性剂和还原剂的反应体系中，经反应获得钯纳米酶；所述反应温度为60-90℃，反应时间为2-6h。
15.进一步，所述钯源包括含有pd
2
、pd
3
、pd
4
中的至少一种阳离子的化合物；所述表面活性剂包括聚乙烯吡烷酮、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺中的至少一种；所述还原剂包括l-抗坏血酸、溴化钾(kbr)、硼氢化钠、柠檬酸钠、氯化钾、氢化铝锂、乙硼烷中的至少一种。
16.进一步，所述口腔护理用品包括牙膏、漱口水、牙粉和牙齿凝胶。
17.进一步，所述保湿剂包括聚乙二醇、甘油、山梨醇和丙二醇中的至少一种；所述摩擦剂包括碳酸钙、二氧化硅、磷酸氢钙和甘油磷酸钙中的至少一种；所述增稠剂包括羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、黄原胶、卡拉胶、瓜尔胶和卡波姆中至少一种；所述表面活性剂包括氨基酸类表面活性剂、十二烷基硫酸钠和烷基糖苷中的至少一种。
18.综上所述，本技术方案的原理在于：
19.本发明提供了一种超细钯纳米酶材料，该钯纳米酶通过类过氧化氢酶活性抑制口腔中有害细菌的生长，抑制细菌产酸，从而达到预防龋齿的效果。本技术方案将纳米酶添加到牙膏中，可以促进牙膏对于口腔常见细菌的抑制效果。由于本技术方案是首次将钯纳米酶应用于牙膏环境中，如何保证纳米酶在该产品中的效果的充分发挥，如何保证加入纳米酶后的膏体稳定性以及纳米酶与其他膏体成分的相容性，这是实际应用过程中需要解决的问题。经过发明人的大量研究发现，如果直接将纳米酶添加于牙膏中，会出现其抑菌性能难以充分发挥的问题。需要使用特定的缓冲液对纳米酶进行活化，然后将纳米酶添加到牙膏中，才能保证纳米酶的抑菌效果。
20.本技术方案的有益效果在于：
21.(1)该钯纳米酶制备条件温和、方法简单、粒径易于控制、成本低廉、形貌均匀可控、在水中分散性好、生物相容性好、无细胞毒性。易溶于蒸馏水，可以制成牙膏等口腔护理用品组合物。
22.(2)上述钯纳米酶可以抑制口腔中变异链球菌、鼠李糖乳杆菌、血链球菌、粘性放线菌等有害致龋齿细菌，预防牙齿龋齿。
23.(3)该纳米酶制成的口腔护理用品，可以有效抑制细菌产酸，可以很好保护口腔，维护口腔酸碱平衡。
附图说明
24.图1为实验例1制备的钯纳米酶的透射电镜图。
25.图2为实验例1制备的钯纳米酶的粒径分布图。
26.图3为实验例1制备的钯纳米酶的zeta电位图。
27.图4为实验例2制备的含钯纳米酶的牙膏的细菌产酸抑制效果统计图。
28.图5为实验例3制备的钯纳米酶的细胞毒性测试结果。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
30.实施例1：钯纳米酶的制备
31.钯纳米酶的大致制备流程如下：
32.s1：向圆底烧瓶中加入5-40ml去离子水，再加入40-80mg表面活性剂、440-880mg还原剂，超声辅助下促进上述溶质溶解，获得混合溶液。
33.s2：将混合溶液转移至油浴中，将混合溶液加热至60-100℃，并同时以150-350rpm的速度搅拌。将溶质的质量浓度为10-40mg/ml的钯源溶液1-6ml迅速加入混合溶液中，获得反应体系。反应体系在60-90℃的温度下冷凝回流2-6h，然后停止反应，去离子水洗涤沉淀物多次，然后离心收集沉淀物。沉淀物再以0.001-10mg/ml的浓度分散于超纯水中，获得钯纳米酶分散液，低温冷藏，以备后续使用。
34.其中，钯源包括含有pd
2
、pd
3
、pd
4
中的至少一种阳离子的化合物，优选为氯钯酸钠(na2pdcl4)、pdcl2、pd(nh3)4cl2中的至少一种；
35.表面活性剂包括聚乙烯吡烷酮、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺中中的至少一种；
36.还原剂包括l-抗坏血酸、溴化钾(kbr)、硼氢化钠、柠檬酸钠、氯化钾、氢化铝锂、乙硼烷中的至少一种。
