用于预防非洲猪瘟的腺病毒载体疫苗及其应用

id no.6所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
17.a13)与seq id no.6具有80％、85％或90％以上的同源性且与seq id no.6所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
18.所述p54(e183l)基因的核苷酸序列包含：
19.a21)seq id no.7；或
20.a22)将seq id no.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.7所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
21.a23)与seq id no.7具有80％、85％或90％以上的同源性且与seq id no.7所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
22.所述cd2v(ep402r)基因的核苷酸序列包含：
23.a31)seq id no.8；或
24.a32)将seq id no.8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.8所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
25.a33)与seq id no.8具有80％、85％或90％以上的同源性且与seq id no.8所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
26.所述p72(b646l)基因的核苷酸序列包含：
27.a41)seq id no.9；或
28.a42)将seq id no.9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.9所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
29.a43)与seq id no.9具有80％、85％或90％以上的同源性且与seq id no.9所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
30.所述p72 c(b602l)基因的核苷酸序列包含：
31.a51)seq id no.10；或
32.a52)将seq id no.10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.10所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
33.a53)与seq id no.10具有80％、85％或90％以上的同源性且与seq id no.10所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
34.优选地，所述核酸分子用于表达对非洲猪瘟病毒引起免疫原性的蛋白。
35.优选地，所述核酸分子用于在猪体内或猪源细胞内表达蛋白。
36.优选地，所述蛋白包含：p30(cp204l)蛋白、p54(e183l)蛋白、cd2v(ep402r)蛋白和p72(b646l)蛋白。
37.优选地，所述蛋白可在猪体或猪源细胞内：
38.诱导免疫应答；和/或
39.产生生物报告分子；和/或
40.产生用于检测的分子；和/或
41.调节基因功能；和/或
42.成为治疗性分子。
43.优选地，所述诱导免疫应答包括抗体与细胞介导的免疫应答。
44.本发明的第二个方面，提供一种重组载体组合，包含本发明第一个方面的核酸分
子。
45.优选地，所述重组载体组合包含表达本发明第一个方面的核酸分子中的各个基因的重组载体或重组载体组。
46.优选地，所述重组载体为将本发明第一个方面的核酸分子中的各个基因或多个基因插入表达载体得到的重组载体；即本发明第一个方面的核酸分子中的各个基因可以插入同一表达载体，也可以将本发明第一个方面的核酸分子的基因拆解为若干组别，分别插入于不同的表达载体中。各个基因单独或多个分布在各个重组载体上；也就是说，每个重组载体可以表达单独的基因，也可以表达多个基因偶联基因。
47.优选地，所述重组载体组为所述重组载体组成的重组载体组。
48.优选地，所述核酸分子的各个基因拆解为n组，分别插入于n个表达载体中，n＝2、3、4、或5。
49.优选地，所述核酸分子的各个基因拆解为3组，分别插入于不同的表达载体中。
50.优选地，所述核酸分子的各个基因拆解为如下3组：b1)p30(cp204l)基因和p54(e183l)基因；b2)cd2v(ep402r)基因；b3)p72(b646l)基因和p72 chaperone(b602l)基因，分别插入于3个表达载体中。
51.优选地，所述表达载体可以是相同或不同；进一步优选地，所述表达载体相同。
52.优选地，所述重组载体组包含：插入p30(cp204l)基因和p54(e183l)基因的重组载体、插入cd2v(ep402r)基因的重组载体和插入p72(b646l)基因和p72 chaperone(b602l)基因的重组载体。
53.优选地，所述重组载体组合可以调控本发明第一个方面的核酸分子的各个基因的表达。
54.优选地，本发明第一个方面的核酸分子的各个基因的转录方向与重组载体其他基因的转录方向相反，可以进一步保证表达所得到的蛋白具有更高的纯度和安全性。
55.优选地，所述表达载体包含dna质粒、rna表达质粒和病毒载体中的至少一种；进一步为病毒载体。
56.优选地，所述病毒载体包含腺病毒载体。
