一株整合端粒酶逆转录酶的CHO细胞株及其应用

一株整合端粒酶逆转录酶的cho细胞株及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株整合端粒酶逆转录酶的cho细胞株及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary,cho)已是fda和nmpa等药品监管部门认可度最高的生产生物技术药物的工程细胞。目前治疗性生物制品的治疗领域已不断扩展至慢性疾病和老年病，加之药品普惠大众的医保和个人支付方式的变化，产品销售价格已是市场扩张的主要限制性因素之一。监管部门对治疗性生物制品的质量和生产过程控制的要求快速提升，大幅度降低产品生产的“产成本”已经成为技术发展的关键瓶颈问题。延长cho工程细胞的生产周期是解决这一问题的方法之一。
3.在细胞培养过程中，细胞死亡分为三个方面，细胞凋亡，细胞衰老和机械损伤。其中细胞凋亡占比最大，通过分子手段来改善细胞凋亡情况，可以有效提高cho细胞的抗逆能力。目前研究较为清楚的凋亡途径，主要包括内质网压力诱导途径、膜受体通路及线粒体激活半胱天冬酶(caspases)蛋白的生化调节途径三种。wong等人在cho细胞批次和流加培养过程中对转录组进行分析，发现早期凋亡信号基因在培养后期的表达是存在差异的。因此促凋亡基因表达的稳定下调和抗凋亡基因表达的上调，使得cho细胞表现出更高抗细胞凋亡能力，可改善细胞培养和表达性能。
4.现有技术只是改善了细胞凋亡的情况，但对细胞衰老的改善没有研究。因此通过继续改善细胞抗衰老能力，以期延长细胞培养时间。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明构建一株整合端粒酶逆转录酶的cho细胞株，延长cho细胞的有效培养时间从而提高表达外源蛋白能力，该细胞株的应用为cho工程细胞株的构建提供技术基础。
6.本发明的第一个目的是构建一株整合了端粒酶逆转录酶的cho细胞株，所述cho细胞株可稳定增强表达端粒酶逆转录酶。
7.进一步地，所述的端粒酶逆转录酶来源于中国仓鼠卵巢细胞，其氨基酸序列如seq idno.1所示。
8.进一步地，编码所述的端粒酶逆转录酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.进一步地，所述的端粒酶逆转录酶定点整合于cho细胞基因组中。
10.进一步地，所述的端粒酶逆转录酶定点整合于cho细胞基因组中cdk6位点。进一步优选整合于cho细胞基因组中cdk6基因内含子区域。
11.进一步地，所述的cho细胞株以cho-k1细胞为出发细胞株。
12.本发明的第二个目的是提供所述的cho细胞株的构建方法，包括如下步骤：
13.s1、将编码端粒酶逆转录酶的基因构建到质粒上得到重组质粒；
14.s2、将重组质粒转染至cho宿主细胞中，并定点整合至表达位点；
15.s3、筛选成功整合并过表达端粒酶逆转录酶的细胞株。
16.进一步地，所述质粒为puc57-bxbi-tert质粒。
17.本发明的第三个目的是提供所述的cho细胞株在表达外源蛋白中的应用。
18.进一步地，所述应用是以所述cho细胞株为出发细胞株，将待表达的外源蛋白整合至cho细胞株内，进行外源蛋白表达。
19.本发明的有益效果是：
20.本发明以cho-k1为出发细胞株构建了tert过表达细胞株cho-k1-tert。对其进行流加培养，发现细胞株cho-k1-tert通过减缓细胞衰老和细胞凋亡，将最高活细胞密度从15
×
106cells/ml提高到了25
×
106cells/ml，培养时间从13d延长到了19d。并验证了其表达外源蛋白(hsa)的能力，hsa的最终表达量可以达到783mg/l，是以cho-k1为出发细胞株构建的cho-k1-hsa-7表达量的两倍左右。该细胞株的应用为cho工程细胞株的构建提供技术基础。
附图说明：
21.图1为四个位点整合tert流式分选结果；
22.图2为定点整合tert的细胞株流加培养生长情况；
23.图3为定点整合tert基因的cho-k1细胞株；a：cho-k1-tert流式分选结果；b：5’pcr结果；c：3’pcr结果；d:细胞株cho-k1-tert qpcr结果；
24.图4为cho-k1-tert细胞株摇瓶流加培养实验结果；a：cho-k1和cho-k1-tert细胞株细胞密度和细胞活率变化曲线；b：cho-k1和cho-k1-tert细胞株细胞生长曲线c：cho-k1和cho-k1-tert细胞株细胞对数生长期拟合曲线；
25.图5为流式细胞仪检测细胞株cho-k1-tert细胞周期结果；
26.图6为细胞株cho-k1-tert细胞凋亡和细胞衰老检测结果；a：cho-k1细胞凋亡结果；b：cho-k1-tert细胞凋亡结果；c：细胞衰老结果；