37.实施例2：含钯纳米酶的牙膏制备
38.按如下重量份数分别称取牙膏的保湿剂、摩擦剂、钯纳米酶、增稠剂、表面活性剂、香精配制牙膏，牙膏具有抗炎、抑制细菌产酸，杀伤口腔有害细菌功能。保湿剂41-80份、摩擦剂10-30份、钯纳米酶0.05-0.5份(具体可使用实施例1制备的钯纳米酶溶液(钯纳米酶分散液)，例如：0.001-10mg/ml的钯纳米酶溶液；在本配方中，钯纳米酶的质量份数以钯纳米酶溶液的质量计算)、增稠剂0.1-1.5份、表面活性剂0.5-1.5份、香精0.5-1.5份、水余量(总100份)。除了上述原料之外，采用本方案制备的含钯纳米酶的牙膏需要特别添加特定的ph缓冲液，以保证钯纳米酶的抑菌活性。缓冲液的类型为：磷酸盐缓冲液(ph6.6)，缓冲液的用量为：每0.05-0.5份钯纳米酶添加1-6份缓冲液。该磷酸盐缓冲液由如下方式配制：取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g，加蒸馏水溶定容至400ml，调ph至6.6。
39.其中，保湿剂包括聚乙二醇、甘油、山梨醇和丙二醇中的至少一种。
40.摩擦剂包括二氧化硅、磷酸氢钙、碳酸钙甘油磷酸钙中的至少一种。
41.增稠剂包括羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、黄原胶、卡拉胶、瓜尔胶和卡波姆中至少一种。
42.表面活性剂包括氨基酸类表面活性剂、十二烷基硫酸钠和烷基糖苷中的至少一种。
43.在后续的实验研究中，具体使用的牙膏配方为：
44.山梨醇40-70份、聚乙二醇(peg)1-10份、二氧化硅10-30份、钯纳米酶0.05-0.5份、羧甲基纤维素钠0.1-1.5份、十二烷基硫酸钠(k12)0.5-1.5份、薄荷香精0.5-1.5份、缓冲液1-6份。
45.牙膏的具体制备工艺如下：
46.ss1：将钯纳米酶(例如：1mg/ml的钯纳米酶溶液)和缓冲液混合，以50-150rpm的转速搅拌10-30min，获得活化后的钯纳米酶分散液。
47.ss2：将保湿剂和增稠剂混合均质，再加入表面活性剂、活化后的钯纳米酶分散液、余量水，并均匀搅拌，得到混合物a。
48.ss3：在混合物a中加入60％质量的摩擦剂，混合搅拌均匀，再加入剩余摩擦剂后搅拌均匀再抽真空；加入香精，搅拌均质，脱气，获得牙膏。
49.实验例1：钯纳米酶抑制口腔有害菌的mic值
50.(一)钯纳米酶的制备
51.本实验例的钯纳米酶采用实施例1的方法制备，具体的参数选择参见表1。
52.表1：钯纳米酶的工艺参数选择
[0053][0054]
其中，以样品1为例，展示了钯纳米酶的透射电镜图(图1)、粒径分布图(图2)、zeta电位图(图3)。钯纳米酶形貌均匀、具有四面体结构，粒径为40-80nm,水动力尺寸为62-106nm之间，表面电位为-34
±
6mv。
[0055]
(二)实验方法
[0056]
(1)方法参照《消毒技术规范》
‑‑‑
最小抑菌浓度测定试验(营养肉汤稀释法)。
[0057]
(2)目标菌株：变异链球菌atcc 25175、变异链球菌atcc700610、鼠李糖乳杆菌atcc416、血链球菌atcc10556、粘性放线菌atcc15987。
[0058]
(3)样品处理：
[0059]
样品1先用灭菌蒸馏水配置成浓度为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml，使用时将样品液按2倍稀释法溶于tsb/bhi液体培养基中，使其最终浓度达到0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml。
[0060]
(4)菌悬液制备
[0061]
变异链球菌(atcc25175)、血链球菌(atcc10556)、粘性放线菌(atcc15987)和鼠李糖乳杆菌(atcc416)购于商城北纳生物创联生物科技有限公司。将变异链球菌、鼠李糖乳杆菌在tsa固体培养基上厌氧复苏48h，血链球菌、粘性放线菌在bhi固体培养基上厌氧复苏48h，挑取单菌落分别在tsa、bhi液体培养基中厌氧扩大培养24h，用比浊仪将菌种用生理盐水调至浓度约为1