57.优选地，所述腺病毒载体包含ad1载体、ad2载体、ad3载体、ad4载体、ad5载体、ad6载体、ad7载体、ad8载体、ad9载体、ad10载体、ad11载体、ad12载体、ad13载体、ad14载体、ad15载体、ad16载体、ad17载体、ad18载体、ad19载体、ad20载体、ad21载体、ad22载体、ad23载体、ad24载体、ad25载体、ad26载体、ad27载体、ad28载体、ad29载体、ad30载体、ad31载体、ad32载体、ad33载体、ad34载体、ad35载体、ad36载体、ad37载体、ad38载体、ad39载体、ad40载体、ad41载体、ad42载体、ad43载体、ad44载体、ad45载体、ad46载体、ad47载体、ad48载体、ad49载体、ad50载体、ad51载体、ad52载体中的至少一种；进一步包含ad2载体。
58.优选地，所述腺病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。
59.优选地，所述腺病毒载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型腺病毒载体。
60.优选地，所述腺病毒载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型腺病毒空载体，即不携带任何外源基因的缺失e1和e3区基因的复制缺陷型腺病毒载体。
61.优选地，所述腺病毒载体为复制缺陷型ad2载体。
62.优选地，所述腺病毒载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad2载体。
63.优选地，所述腺病毒载体为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad2空载体，即不携带任何外源基因的缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad2载体。
64.本发明的第三个方面，提供一种重组病毒组合，包含本发明第一个方面的核酸分子和/或本发明第二个方面的重组载体组合。
65.优选地，所述重组病毒组合为将本发明第二个方面的重组载体组合中的重组载体或重组载体组分别包装得到的重组病毒或重组病毒组。
66.优选地，所述重组病毒组合，包含表达本发明第一个方面的核酸分子中的各个基因的重组病毒或重组病毒组。
67.优选地，所述重组病毒为将表达各个基因重组载体或表达多个基因的重组载体分别包装得到的重组病毒。
68.优选地，所述重组病毒组为由所述各个重组病毒组成的重组病毒组。
69.优选地，所述核酸分子的各个基因单独或多个分布在各个重组病毒上；也就是说，每个重组病毒可以表达单独的基因，也可以表达多个基因偶联基因。
70.优选地，所述重组病毒组合为包含3个重组病毒的重组病毒组。
71.优选地，所述重组病毒组合包含：表达p30(cp204l)基因和p54(e183l)基因的重组病毒、表达cd2v(ep402r)基因的重组病毒以及表达72(b646l)基因和p72 chaperone(b602l)基因的重组病毒。
72.优选地，所述重组病毒组合中可以为同类载体病毒组合，也可以为不同类载体病毒组合。
73.优选地，所述重组病毒组合为重组腺病毒组合。
74.本发明的第四个方面，提供一种重组细胞，包含本发明第一个方面的核酸分子和/或本发明第二个方面的重组载体组合。
75.优选地，所述重组细胞不包含繁殖材料。
76.本发明的第五个方面，提供提供本发明第一个方面的核酸分子、第二个方面的重组载体组合、第三个方面的重组病毒组合和/或本发明第四个方面的重组细胞在c1)～c5)中至少一种中的应用；
77.c1)制备预防非洲猪瘟病毒感染的药物；
78.c2)制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物；
79.c3)制备检测非洲猪瘟病毒的产品；
80.c4)制备诊断非洲猪瘟的产品；
81.c5)制备基因功能调节剂。
82.优选地，所述产品包含试剂、检测板、芯片、试纸、试剂盒中的至少一种。
83.本发明第六个方面的目的，在于提供一种产品，包含：本发明第一个方面的核酸分子、本发明第二个方面的重组载体组合、本发明第三个方面的重组病毒组合、本发明第四个方面的重组细胞中的至少一种。
84.优选地，所述产品为药物、试剂、检测板、芯片、试纸或试剂盒。
85.优选地，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：
86.d1)预防非洲猪瘟病毒感染；
87.d2)预防和/或治疗非洲猪瘟。
88.优选地，所述试剂、检测板、试纸、芯片或试剂盒具有e1)～e2)中至少一种功能：
89.e1)检测非洲猪瘟病毒；
90.e2)诊断非洲猪瘟。
91.优选地，所述药物还包含药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂、赋形剂中的至少一种，本领域技术人员可以根据具体的需要选择适合的佐剂、载体、稀释剂、赋形剂中的至少一种。
92.优选地，所述药物还包含至少一种对非洲猪瘟有预防和/或治疗作用的其他药物。
93.本发明的第七个方面，提供一种疫苗，包含：本发明第一个方面的核酸分子、本发明第二个方面的重组载体组合、本发明第三个方面的重组病毒组合、本发明第四个方面的重组细胞中的至少一种；进一步包含：本发明第三个方面的重组病毒组合。
94.优选地，所述重组病毒组合是包含3个重组病毒的重组病毒组，按照一定比例混合在一起直接使用或分批使用。
95.优选地，所述重组病毒组合包含：表达p30(cp204l)基因和p54(e183l)基因的重组病毒、表达cd2v(ep402r)基因的重组病毒以及表达72(b646l)基因和p72 chaperone(b602l)基因的重组病毒。
96.优选地，所述重组病毒组合中可以为同类载体病毒组合，也可以为不同类载体病毒组合。
97.优选地，所述重组病毒组合为重组腺病毒组合。
98.优选地，所述疫苗还包含佐剂、免疫增强剂、免疫调节剂、其他疫苗中的至少一种。
99.优选地，所述佐剂可以为如铝胶等盐类佐剂、不同的多糖佐剂、生物蛋白佐剂、核酸佐剂或纳米材料佐剂等。
100.优选地，所述疫苗的剂型包括但不限于口服剂、注射剂、气雾吸入剂等常见的疫苗剂型。
101.优选地，所述疫苗还可以和其他药物联用。