27.图7为cho-k1-tert细胞株表达外源蛋白hsa情况；a：流式分选结果；b：western blot检测结果，1：kt-hsa-3、2：kt-hsa-10、3：kt-hsa-19；c：摇瓶流加培养细胞密度和细胞活率变化曲线；d：外源蛋白(hsa)表达情况。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
29.涉及的检测方法：
30.一、细胞凋亡检测方法(annexin v-fitc/pi apoptosis detection kit，诺唯赞公司)：
31.在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(ps)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(ps)由脂膜内侧翻向外侧。annexin v是一种分子量为35-36kda的ca
2
依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因此annexin v被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
32.将annexin v进行绿色荧光(fitc)标记，以标记了的annexin v作为探针，利用荧
光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidium iodide，pi)是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，pi能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将annexin v与pi匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。具体操作步骤如下。
33.(1)样本染色
34.1、收集细胞：1,800rpm(300
×
g)、4℃离心5min，弃培养基上清；
35.2、洗涤细胞：用预冷的pbs洗涤细胞两次，每次均在1,800rpm(300
×
g)、4℃离心5min。
36.3、细胞重悬：加入100μl 1
×
binding buffer，轻轻吹匀至单细胞悬液。
37.4、细胞染色：加入5μl annexin v-fitc和5μl pi staining solution，轻轻吹匀；避光、室温(20～25℃)孵育10min；加入400μl 1
×
binding buffer，轻轻混匀。染色后样品在1h内用流式细胞仪检测。
38.(2)样品分析
39.流式细胞仪激发波长为488nm；fitc的绿色荧光在fl1通道检测；pi的红色荧光在fl2通道检测，每个样本采集10,000events。用flowjo等软件进行数据分析，fl1为横坐标，fl2为纵坐标，根据fitc和pi荧光值确定两荧光参数阴阳界限，划定十字门。实验中细胞可分为三个亚群：活细胞为双阴性(annexin v-fitc-/pi-)；早期凋亡细胞为annexin v-fitc单阳性(annexin v-fitc /pi-)；晚期凋亡细胞为annexin v-fitc和pi双阳性(annexin v-fitc /pi )。
40.二、β-半乳糖苷酶染色方法(细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，碧云天公司)：
41.绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老(senescence)状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况。衰老细胞通常体积变大，并表达在ph6.0时有高活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。因此通过检测细胞中是否有β-半乳糖苷酶的表达来判断细胞的衰老情况。具体操作方法如下。
42.1、离心收集细胞至1.5ml离心管内，用pbs或hbss洗涤1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。固定时可以在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结成团块。
43.2、离心，吸除细胞固定液，用pbs或hbss洗涤细胞3次，每次3分钟。
44.3、离心，吸除pbs或hbss，每管加入0.5-1毫升染色工作液。染色工作液的配制方法参考表1。
45.表1β-半乳糖苷酶染色液配制表
46.47.4、37℃孵育过夜。注意：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。
48.5、取部分染色后的细胞，滴加到载玻片上或6孔板内，普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以离心，去除染色工作液，然后加入1毫升pbs，4℃可以保存数天。如果离心，取细胞用于涂片，加上封片液封片后，4℃可以保存较长时间。注：如果有结晶形成，请使用70％乙醇进行洗涤处理。
