靶向轴蛋白的小分子ISX9在制备用于防治脱发产品中的用途

靶向轴蛋白的小分子isx9在制备用于防治脱发产品中的用途
技术领域
1.本发明属于防治脱发药物技术领域，尤其涉及一种靶向轴蛋白的小分子isx9在制备用于防治脱发产品中的用途。


背景技术：

2.目前，isx9是一种促进神经生成的小分子化合物，可诱导神经元、心脏和胰岛内分泌祖细胞的分化。到目前为止，isx9作用背后的分子机制仍然难以捉摸。
3.脱发是一种非常普遍的皮肤病，可能会损害生活质量，并导致一生的精神痛苦。脱发是受多种因素的影响，如遗传因素、荷尔蒙功能障碍、皮脂内容，衰老，智力的紊乱和环境的因素。现有治疗脱发的药物只有米诺地尔和非那雄胺被美国食品药品监督管理局(fda)批准临床实践。米诺地尔和非那雄胺虽然具备一定的治疗脱发的作用，但是效果并不持久且两种药物均需要长期的服用，而使用非那雄胺连续五月可能会影响生殖健康；米诺地尔会引发瘙痒、皮炎和头晕。
4.因此，急需一种治疗脱发的药物。现有技术发现wnt/β-catenin信号通路在毛发形态发生、毛发生长、毛发循环和再生中起着至关重要的作用。连环蛋白(β-catenin)是此信号通路的核心组分，该蛋白的稳定性被一个降解复合物调控。在这个降解复合物中，轴蛋白axin与包括腺瘤病息肉病蛋白(apc)、酪蛋白激酶1(ck1)和糖原合成酶激酶3β酶(gsk3β)在内的组分相互作用β-catenin被gsk3β磷酸化，导致其通过泛素化途径降解。当wnt蛋白与它们的受体卷曲蛋白(fzd)和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(lrp5/6)结合时，wnt/β-catenin通路被激活。wnt通路激活的一个关键步骤是将轴蛋白募集到lrp5/6受体复合物上。轴蛋白axin复合物与lrp5/6的细胞内段相互作用，促进lrp5/6的磷酸化，从而阻碍β-catenin的磷酸化和降解。因此，稳定的β-catenin在细胞质中聚集，并转移到细胞核中，在那里它与转录因子t细胞因子/淋巴增强因子1(tcf/lef1)结合，促进wnt信号相关的靶基因axin2，lef1，fibronectin和survivin等的转录。
5.多项研究表明，多种wnt分子可通过激活wnt/β-catenin信号通路，刺激毛囊干细胞，促进毛发再生。wnt10b已被证明通过增加β-catenin的稳定性促进毛囊细胞由静止期向生长期的转换。wnt3a已被发现可以激活β-catenin信号，并促进皮肤重建的裸鼠的毛发生长。富含wnt3a-和wnt7b的巨噬细胞-胞外囊泡通过增强wnt/β-连环蛋白通路，显著增加了真皮乳头细胞的增殖和迁移。总的来说，这些研究强调了wnt/β-catenin信号通路是一个很有前途的脱发治疗靶点。
6.通过对干细胞相关的化合物库进行高通量筛选，小分子异恶唑-9[isx9，n-环丙基-5-(噻吩-2-基)异恶唑-3-羧酰胺]已被证实为神经发生诱导剂。研究发现，isx9以肌细胞增强因子2(mef2)依赖的方式增强细胞增殖，增加海马齿状回神经元的数量或分化。isx9还可以诱导细胞内ca
2
内流，从而激活磷酸化的camk，促进mef2调控因子hdac5的核输出，进而促进神经元分化。在其他组织中，isx9被证明可以诱导心脏和胰岛内分泌祖细胞的分化。isx9可以改变β细胞代谢物，在脂毒条件下保护葡萄糖反应信号通路，并改善β细胞再生小
鼠模型中的血糖水平。然而，isx9作用的分子机制仍然不清楚。
[0007]
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的治疗脱发的药物副作用大、脱发治疗效果不佳且需要长期服用；尚没有将isx9应用于脱发药物制备的技术。


技术实现要素：

[0008]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种靶向轴蛋白的小分子isx9在制备用于防治脱发产品中的用途。
[0009]
本发明是这样实现的，一种靶向轴蛋白的小分子isx9在制备用于治疗和/或预防脱发的产品中的用途。
[0010]
进一步，所述靶向轴蛋白的小分子isx9结构式如下：
[0011][0012]
进一步，所述靶向轴蛋白的小分子isx9通过共价结合到轴蛋白的n端区域，增强了lrp6-icd与axin1的相互作用。