102.优选地，所述疫苗还包括至少一种对非洲猪瘟有预防和/或治疗作用的其他药物。
103.本发明的第八个方面，在于提供一种方法，包含向受试者施用有效量的本发明第六个方面的药物和/或第七个方面的疫苗；所述方法用于：
104.预防非洲猪瘟病毒感染；或
105.预防和/或治疗非洲猪瘟。
106.优选地，所述受试者为猪。
107.优选地，所述施用的次数为一次或多次；进一步为1～3次。
108.优选地，所述施用的方式包含肌内注射、口服、气雾吸入中的至少一种；进一步包含肌肉注射、鼻喷方式中的至少一种。
[0109]“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防非洲猪瘟感染或非洲猪瘟的有效量是指，能够有效预防、阻止或延迟非洲猪瘟的发生的量；治疗非洲猪瘟的有效量是指，能够有效缓解、减轻或治疗已有的非洲猪瘟的严重程度的量。
[0110]
本发明的有益效果是：
[0111]
本发明提供了一种核酸分子，包含优化后的以下基因：p30(cp204l)基因、p54(e183l)基因、cd2v(ep402r)基因、p72(b646l)基因和p72 chaperone(b602l)基因，该核酸
分子可以高效表达p30(cp204l)蛋白、p54(e183l)蛋白、cd2v(ep402r)蛋白、p72(b646l)蛋白，其免疫机体后可高效表达p30、p54、cd2v、p72抗原，产生针对非洲猪瘟病毒抗原特异性抗体和细胞免疫反应，可以有效保护机体免受非洲猪瘟病毒的侵染，可用于制备预防非洲猪瘟病毒引发的感染的药物、制备预防和/或治疗非洲猪瘟的药物、制备检测非洲猪瘟病毒的产品、制备诊断非洲猪瘟的产品、制备基因功能调节剂。
[0112]
进一步地，现有的疫苗主要是非洲猪瘟减毒活疫苗，其缺乏成熟的商业化生产细胞系，同时存在严重的安全问题，极易造成散毒风险，而本技术将上述核酸分子插入腺病毒载体中，构建腺病毒载体非洲猪瘟疫苗，大大提升了其安全性与产能。
附图说明
[0113]
图1是pad2-p30-p54质粒构建的流程图。
[0114]
图2是pad2-p30-p54的病毒纯化图。
[0115]
图3是pad2-cd2v质粒构建的流程图。
[0116]
图4是pad2-cd2v的病毒纯化图。
[0117]
图5是pga1-p72-p72c质粒构建的流程图。
[0118]
图6是pga1-p72-p72c的病毒纯化图。
[0119]
图7是转染ad2-p30-p54、ad2-cd2v、pad2-p72-p72c病毒的a549细胞的p30、p54、cd2v、p72抗原蛋白表达图。
[0120]
图8是ad2-asfv(ad2-p30-p54、ad2-cd2v和pad2-p72-p72c)诱导猪产生针对非洲猪瘟病毒p30、p54、cd2v、p72特异性结合抗体的结果图。
[0121]
图9是ad2-asfv(ad2-p30-p54、ad2-cd2v和pad2-p72-p72c)诱导猪产生针对非洲猪瘟病毒的细胞免疫反应的结果图。
[0122]
图10是ad2-asfv(ad2-p30-p54、ad2-cd2v和pad2-p72-p72c)的免疫保护效果结果图。
具体实施方式
[0123]
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
[0124]
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0125]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0126]
ad2空载体：缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad2载体，不携带任何外源基因。
[0127]
实施例1非洲猪瘟病毒p30、p54、cd2v、p72、p72 chaperone基因的优化
[0128]
非洲猪瘟病毒p30(cp204l)(qbh90581.1)、p54(e183l)(qbh90613.1)、cd2v(ep402r)(qbh90546.1)、p72(b646l)(qbh90570.1)、p72 chaperone(b602l)(qbh90568.1)基因的核苷酸序列依次如seq id no.1～5所示，真核细胞转录的mrna前体能够通过不同剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mrna剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质，这对蛋白的表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核苷酸序列进行密码子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点，保证了蛋白表
达的唯一性，减少了蛋白表达错误切剪的发生。优化后的非洲猪瘟病毒p30(cp204l)、p54(e183l)、cd2v(ep402r)、p72(b646l)、p72 chaperone(b602l)基因的核苷酸序列依次如seq id no.6～10所示。
[0129]
seq id no.1：p30(cp204l)
[0130]
atggattttattttaaatatatccatgaaaatggaggtcatcttcaaaacggatttaagatcatcttcacaagttgtgtttcatgcgggtagcctgtataattggttttctgttgagattatcaatagcggtagaattgttacgaccgctataaaaacattgcttagtactgttaagtatgatattgtgaaatctgctcgtatatatgcagggcaagggtatactgaacatcaggctcaagaagaatggaatatgattctgcatgtgctgtttgaagaggagacggaatcctcagcatcttcggagaacattcatgaaaaaaatgataatgaaaccaatgaatgcacatcctcctttgaaacgttgtttgagcaagagccctcatcggaggtacctaaagactccaagctgtatatgcttgcacaaaagactgtgcaacatattgaacaatatggaaaggcacctgattttaacaaggttattagagcacataattttattcaaaccatttatggaacccctctaaaggaagaagaaaaagaggtggtaagactcatggttattaaacttttaaaaaaaataagcttttatctcacctacatttaa。