49.三、细胞周期检测方法(细胞周期检测试剂盒，碧云天公司)：
50.碘化丙啶(propidium，简称pi)是一种双链dna的荧光染料。碘化丙啶和双链dna结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链dna的含量成正比。细胞内的dna被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行dna含量测定，然后根据dna含量的分布情况，可以进行细胞周期分析。碘化丙啶染色后，假设g0/g1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组dna的g2/m期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行dna复制的s期细胞的荧光强度为1-2之间。具体操作步骤如下
51.1.细胞样品的准备：1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞，并转移到
52.1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的pbs，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
53.2.细胞固定：加入1ml 0℃预冷70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定30分钟或更长时间。通常固定2小时或以上更能保证染色效果，固定12-24小时可能效果更佳。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的70％乙醇，以避免吸走细胞。加入约1ml0℃预冷的pbs，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μl左右的pbs，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
54.3.碘化丙啶染色液的配制：参考表2。
55.表2碘化丙啶染色液配制表
[0056][0057]
注：配制好的碘化丙啶染色液短时间内可以4℃保存，宜当日使用。
[0058]
4.染色：每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24小时内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。
[0059]
5.流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞dna含量分析和光散射分析。
[0060]
四、流加培养方法
[0061]
将悬浮驯化成功的重组细胞株按1
×
106cells/ml的密度，50ml的体积接种于三个
250ml的摇瓶中，加入cd基础培养基，置于37℃，5％co2，110r/min摇床上，从分瓶的第一天起，每天取相同体积的发酵液检测活细胞数、细胞粒径、活率，生化分析仪检测葡萄糖及乳酸的含量。第四天按每隔一天添加一次5％培养体积的feed 4补料培养基，糖量低于3.0g/l时添加葡萄糖的补料方式培养，当细胞活率低于85％时，结束流加培养实验。糖量换算公式如下：
[0062][0063]
实施例1：cho-k1细胞中定点整合并稳定表达tert位点的选择
[0064]
首先，通过cho细胞第三代测序结果库找到tert的cds序列(氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示)，通过基因合成(上海生工)构建tert重组质粒pcdna3.1-tert。以pcdna3.1-tert为模板，将tert序列构建到puc57-bxbi质粒上，得到构建重组质粒puc57-bxbi-tert。将重组质粒转染进cho-k1-2c6-lps、cho-k1-2b2-lps、cho-k1-1g11-lps和cho-k1-3g10-lps细胞中，其中2c6、2b2、1g11、3g10为研究室前期验证cho细胞基因组内可稳定表达外源蛋白的位点，位点信息如表3所示。压筛后流式分选得到亚克隆细胞株cho-k1-2c6-tert、cho-k1-2b2-tert、cho-k1-1g11-tert和cho-k1-3g10-tert，结果如图1所示。
[0065]
表3位点信息
[0066][0067]
随后将分选得到的细胞株进行摇瓶流加培养，观察定点整合tert基因对cho细胞培养性能的影响。将四株细胞按1
×
106cells/ml的密度接种到装有50ml培养基的250ml摇瓶中，每一天相同时间取样检测细胞密度和细胞活率，结果如图2所示。细胞株cho-k1-3g10-tert表现最佳，vcd达到了26
×