[0013]
进一步，所述靶向轴蛋白的小分子isx9通过激活wnt/β-catenin信号通路促进头发再生。
[0014]
进一步，所述靶向轴蛋白的小分子isx9通过上调wnt靶基因表达起作用。
[0015]
进一步，所述靶向轴蛋白的小分子isx9通过上调干性标记基因的表达起作用。
[0016]
进一步，所述靶向轴蛋白的小分子isx9是wnt/β-catenin通路新型激动剂
[0017]
进一步，所述用于治疗脱发的产品为药物、添加剂、保健品或活性成分添加剂。
[0018]
进一步，所述脱发选自雄激素性脱发、先天性脱发、后天性脱发、局部脱发、弥漫性脱发、急性脱发或慢性脱发。
[0019]
进一步，所述靶向轴蛋白的小分子isx9用于增多毛发量、促进毛发生长。
[0020]
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0021]
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0022]
本发明评估了isx9对c57bl/6小鼠毛发生长的影响。isx9通过激活wnt信号通路，诱导小鼠毛囊细胞由静止期过渡到生长期促进毛发生长。
[0023]
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
[0024]
本发明揭示了isx9可以增强lrp6和axin1相互作用，激活wnt/β-catenin信号通路，是脱发的有前途的治疗剂。
附图说明
[0025]
图1是本发明实施例提供的wnt/β-catenin信号通路激活剂的筛选。hek293t细胞转染wnt信号通路荧光素酶报告基因(supertopflash)，用阳性对照licl和单个小分子化合物处理细胞，裂解细胞测定荧光活性，观察wnt信号通路的激活情况；
[0026]
图2是本发明实施例提供的筛选得到wnt/β-catenin信号通路激活剂isx9的化学结构；
[0027]
图3是本发明实施例提供的hek293t细胞中转染supertopflash或对照superfoppflash报告基因。转染24小时后，用化合物对照(dmso)或isx9(2.5-40μm)处理细胞24小时，测定荧光素酶值并用β-gal活性归一化；
[0028]
图4是本发明实施例提供的hek293t细胞中转染supertopflash或对照superfoppflash报告基因。转染24小时后，用化合物对照(dmso)或licl(20and40mm)处理细胞24小时，测定荧光素酶值并用β-gal活性归一化；
[0029]
图5是本发明实施例提供的hacat细胞中转染supertopflash或对照superfoppflash报告基因24小时。用化合物对照(dmso)或isx9(2.5-40μm)处理细胞24小时，裂解细胞，测定荧光素酶值并用β-gal活性归一化；
[0030]
图6是本发明实施例提供的isx9可提高活性β-catenin和总β-catenin的表达水平，但对lrp6和gsk3β的表达和活性影响不大；
[0031]
图7是本发明实施例提供的利用uas-tk-luc报告基因系统发现isx9通过增强axin1与lrp6的相互作用，激活wnt/β-catenin通路；
[0032]
图8是本发明实施例提供的利用uas-tk-luc报告基因系统发现licl对axin1与lrp6的相互作用没有影响。
[0033]
图9是本发明实施例提供的western检测外源lrp6和axin1相互作用；
[0034]
图10是本发明实施例提供的使用指定抗体进行免疫沉淀，来检测isx9对内源lrp6和axin1相互作用；
[0035]
图11是本发明实施例提供使用指定抗体进行免疫沉淀，来检测isx9对内源lrp6和axin1相互作用；
[0036]
图12是本发明实施例提供用mst法分析荧光标记的axin1-300与isx9的结合；
[0037]
图13是本发明实施例提供的用mst法分析荧光标记的axin301-521与isx9的结合；
[0038]
图14是本发明实施例提供的用mst法分析荧光标记的axin522-862与isx9的结合；
[0039]
图15是本发明实施例提供的用mst法分析荧光标记的lrp6-icd与isx9的结合；