[0131]
seq id no.2：p54(e183l)
[0132]
atggattctgaattttttcaaccggtttatccgcggcattatggtgagtgtttgtcaccagtcactacaccaagcttcttctccacacatatgtatactattctcattgctatcgtggtcttagtcatcattatcatcgttctaatctatctattctcttcaagaaagaaaaaagctgctgctattgaggaggaagatatacagtttataaatccttatcaagatcagcagtgggtagaagtcactccacaaccaggtacctctaaaccagctggagcgactacagcaagtgtaggcaagccagtcacgggcagaccggcaacaaacagaccagcaacaaacaaaccagttacggacaacccagttacggacagactagtcatggcaactggcgggccggcggccgcacctgcggccgcgagtgctcctgctcatccggctgagccttacacgacagtcactactcagaacactgcttcacaaacaatgtcggctattgaaaatttacgacaaagaaacacctatacgcataaagacctagaaaactccttgtaa。
[0133]
seq id no.3：cd2v(ep402r)
[0134]
atgataatacttatttttttaatattttctaacatagttttaagtattgattattgggttagttttaataaaacaataattttagatagtaatattactaatgataataatgatataaatggagtatcatggaatttttttaataattcttttaatacactagctacatgtggaaaagcaggtaacttttgtgaatgttctaattatagtacatcaatatataatataacaaataattgtagcttaactatttttcctcataatgatgtatttgatacaacatatcaagtagtatggaatcaaataattaattatacaataaaattattaacacctgctactcccccaaatatcacatataattgtactaattttttaataacatgtaaaaaaaataatggaacaaacactaatatatatttaaatataaatgatacttttgttaaatatactaatgaaagtatacttgaatataactggaataatagtaacattaacaattttacagctacatgtataattaataatacaattagtacatctaatgaaacaacacttataaattgtacttatttaacattgtcatctaactatttttatactttttttaaattatattatattccattaagcatcataattgggataacaataagtattcttcttatatccatcataacttttttatctttacgaaaaagaaaaaaacatgttgaagaaatagaaagtccaccacctgaatctaatgaagaagaacaatgtcagcatgatgacaccacttccatacatgaaccatctcccagagaaccattacttcctaagccttacagtcgttatcagtataatacacctatttactacatgcgtccctcaacacaaccactcaacccatttcccttacctaaaccgtgtcctccacccaaaccatgtccgccacccaaaccatgtcctccacctaaaccatgtccttcagctgaatcctattctccacccaaaccactacctagtatcccgctactacccaatatcccgccattatctacccaaaatatttcgcttattcatgtagatagaattatttaa。
[0135]
seq id no.4：p72(b646l)
[0136]
atggcatcaggaggagctttttgtcttattgctaacgatgggaaggccgacaagattatattggcccaagacttgcttaatagcaggatttctaacattaaaaatgtgaacaaaagttatgggaaacccgaccccgaacccactttgagtcaaatcgaagaaacacatttggttcattttaatgcgcattttaagccttatgttccagtagggtttgaatacaataaagtacgcccgcatacgggtacccccaccttgggaaacaagcttacctttggtattccccagtacggagactttttccatgatatggtgggccaccatatattgggtgcatgtcattcgtcctggcaggatgctccgattcagggcacggcccagatgggggcccatggtcagcttcaaacgtttcctcgcaacggatatgactgggacaaccaaacacctttagagggcgccgtttacacgcttgtagatccctttggaagacctattgtacccggcacaaagaatgcgtaccgaaacttggtttactactgcgaataccccggagaacgactttatgaaaacgtaagattcgatgtaaatggaaattccctggacgaatatagttcggatgtcacaacgcttgtgcgcaaattttgcatcccaggggataaaatgactggatataagcacttggtcggccaggaggtatcggtggagggaactagtggccctctcctatgcaacattcatgatttgcacaagccgcaccaaagcaaacctattcttaccgatgaaaatgatacgcagcgaacgtgcagccataccaacccgaaattcctttcacaacattttcccgagaactctcacaatatccaaacagcaggtaaacaagatattactcctattacggacgcaacgtatctggacataagacgtaatgttcattacagctgtaatggacctcaaacccctaaatactatcagccccctcttgcgctctggattaagctgcgcttttggtttaacgagaacgtgaaccttgctattccctcggtatccattcccttcggcgagcgctttatcaccataaagcttgcatcgcaaaaggatttggtgaatgaatttcctggactttttatacgccagtcgcgttttatacctggacgccccagtagacgcaatatacgctttaaaccatggtttatcccaggagtcattaatgaaatctcgctcacgaataatgaactttacatcaataacctgtttgtaacccctgaaatacacaacctttttgtaaaacgcgttcgattttccctgatacgtgtccataaaacgcaggtgacccacaccaacaataaccaccacgatgaaaaactaatgtctgctcttaaatggcccattgaatatatgtttataggattaaaacctacctggaacatctccgatcaaaatcctcatcaacaccgagattggcacaagttcggacatgttgttaacgccattatgcagcctactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatctatatcggatattagccccgttacgtatccgatcacattacctattattaaaaacatttccgtaactgctcatggtatcaatcttatcgataagtttccatcaaagttctgcagctcttacatacccttccactacggaggcaatgcaattaaaacccccgatgatccgggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaataccaacccagtggtcatattaacgtatccagagcaagagaattttatattagttgggacacggattacgtggggtctatcactacggctgatcttgtggtatcggcatctgctattaactttcttcttcttcagaacggttcagctgtgctgcgttacagtacctaa。
[0137]
seq id no.5：p72 chaperone(b602l)
[0138]
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[0139]
seq id no.6：p30(cp204l)
[0140]
atggacttcatcctgaacatcagcatgaagatggaggtgatcttcaagaccgacctgcgcagcagcagccaagtcgtcttccacgccggcagcctgtacaactggttcagcgtggagatcatcaacagcggccgcatcgtgaccaccgccatcaagaccctgctgagcaccgtgaagtacgacatcgtgaagagcgcccgcatctacgccggccagggctacaccgagcaccaggcccaggaggagtggaacatgatcctgcacgtgctgttcgaagaggaaaccgagagcagcgccagctccgagaacatccacgagaagaacgacaacgagaccaacgagtgcaccagcagcttcgagaccctgttcgagcaggagcccagcagcgaggtgcccaaggacagcaagctgtacatgctggcccagaagaccgtgcagcacatcgagcagtacggcaaggctccagacttcaacaaggtgatccgcgcccacaacttcatccagaccatctacggcacaccactgaaggaggaagagaaggaggtggtgcgcctgatggtgatcaagctgctgaagaagaagtgataaactag。
[0141]
seq id no.7：p54(e183l)
[0142]
atggacagcgagttcttccagcccgtctatcctcgccactacggcgagtgcctgagcccagtgaccacacccagcttcttcagcacccatatgtataccatcctgatcgccatcgtggtgctcgtcatcatcatcatcgtgctgatctacctgttcagcagccgcaagaagaaggccgctgcaatcgaggaggaggacatccagttcatcaatccctaccaagaccaacaatgggtggaagtcacacctcagccaggcaccagcaagcccgccggcgccaccaccgctagcgtgggcaagcctgtcaccggccgacctgccaccaaccgcccagccaccaacaagcccgtgaccgacaaccctgtgaccgaccgcctcgtcatggctacaggaggacctgctgcagctccagcagctgccagcgctccagcccaccctgccgagccctacaccaccgtgaccacccagaacaccgccagccagaccatgagcgccatcgagaacctgcgccagcgcaacacctacacccacaaggacctggagaacagcctgtgataaactag。