106cells/ml，与cho-k1相比提高了近一倍，培养时间也从原来的13d延长到了18d。cho-k1-2b2-tert和cho-k1-1g11-tert细胞株的结果类似，vcd达到了20
×
106cells/ml，与cho-k1相比增加了5
×
106cells/ml，培养时间也有所延长达到了16d。
[0068]
实施例2：定点整合并稳定表达tert的cho-k1细胞株(cho-k1-tert)的构建
[0069]
将重组质粒puc57-bxbi-tert转染进细胞cho-k1-3g10-lps细胞中。博来霉素压筛结束后进行流式分选，结果如图3中a所示。得到的单克隆细胞株经过pcr和qpcr得到阳性单克隆细胞株cho-k1-tert，结果如图3中b、c所示。5’pcr和3’pcr，在5000bp均出现目的条带，与实验设计结果相符，说明已经将tert整合到位点3g10处。然后通过qpcr检测tert的转录水平，结果如图3中d所示，与cho-k1相比，细胞株cho-k1-tert的转录水平提高了7-8倍，说明tert在构建成功的阳性克隆株中进行了增强表达。
[0070]
实施例3：细胞株cho-k1-tert培养性能
[0071]
将上述实验得到的细胞株进行了摇瓶流加培养实验。并检测了相关凋亡和衰老指
标，结果如图4所示。在整个流加培养过程中cho-k1-tert细胞株的最大细胞密度约为出发细胞株cho-k1的2.5倍，最高可以达到25
×
106cells/ml，总培养时间也从13d延长到了19d，结果如图4中a所示。随后对细胞株cho-k1-tert进行细胞周期测定，拟合后的生长曲线如图4中c所示，对其取对数后发现，细胞株cho-k1-tert在4h-48h期间属于对数生长期，细胞株cho-k1-tert线性拟合方程为y＝6.03035 0.01718x，r2＝0.98829，经计算细胞周期为17.5h比出发细胞株cho-k1缩短了4小时。
[0072]
实施例4：cho-k1-tert细胞株细胞周期检测
[0073]
对细胞株cho-k1-tert进行了细胞周期的检测，结果如图5，与出发细胞株cho-k1相比，cho-k1-tert的s期细胞占比有明显的增加。说明，细胞株cho-k1-tert在s期进行了更多的dna修复工作。此外，细胞株cho-k1-tert的g2/m期明显缩短，g0/g1期明显延长。再次说明，在cho细胞中增强tert的表达，可以加快细胞分裂进程，提高细胞分裂能力。
[0074]
实施例5：cho-k1-tert细胞株细胞凋亡和细胞衰老检测
[0075]
对细胞株cho-k1-tert抗细胞凋亡和细胞衰老的能力进行全面的评价。在流加培养过程中，取第7d、10d、13d、16d和19d的细胞进行β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老，取第6d、9d、12d、15d和18d的细胞进行细胞凋亡检测。结果显示，cho-k1-tert与cho-k1相比有较强的抗凋亡效果，如图6中a、b所示。在第12d时，cho-k1凋亡细胞占比达到了27.9％(早凋：25.5％，晚凋：2.42％)，cho-k1-tert的凋亡细胞占比仅为11.5％(早凋：2.06％，晚凋：9.46％)，与出发细胞株cho-k1相比凋亡细胞比例下降了65％。对细胞衰老的检测发现，cho-k1在第10d时衰老细胞的比例就超过了40％，cho-k1-tert在第13d时衰老细胞的比例才达到了40％，并且维持到了第16d(图6中c)。综上所述，cho-k1-tert与cho-k1相比具有更加优越的抗凋亡和抗衰老的能力。
[0076]
实施例6：cho-k1-tert细胞株表达外源蛋白能力的研究
[0077]
以上述实验得到的抗衰老细胞株cho-k1-tert(kt)为出发细胞株，利用crispr-cas9技术将hsa定点整合到cho-k1细胞loc103162981基因内部ncrna处，通过摇瓶流加培养检测抗凋亡细胞株kt表达外源蛋白的能力。细胞构建结果如图7所示。图7中a为流式分选结果，随机挑选三株单克隆细胞株kt-hsa-3、kt-hsa-10和kt-hsa-19进行western blot检测结果如图7中b所示。随后，将阳性单克隆细胞株kt-hsa-3和cho-k1-hsa-7(实验室之前构建)进行摇瓶流加培养。细胞生长情况如图7中c所示，kt-hsa-3的最大细胞密度可以达到18
×
106cells/ml，约为cho-k1-hsa-7的两倍，同时总培养时间也延长了3d。流加培养结束后，利用尿微量白蛋白检测试剂盒测定hsa的表达量，结果如图7中d所示。kt-hsa-3最终表达量约为783mg/l，约是cho-k1-hsa-7表达量的两倍。上述结果表明cho-k1-tert(kt)细胞株具有更高的细胞密度和更长的培养时间，表达外源蛋白的能力优于cho-k1细胞株。
[0078]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。