[0040]
图16是本发明实施例提供的当axin1-300片段浓度增加(0～9mg/ml)时，isx9的发射光谱(λex＝405nm)；
[0041]
图17是本发明实施例提供的在axin1-300和isx9之间形成的蛋白配体复合物的ms谱。蓝色箭头表示蛋白质axin1-300的分子量；
[0042]
图18是本发明实施例提供的；hek293t(a)、hacat(b)和nih3t3(c)细胞用对照(dmso)或指定浓度的isx9(2.5-40μm)处理24h后，wnt信号通路相关的靶基因在转录水平的表达；
[0043]
图19是本发明实施例提供的hek293t(d)、hacat(e)和nih3t3(f)细胞分别用对照(dmso)或指定浓度的isx9(2.5-40μm)处理24h后，wnt信号通路相关靶基因在蛋白水平的表
达；
[0044]
图20是本发明实施例提供的hek293t(g)、hacat(h)和nih3t3(i)细胞用对照(dmso)或指定浓度的isx9(2.5-40μm)处理24h后，干性相关的靶基因在转录水平的表达；
[0045]
图21是本发明实施例提供的hek293t(j)、hacat(k)和nih3t3(l)细胞分别用对照(dmso)或指定浓度的isx9(2.5-40μm)处理24h后，干性相关的靶基因在蛋白水平的表达；
[0046]
图22是本发明实施例提供的isx9和对照米诺地尔对c57bl/6j小鼠毛发生长的影响(a)小鼠的代表性照片显示；
[0047]
图23是本发明实施例提供的；(b)定量测量0-25天指定区域的毛发生长情况；
[0048]
图24是本发明实施例提供的(c)每组小鼠药物处理25天后再生毛发重量的分析；
[0049]
图25是本发明实施例提供的(d)每组小鼠皮肤毛囊的he染色；
[0050]
图26是本发明实施例提供的(e)每组小鼠皮肤毛囊的数量；
[0051]
图27是本发明实施例提供的(f)每组小鼠的背侧皮肤免疫组化检测总β-catenin、ki67和lgr5表达；
[0052]
图28是本发明实施例提供的isx9促进c57bl/6j小鼠皮肤wnt信号通路靶基因的表达；
[0053]
图29是本发明实施例提供的；免疫印迹分析药物isx9和米诺地尔处理小鼠第25天时wnt信号相关蛋白和干性相关蛋白和皮肤角质蛋白的表达水平。
具体实施方式
[0054]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0055]
isx9被确定为wnt/β-catenin信号通路的新型激动剂。isx9通过共价结合到axin1n端区域，并增强了lrp6-axin1相互作用。它上调了许多wnt靶基因和干性相关基因的表达。
[0056]
此外，本发明评估了isx9对c57bl/6小鼠毛发生长的影响。isx9通过wnt信号通路明显地促进毛发重新生长和诱导毛囊细胞从静止期过度到生长期。
[0057]
总而言之，本发明揭示了isx9可以通过促进lrp6和axin1的相互作用激活wnt/β-catenin信号通路，可能是脱发的有前途的治疗剂。本发明进一步调查isx9激活wnt/β-catenin信号通路的机制。
[0058]
本发明结果表明，isx9可以通过激活wnt信号通路来刺激毛囊的增殖并促进小鼠的毛发生长。
[0059]
本发明利用基于细胞的supertopflash报告系统筛选了已知的化合物文库。确定了带有异恶唑支架蛋白的小分子isx9是wnt/β-catenin信号传导的潜在激活剂(图1和图2)。
[0060]
为了确定isx9对wnt/β-catenin信号通路的增强作用，本发明用荧光素酶报告物supertopflash转染入hek293t细胞并且发现使用2.5-40μm的isx9处理后可以显著增强supertopflash的转录活性，并且表现出剂量依赖性。当isx9的剂量达到40μm时supertopflash的转录活性比正常情况显著增强。然而，isx9对含有突变tcf结合元件的阴
性对照报告基因的活性影响不大。典型的的wnt信号激活剂氯化锂(licl)如预期能够显著增加supertopflash报告基因的活性然而，isx9对结合了突变tcf-这类负性元件在报告基因下显示作用不明显。
[0061]
(图4)
[0062]