[0143]
seq id no.8：cd2v(ep402r)
[0144]
atgatcatcctgatcttcctcatcttcagcaatatcgtgctgagcatcgactattgggtttcctttaacaagaccatcatcctggactcaaacattacaaatgacaacaacgacatcaacggagttagctggaacttcttcaacaacagcttcaacaccctggccacctgcggcaaggccggcaacttctgcgagtgctccaactacagcacaagcatctacaacattaccaacaactgcagcctgaccatcttcccccacaacgacgtgttcgacacaacctaccaagtcgtctggaaccagatcatcaactacaccatcaagctgctgacccctgccacacctcccaacatcacctacaactgtaccaacttcctgatcacctgcaagaagaacaacggcaccaacaccaacatctacctgaacatcaacgacaccttcgtgaagtacaccaacgagagcatcctggagtacaactggaacaacagcaacatcaataacttcaccgccacctgcatcatcaacaacaccattagcaccagcaacgagaccaccctgatcaactgcacctacctgaccctgagcagcaactacttctacaccttcttcaagctgtactacatccctctgtccattatcatcggcatcaccatcagcatcctgctgatcagcatcatcaccttcctgagcctgcgcaagcgcaagaagcacgtggaggagatcgagagcccacctcccgagagcaacgagga
ggagcagtgccagcacgacgacaccacctccatccacgagcccagcccacgcgagcccctgctgcctaagccctacagccgctaccagtacaacacaccaatctactacatgcgaccaagcacccagccactgaatccattccctctccccaagccatgccctccacccaaaccttgcccaccacccaagccttgcccccctccaaagccgtgtccaagcgccgagagctacagcccccctaagcctctgcccagcattcctctcctgcccaacatcccacctctgagcacccagaacatcagcctgatccacgtggaccgcatcatctgataaactag。
[0145]
seq id no.9：p72(b646l)
[0146]
atggccagcggcggagccttctgcctgatcgccaacgacggcaaggccgacaagatcatcctggcccaggacctgctgaacagccgcatcagcaacatcaagaatgtcaacaagagctacggcaagcccgacccagagcctacactatcacagatagaggaaacccacctggtgcacttcaacgcccacttcaaaccatacgtgcccgtgggcttcgagtacaacaaggtgcgcccacacaccggcacacccacactgggcaacaagctgaccttcggcatcccacagtacggcgacttcttccacgacatggtcggccaccacatcctgggcgcctgccacagcagctggcaggacgctcccatccaaggcactagccagatgggcgctcacggccagctgcagaccttcccccgcaacggctacgactgggacaaccagacacctctggagggcgccgtgtacacactcgtggatcccttcggacggcccatcgtgcccggcaccaagaacgcctaccgcaacctggtgtactactgcgaataccccggcgaacgcctgtacgaaaacgtccgcttcgacgtgaacggcaacagcctggacgagtacagcagcgacgtgaccaccctcgtccgcaaattctgtattcctggcgacaaaatgaccggctacaagcacctcgtcggccaggaagtctccgtcgagggcaccagcggccctctgctgtgcaacatccacgacctgcacaagcctcaccagagcaagcccatcctgaccgacgagaacgacacccagcgcacctgcagccacaccaaccccaaattcctgagccagcacttcccagagaacagccacaacatccagaccgccggcaagcaggacatcacacccatcaccgacgccacctacctggacatccggcgcaacgtgcactacagctgcaacggcccccagacacccaaatactaccagccacctctggccctgtggatcaagctgcgcttctggttcaacgagaacgtgaacctggccattccctccgtctccatcccattcggcgagcgcttcatcaccatcaagctggccagccagaaggacctcgtcaacgagttccccggcctcttcgtgcgccagagccgcttcatcgccggccgacccagccgccgcaacatccgcttcaagccctggttcatccctggcgtgatcaacgagattagcctgaccaacaacgagctgtacatcaacaatctgtttgtgacacccgagatccacaacctgttcgtgaagcgcgtgcgcttcagcctgatccgcgtgcacaagacccaagttacccataccaacaacaaccaccacgacgagaagctgatgagcgctctgaagtggcccatcgagtacatgttcatcggcctgaagcccacctggaatattagcgaccagaacccacaccagcaccgcgactggcacaagttcggccacgtggtgaacgctatcatgcagcccacccaccacgccgagatcagcttccaggaccgcgacaccgccctgcccgacgcctgctccagcatttccgatatcagccccgtgacctaccccatcaccctgcccatcatcaagaacatcagcgtgaccgcccacggcatcaacctgatcgacaagttccccagcaagttctgcagcagctacatccccttccactacggcggcaacgccatcaagacacccgacgacccaggcgccatgatgatcaccttcgccctgaagcctcgcgaggagtaccagcccagcggccacatcaatgtcagccgcgcccgcgagttctacatcagctgggacaccgactatgtcggcagcatcaccaccgccgacctggtggtgagcgccagcgccatcaacttcctgctgctgcagaacgggtctgccgtgctgcgctacagcacctgataaactag。
[0147]
seq id no.10：p72 chaperone(b602l)
[0148]
atggccgagttcaacatcgacgagctgctcaagaacgtgctggaggacccgagcaccgagatcagcgaggagaccctcaaacagctgtaccagcgcaccaacccgtacaagcagttcaagaacgacagccgcgtggcattttgcagctttacaaatctgcgggagcagtacatccgccgcctgatcatgaccagcttcatcggctacgtgttcaaggccctccaagaatggatgccgagctacagcaagccgacccacaccaccaagacactgctgtccgagctcatcaccctggtggacaccctgaagcaggagaccaacgacgtgccgagcgagagcgtggtgaacaccatcctgtccatcgccgacagctgcaagacacagacccagaagagcaaagaggccaagaccaccatcgacagcttcctgcgcgagcacttcgtgttcg
acccgaacctgcacgcccagagcgcctacacctgtgccgataccaatgtggatacatgtgcttccatgtgcgccgacaccaacgtggacacctgcgccagcatgtgtgctgatacaaatgtcgatacttgtgctagcacctgcaccagcaccgagtacaccgacctggccgacccggagcgcatcccgctgcacatcatgcagaagaccctgaatgtgccgaacgagctgcaggccgacatcgacgccatcacccagaccccgcagggctaccgcgccgccgcccacatcctgcagaatattgaactgcaccagagcatcaagcacatgctggagaacccgcgcgccttcaagccgatcctgttcaacaccaagatcacccgctacctgagccagcacattccgcctcaagatacattttacaagtggaactactacatcgaggacaactacgaggagctgcgcgccgccaccgagagcatttacccggagaagccggacctggagttcgccttcatcatctacgacgtggtggacagcagcaaccagcagaaggtggacgagttctactacaaatataaggaccagatcttcagcgaggtctccagcatccagctgggcaactggaccctgctgggcagctttaaggccaaccgcgagcgctacaactacttcaaccagaacaacgagatcatcaagcgcatcctggaccgccacgaggaggacctgaagatcggcaaggaaatcctgcgcaacaccatctaccacaagaaagccaagaacatccaggagaccggcccggacgccccgggcctgagcatctacaacagcaccttccacaccgacagcggcatcaagggcctgctgagcttcaaggagctgaagaacctggaaaaggccagcggcaacatcaagaaggcccgcgagtacgacttcatcgacgactgcgaggagaagatcaagcagctgctgagcaaggagaacctgaccccggacgaggagagcgagctgatcaagaccaagaagcagctggacaacgccctggagatgctgaacgtgccggacgacaccatccgcgtggacatgtgggtgaacaacaacaacaagctggagaaggagatcctgtacaccaaggccgagctgtgataaactag。
[0149]
实施例2携带非洲猪瘟病毒抗原载体pad2-asfv的构建
[0150]
1、pad2-p30-p54的构建
[0151]
1.1、构建非洲猪瘟病毒p30-p54基因的穿梭质粒pga1-p30-p54
[0152]
以pcdna3.1-p30(将优化后的p30(cp204l)插入pcdna3.1的bamh i/ecor i之间)和pcdna3.1-p54(将优化后的p54(e183l)插入pcdna3.1的bamh i/ecor i之间)(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)质粒为模板，以p30-f和p30-r和p54-f和p54-r为引物，采用primer star mix(takara)pcr扩增得到目的片段p30片段和p54片段。