×
108cfu/ml备用。
[0062]
(5)样品对菌液mic值测定
[0063]
往48孔板加入400μl双料培养基，加入400μl样液，加入菌液16μl，作为试验样本。以同样方法接种不含样品的培养基和菌，作为阳性组对照。只加培养基，作为阴性对照。将试验样本、阴性对照、阳性对照放置37℃培养箱中，厌氧培养48h，观察结果。
[0064]
(三)实验结果
[0065]
表2：样品1的mic值测定结果
[0066][0067][0068]
实验结果证明钯纳米酶对口腔常见五种有害细菌生长都有显著的抑制作用，钯纳米酶对变异链球菌(atcc700610)mic的值为0.125mg/ml、变异链球菌(atcc25175)mic的值为0.25mg/ml、鼠李糖乳杆菌(atcc416)mic的值为0.25mg/ml、血链球菌(atcc15987)mic的值为0.125mg/ml、粘性放线菌(atcc10556)mic的值为0.125mg/ml。
[0069]
实验例2：含钯纳米酶的牙膏抑制变异链球菌产酸性能研究
[0070]
(一)实验方法
[0071]
(1)样品：含钯纳米酶的牙膏由本公司制备提供，编号为ly211201、ly211202，钯纳米酶的含量分为500ppm、5000ppm。上述两种牙膏，除了钯纳米酶的含量不同外，其他成分一致。
[0072]
ly211201配方具体为：山梨醇62份、聚乙二醇(peg)4份、二氧化硅20份、钯纳米酶0.05份(使用实验例1制备的样品1，并配制1mg/ml的钯纳米酶溶液，以下样品均使用该纳米酶)、羧甲基纤维素钠0.65份、十二烷基硫酸钠(k12)0.9份、薄荷香精1.0份、缓冲液4份，余量为水。
[0073]
ly211202配方具体为：山梨醇62份、聚乙二醇(peg)4份、二氧化硅20份、钯纳米酶0.5份、羧甲基纤维素钠0.65份、十二烷基硫酸钠(k12)0.9份、薄荷香精1.0份、缓冲液4份，余量为水。牙膏的制备方法参见实施例2，其中，获得活化后的钯纳米酶分散液的过程为：将钯纳米酶和缓冲液混合，以100rpm的转速搅拌20min。
[0074]
(2)菌株：变异链球菌(streptococcus mutans，s.mutans)为国际标准株atcc 700610。
[0075]
(3)菌液制备：将冻存菌株复苏、传代、鉴定，然后挑取2-3个菌落接种于tsb液体培养基，37℃恒温培养8h,离心，涂片，用生理盐水调节菌浓度为1.0
×
108cfu/ml。
[0076]
(4)样品液制备:将样品牙膏分别与含1％蔗糖tsb液体培养基按1:3质量比混合均匀备用。
[0077]
(5)培养基制备：含1％蔗糖的tsb液体培养基，用30g的培养基粉料和10g蔗糖加入到1000ml蒸馏水中。
[0078]
(6)操作步骤：以ly211201为例，将0.5ml菌液加入5ml样品液中混匀，设置一个重复，共6组，37℃厌氧培养，分别于培养1h、5h、7h、9h、24h、48h后测量离心后上清液的ph,离心条件为5000rpm，3min。ly211202参照ly211201设置，阴性对照加入蒸馏水。
[0079]
(二)实验结果
[0080]
实验结果证明，在含有1％蔗糖的情况下，与对照组相比，添加纳米酶的牙膏在实验周期内(5h、9h、24h、48h)能显著地抑制变异链球菌产酸，平衡酸碱值，实验结果参见图4。
[0081]
实验例3：钯纳米酶的细胞毒性研究
[0082]
牙龈成纤维细胞培养于含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素抗生素的dmem培养基中。37℃，5％ co2。细胞每次为1传3，每隔两天左右传一代。取对数生长期期的牙龈成纤维细胞，以5
×