为了进一步确认isx9对wnt信号通路的影响，本发明使用人类角质细胞hacat进行supertopflash报告基因分析，isx9在hacat同样表现出带有剂量依赖性的激活作用，同时对superfopflash没有影响。这些结果表明isx9能够激活wnt/β-catenin信号通路。
[0063]
为了探索isx-9在wnt信号通路中的潜在作用靶点，本发明检测了hek293t，hacat还有nih3t3细胞中的activeβ-catenin,totalβ-catenin,phosphorylatedlrp6,totallrp6,ser9phosphorylatedgsk3β,totalgsk3β和ck1这些wnt信号通路的关键蛋白的影响。
[0064]
如图6所示，isx9以浓度依赖的方式大幅上调了活化β-catenin和总β-catenin的蛋白质水平，而对磷酸化lrp6、总lrp6、ser9、磷酸化gsk3β、总gsk3β和ck1ε水平几乎没有影响。总的来说，这些结果证明isx9激活wnt/β-catenin的方式主要是通过积累细胞内β-catenin，但是不会影响lrp-6和gsk3β的表达和活性。
[0065]
wnt刺激诱导lrp6磷酸化增强其与axin的结合是调节β-catenin稳定性的一个关键步骤。因此本发明在uas-tk-luc报告基因和gal4-lrp6-icd(lrp6胞内段)，vp16-axin1表达载体的双杂交体系中研究了lrp6与axin1的相互作用。本发明在转染gal4-lrp6-icd和vp16-axin1的hek293t细胞中观察到lrp6-icd和axin1的相互作用，并且isx9剂量依赖性的增强lrp6-icd和axin的结合(图7)。
[0066]
值得注意的是，licl对gal4-lrp6icd和vp16-axin1间的作用几乎不产生影响(图8)
[0067]
这些结果表明isx9可以增强lrp6与axin1之间的联系。为了进一步证实isx9对lrp6与axin1相互作用的影响。在转染了lrp6-v5与axin1-flag表达载体的hek293t细胞中使用anti-flagbeads进行免疫共沉淀。图9显示，isx9增强了lrp6与axin1的相互作用。同样isx9也增强了hek293t细胞和hacat细胞中内源的lrp6和axin1的相互作用。
[0068]
为了研究isx9增强lrp6和axin1之间蛋白质-蛋白质相互作用的机制，本发明进行了微量热涌动mst实验分析isx9与lrp6与axin1的结合情况。本发明表达并纯化了axin1的三个截短片段axin1-300(aa1
–
300)，axin301-521(aa301-521)，axin522-862(aa522-862)，以及lrp6胞内段。用不同浓度的isx9滴定荧光标记的axin1三个片段和lrp6胞内段的蛋白，所产生的微量热泳动谱结果显示，axin1-300与isx9有稳定的结合，结合常数kd值为595nm(图12)。然而，isx9与axin301-521(图13)、axin522-862(图14)或lrp6-icd(图15)之间没有相互作用。荧光光谱的结果也证明，isx9可以与纯化的axin1-300蛋白相互作用(图16)。质谱法更明确的验证了isx9与axin1-300之间的结合，axin1-300的分子量是31417.38da，本发明在加入isx9(233.44da)的axin1-300样本中检测到了31650.81da的峰。这表明isx9与axin1-300间的结合方式是共价结合(图17)。
[0069]
wnt/β-catenin信号通路对细胞干性的维持有重要的作用。通过real-time pcr和免疫印迹实验本发明发现isx9的处理不仅增加wnt信号通路靶基因axin2、lef1、fibronectin和survivin的表达(图18-19)，还增加干性标志物sox2,lgr5,twist1andoct4
的表达(图20-21)。这些结果表明isx9可能通过激活wnt/β-catenin通路来影响干性。
[0070]
wnt/β-catenin信号通路在毛囊的发育以及毛发生长的初级阶段发挥至关重要的作用。接下来本发明对isx9在小鼠毛发再生过程中的作用效果进行了评估。本发明使用米诺地尔作为阳性对照，7周的c57bl/6小鼠背部去毛后，isx9与米诺地尔局部皮肤涂抹给药。在第14天，第21天和25天时，与米诺地尔相比isx9对小鼠毛发生长有明显的促进作用(图22-24)。h&e染色组织病理学显示，与对照小鼠相比，isx9和米诺地尔组在第25天时处于生长期的毛囊数量显著增加(图25)，而对照小鼠的毛囊仍处于休止期。同样的，对于毛囊的定量分析也证实了isx9和米诺地尔组的毛囊数量比起对照组显著增多(图26)。这些结果证实了isx9可诱导毛囊从休止期过渡到生长期。
[0071]
接着本发明检测了isx9在小鼠wnt/β-catenin信号通路中的作用机制。免疫组织化学染色的结果证明isx9显著增加了活化的β-catenin，totalβ-catenin和干性相关靶基因lgr5的表达，同时促进增殖标志物ki-67的表达(图27)。此外，real-timepcr分析证实了isx9处理显著上调了wnt靶基因(lef1，axin2，fibronectin还有survivin)以及干性标记基因(sox2，lgr5，twist1以及oct4在转录水平的表达(图28)。在蛋白水平，本发明发现isx9治疗的小鼠皮肤中活化的β-catenin，totalβ-catenin，lef1，axin2，survivin，lgr5，sox2以及皮肤角质蛋白k7表达水平明显增加，但在米诺地尔以及溶剂对照组中没有观察到明显的变化(图29)。
[0072]
图1-图5：isx9在hek293t细胞中激活wnt/β-catenin信号。
[0073]
图1是wnt/β-catenin信号通路激活剂的筛选。hek293t细胞转染wnt信号通路荧光素酶报告基因(supertopflash)，用阳性对照licl和单个小分子化合物处理细胞，裂解细胞测定荧光活性，观察wnt信号通路的激活情况。
[0074]
图2是筛选得到wnt/β-catenin信号通路激活剂isx9的化学结构。
[0075]
图3是hek293t细胞中转染supertopflash或superfoppflash报告基因。转染24小时后，用对照(dmso)或isx9(2.5-40μm)处理细胞24小时，测定荧光素酶值并用β-gal活性归一化。
[0076]
图4是hek293t细胞中转染supertopflash或superfoppflash报告基因。转染24小时后，用对照(dmso)或licl(20and40mm)处理细胞24小时，测定荧光素酶值并用β-gal活性归一化。
[0077]
图5是hacat细胞中转染supertopflash或superfoppflash报告基因24小时。用对照(dmso)或isx9(2.5-40μm)处理细胞24小时，裂解细胞，测定荧光素酶值并用β-gal活性归一化。
[0078]
图6是isx9可提高活性β-catenin和总β-catenin的表达水平，但对lrp6和gsk3β的表达和活性影响不大。hek293t(a)、hacat(b)和nih3t3(c)细胞分别用对照(dmso)或增加剂量的isx9(2.5-40μm)处理24小时。westernblotting检测内源性活性β-catenin、总β-catenin、磷酸化lrp6、总lrp6、磷酸化gsk3β、总gsk3β和ck1ε的表达水平。
[0079]
图7是isx9通过增强axin1与lrp6的相互作用，激活wnt/β-catenin通路。(上图)本发明中使用的哺乳动物双杂交系统示意图。(下图)hek293t细胞中转染报告基因质粒uas-tk-luc，同时单独转染带有vp16-axin1的表达质粒或与gal4-lrp6一起转染。用不同浓度的isx9(5μm和10μm)处理转染细胞24小时，收集细胞裂解，然后测定荧光素酶活性。
[0080]
图8是hek293t细胞中转染报告基因质粒uas-tk-luc，同时单独转染带有vp16-axin1的表达质粒或与gal4-lrp6一起转染。用不同浓度的licl(20and40mm)处理转染细胞24小时，收集细胞裂解，然后测定荧光素酶活性。
[0081]
图9是将lrp6-v5和axin1-flag表达质粒共转染hek293t细胞24小时。转染细胞用对照(dmso)或isx9(5和10μm)处理再孵育24小时。用抗-flag磁珠免疫沉淀裂解液。western检测外源lrp6和axin1相互作用。