104/孔的细胞密度接种于96孔板中，并与不同浓度的钯纳米酶(100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)共孵育24h、48h。除去96孔板中旧的培养基，用pbs试剂清洗2遍，加入120ul培养基稀释的cck8试剂和乳酸，37℃避光孵育2h，分别在450nm和490nm波长处酶标仪检测吸光度。每组设置6个平行样，并将pbs处理的细胞组设为空白对照组，计算细胞活力平均值(％)。实验结果说明钯纳米酶对牙龈成纤维细胞活性没有明显的抑制作用，48h后牙龈成纤维细胞活性仍然达到90％。说明本方案的钯纳米酶的细胞毒性低，生物安全性良好，对牙龈成纤维细胞几乎没有毒性。
[0083]
实验例4：钯纳米酶在牙膏中的添加方式研究
[0084]
(1)方法参照《消毒技术规范》
‑‑‑
抑菌环试验。
[0085]
(2)目标菌株：变异链球菌atcc 25175。
[0086]
(3)样品处理：
[0087]
待测牙膏与生理盐水按1：20稀释，稀释成均匀试验液于烧杯中，用镊子取无菌处理备用滤纸片浸入牙膏试验液中，使滤纸片吸取牙膏试验液2～3s，拿出后控干，放入无菌平皿中，开盖置超净工作台中自然干燥后备用。阴性对照是用镊子取无菌处理备用滤纸片浸入灭菌蒸馏水中，使滤纸片吸取灭菌蒸馏水2～3s，拿出后控干，放入无菌平皿中，开盖置于超净工作台中自然干燥后备用。
[0088]
待测牙膏样品具体如下：
[0089]
牙膏样品1：
[0090]
配方为：山梨醇55份、聚乙二醇(peg)6份、二氧化硅15份、钯纳米酶0.05份(使用实验例1制备的样品1，并配制1mg/ml的钯纳米酶溶液，以下样品均使用该纳米酶)、羧甲基纤维素钠1.5份、十二烷基硫酸钠(k12)1.5份、薄荷香精1.5份、缓冲液4份，余量为水，总量为100份。
[0091]
钯纳米酶的制备方法参见实验例1样品1。牙膏的制备方法参见实施例2，其中，获得活化后的钯纳米酶分散液的过程为：将钯纳米酶和缓冲液混合，以100rpm的转速搅拌20min。
[0092]
牙膏样品2：
[0093]
山梨醇40份、聚乙二醇(peg)10份、二氧化硅30份、钯纳米酶0.05份、羧甲基纤维素钠0.1份、十二烷基硫酸钠(k12)0.5份、薄荷香精0.5份、缓冲液1份，余量为水，总量为100份。
[0094]
钯纳米酶的制备方法参见实验例1样品1。牙膏的制备方法参见实施例2，其中，获得活化后的钯纳米酶分散液的过程为：将钯纳米酶和缓冲液混合，以150rpm的转速搅拌30min。
[0095]
牙膏样品3：
[0096]
山梨醇70份、聚乙二醇(peg)1份、二氧化硅10份、钯纳米酶0.5份、羧甲基纤维素钠0.5份、十二烷基硫酸钠(k12)0.5份、薄荷香精0.5份、缓冲液6份，余量为水，总量为100份。
[0097]
钯纳米酶的制备方法参见实验例1样品1。牙膏的制备方法参见实施例2，其中，获得活化后的钯纳米酶分散液的过程为：将钯纳米酶和缓冲液混合，以50rpm的转速搅拌10min。
[0098]
对比牙膏样品1：配方基本同牙膏样品1，不同点在于，未添加钯纳米酶和缓冲液。其制备工艺也进行了相应调整，具体如下：将保湿剂和增稠剂混合均质，再加入表面活性剂、余量水，并均匀搅拌，得到混合物a。在混合物a中加入60％质量的摩擦剂，混合搅拌均匀，再加入剩余摩擦剂后搅拌均匀再抽真空；加入香精，搅拌均质，脱气，获得牙膏。
[0099]
对比牙膏样品2：配方基本同牙膏样品1，不同点在于，未添加缓冲液。其制备工艺也进行了相应调整，具体如下：将保湿剂和增稠剂混合均质，再加入表面活性剂、钯纳米酶、余量水，并均匀搅拌，得到混合物a。在混合物a中加入60％质量的摩擦剂，混合搅拌均匀，再加入剩余摩擦剂后搅拌均匀再抽真空；加入香精，搅拌均质，脱气，获得牙膏。
[0100]