[0082]
图10是裂解对照和isx9处理过24小时的hek293t细胞，用对照igg或抗axin1抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。使用指定抗体进行免疫印迹，来检测内源lrp6和axin1相互作用。
[0083]
图11是裂解对照和isx9处理过24小时的hacat细胞，用对照igg或抗axin1抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。使用指定抗体进行免疫印迹，来检测内源lrp6和axin1相互作用。
[0084]
图12-图14：isx9通过共价结合到axin1的n端区域，促进lrp6-icd与axin1的结合。
[0085]
图12是用mst法分析荧光标记的axin1-300与isx9的结合。isx9的滴定范围为0.61nm～5μm。微量热泳信号的变化得出kd为595nm。
[0086]
图13是用mst法分析荧光标记的axin301-521与isx9的结合。
[0087]
图14是用mst法分析荧光标记的axin522-862与isx9的结合。
[0088]
图15是用mst法分析荧光标记的lrp6-icd与isx9的结合。
[0089]
图16是当axin1-300片段浓度增加(0～9mg/ml)时，isx9的发射光谱(λex＝405nm)。
[0090]
图17是在axin1-300和isx9之间形成的蛋白配体复合物的ms谱。蓝色箭头表示蛋白质axin1-300的分子量，红色箭头表示蛋白质配体复合物axin1-300-isx9的分子量，配体isx9的分子量为233.44。
[0091]
图18-图21isx9上调wnt靶基因和干性基因的表达
[0092]
图18是hek293t(a)、hacat(b)和nih3t3(c)细胞用对照(dmso)或指定浓度的isx9(2.5-40μm)处理24h。提取总rna，反转录获得cdna,real-time pcr检测axin2、lef1、fibronectin和survivin的mrna表达。
[0093]
图19是hek293t(d)、hacat(e)和nih3t3(f)细胞分别用对照(dmso)或指定浓度的isx9(2.5-40μm)处理24h。免疫印迹法检测axin2、lef1、survivin蛋白表达。
[0094]
图20是hek293t(g)、hacat(h)和nih3t3(i)细胞用对照(dmso)或指定浓度的isx9(2.5-40μm)处理24h。提取总rna，反转录获得cdna,real-time pcr检测干性相关的靶基因sox2,lgr5,twist1,和oct4的表达。
[0095]
图21是hek293t(j)、hacat(k)和nih3t3(l)细胞分别用对照(dmso)或指定浓度的isx9(2.5-40μm)处理24h。免疫印迹法检测sox2,lgr5,和twist1。
[0096]
图22-图27：isx9促进小鼠毛发再生。毛发生长处于静息期c57bl/6j小鼠(7周，雌)剃掉背部毛，将对照(50％[v/v]乙醇，30％水和20％丙二醇)，1％isx9或2％米诺地尔每日外涂用于背侧皮肤，持续25天。
[0097]
图22的(a)小鼠的代表性照片显示，在上述药物处理的过程中，毛发再生的情况。
[0098]
图23的(b)定量测量0-25天指定区域的毛发生长情况。
[0099]
图24的(c)每组小鼠药物处理25天后再生毛发重量的分析。
[0100]
图25的(d)每组小鼠皮肤毛囊的he染色。
[0101]
图26的(e)每组小鼠皮肤毛囊的数量。
[0102]
图27的(f)每组小鼠的背侧皮肤免疫组化检测总β-catenin、ki67和lgr5表达。
[0103]
图28是isx9促进c57bl/6j小鼠毛发再生相关标志物的表达。
[0104]
图29是免疫印迹分析药物处理小鼠第25天时磷酸化的lrp6、总lrp6、ck1ε、磷酸化的gsk3β、总gsk3β、活性β-catenin、总β-catenin、lef1、axin2、survivin、lgr5、sox2和keratin17的表达。
[0105]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。