对比牙膏样品3：配方基本同牙膏样品1，不同点在于，未添加缓冲液。其制备工艺也进行了相应调整，具体如下：将钯纳米酶和水(4份)混合，以100rpm的转速搅拌20min，获得钯纳米酶的水分散液。将保湿剂和增稠剂混合均质，再加入表面活性剂、钯纳米酶的水分散液、余量水，并均匀搅拌，得到混合物a。在混合物a中加入60％质量的摩擦剂，混合搅拌均匀，再加入剩余摩擦剂后搅拌均匀再抽真空；加入香精，搅拌均质，脱气，获得牙膏。
[0101]
对比牙膏样品4：配方基本同牙膏样品1，不同点在于，缓冲液的类型替换为hbss缓冲液(市售常规hank's平衡盐溶液)。hbss缓冲液由如下方法配制：8g nacl、0.4g kcl、1g葡萄糖、60mg kh2po4、47.5mg na2hpo4，加蒸馏水定容至1000ml，调ph至7.2。
[0102]
对比牙膏样品5：配方基本同牙膏样品1，不同点在于，缓冲液的类型替换为：hepes缓冲液。hepes缓冲液由如下方法配制：取119.15g hepes，用蒸馏水定容至500ml，调ph至6.8，即得。
[0103]
对比牙膏样品6：配方基本同牙膏样品1，不同点在于，磷酸盐缓冲液的ph值调整至7.4，磷酸盐缓冲液的其他配制流程同实施例2。
[0104]
对比牙膏样品7：配方基本同牙膏样品1，不同点在于，磷酸盐缓冲液的ph值调整至5.8，磷酸盐缓冲液的其他配制流程同实施例2。
[0105]
(4)菌悬液制备
[0106]
变异链球菌(atcc25175)购于商城北纳生物创联生物科技有限公司。将变异链球菌、鼠李糖乳杆菌在tsa固体培养基上厌氧复苏48h，血链球菌、粘性放线菌在bhi固体培养基上厌氧复苏48h，挑取单菌落分别在tsa、bhi液体培养基中厌氧扩大培养24h，用比浊仪将菌种用生理盐水调至浓度约为1
×
106cfu/ml备用。
[0107]
(5)试验菌的接种:
[0108]
用无菌棉拭子蘸取浓度为1
×
106cfu/ml试验菌悬液，在tsa固体培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60
°
，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温厌氧环境中干燥5min。
[0109]
抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃培养箱箱，厌氧培养16h～18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录。试验重复3次。每次重复的抑菌环直径数值为上述4片试验样片的平均值，试验结果如表3所示。
[0110]
表3：各组牙膏样品以及对比牙膏样品的抑菌实验结果统计(*表示该实验组与牙膏样品1进行t检验，p＜0.05)
[0111][0112]
由上述实验结果可以，采用本方案制备的牙膏样品1-3均可以有效抑制细菌，钯纳米酶添加量越高，抑菌效果越明显。如果在牙膏中不添加纳米酶(牙膏对比样品1)，牙膏的抑菌性能下降明显。另外，发明人还研究发现，纳米酶的作用效果和制备方法相关，纳米酶需要和磷酸盐缓冲液提前共混合，才能够保证理想的抑菌效果，否则牙膏的抑菌性能将显著下降(牙膏对比样品2)。例如，牙膏对比样品2在制备牙膏的过程中，未添加磷酸盐缓冲液，将保湿剂和增稠剂混合均质，再加入表面活性剂、钯纳米酶、余量水，并均匀搅拌；牙膏
对比样品3在制备牙膏的过程中，未添加磷酸盐缓冲液，钯纳米酶和部分水混合，以100rpm的转速搅拌20min，获得钯纳米酶的水分散液。将保湿剂和增稠剂混合均质，再加入表面活性剂、钯纳米酶的水分散液、余量水，并均匀搅拌；上述操作方式均会带来牙膏的抑菌能力的下降。
[0113]
除此之外，缓冲液的类型以及ph值，也会实现纳米酶的活化产生关键影响。例如，将磷酸盐缓冲液替换为hepes缓冲液或者hank's平衡盐溶液，均不能实现纳米酶的有效活化，如果将磷酸盐缓冲液的ph值进行调整，过高或者过低，对纳米酶的活化效果也会造成显著差异。
[0114]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。