[0153]
其中，p30-f的序列为：taccgagctcggatccgccaccatggacttcatcctgaacat(seq id no.11)；p30-r的序列为：ccagcctgcttcagcagggagaagttggtggcgccagaaccgtttatcacttcttcttc(seq id no.12)；p54-f的序列为：cctgctgaagcaggctggcgatgtggaggagaaccctgggcccatggacagcgagttct(seq id no.13)；p54-r的序列为：atagaatagggccctctagactagtttatcacaggctgtt(seq id no.14)。
[0154]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃30s，28个循环；72℃5min，4℃保存。
[0155]
以pga1-egfp质粒(携带ad2e1区同源重组臂质粒，由广州恩宝生物医药科技有限公司保存)为模板，以cmv-r和bgh-f为引物，采用primer star mix(takara)pcr扩增得到载体骨架pga1。其中，cmv-r的序列为：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg(seq id no.15)；bgh-f的序列为：tctagagggccctattctatagtgtc(seq id no.16)。
[0156]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃30s，28个循环；72℃5min，4℃保存。
[0157]
将目的片段p30、p54和载体骨架pga1采用同源重组酶(vazyme)进行重组，得到携带p30和p54抗原基因的穿梭质粒pga1-p30-p54。
[0158]
1.2、构建携带非洲猪瘟p30、p54抗原基因的pad2-p30-p54。
[0159]
以pga1-p30-p54质粒为模板，以ad2-fv-f和ad2-fv-r为引物，pcr扩增得到携带同源重组臂的cmv-p30-p54-bgh目的片段，胶回收。
[0160]
其中，ad2-fv-f的序列为：agatggaatggtgccaatat(seq id no.17)；ad2-fv-r的序列为：gatacaccgtcttggtagtcct(seq id no.18)。
[0161]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃50s，28个循环；72℃5min，采用胶回收试剂盒回收目的片段，4℃保存。
[0162]
pad2δe1δe3(由广州恩宝生物医药科技有限公司保存)以snabi线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的cmv-p30-p54-bgh目的片段和线性化的pad2δe1δe3共转化bj5183，同源重组得到携带p30-p54基因的pad2-p30-p54质粒，技术流程如图1所示。
[0163]
1.3、ad2-p30-p54载体的拯救与生产
[0164]
按照常规方法，ad2-p30-p54以paci线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后4小时，加入2毫升含5％胎牛血清的dmem培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以od260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝od260
×
稀释倍数
×
36/基因组长度(kb)；病毒储存液于-80℃冻存。病毒纯化结果如图2所示。
[0165]
2、pad2-cd2v的构建
[0166]
2.1、构建非洲猪瘟病毒cd2v基因的穿梭质粒pga1-cd2v
[0167]
以pcdna3.1-cd2v(将优化后的cd2v(ep402r)插入pcdna3.1的bamh i/ecor i之间)(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)质粒为模板，以cd2v-f和cd2v-r为引物，采用primer star mix(takara)pcr扩增得到目的片段cd2v。
[0168]
其中，cd2v-f的序列为：gtaccgagctcggatccgccaccatgatcatcctgatcttcct(seq id no.19)；cd2v-r的序列为：ctatagaatagggccctctagactagtttatcagatgatgcg(seq id no.20)。
[0169]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃30s，28个循环；72℃5min，4℃保存。
[0170]
以pga1-egfp质粒(携带ad2e1区同源重组臂质粒，由广州恩宝生物医药科技有限公司保存)为模板，以cmv-r和bgh-f为引物，采用primer star mix(takara)pcr扩增得到载体骨架pga1。其中，cmv-r的序列为：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg(seq id no.15)；bgh-f的序列为：tctagagggccctattctatagtgtc(seq id no.16)。
[0171]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃30s，28个循环；72℃5min，4℃保存。
[0172]
将目的片段cd2v和载体骨架pga1采用同源重组酶(vazyme)进行重组，得到携带cd2v抗原基因的穿梭质粒pga1-cd2v。
[0173]
2.2、构建携带非洲猪瘟cd2v抗原基因的pad2-cd2v。
[0174]
以pga1-cd2v质粒为模板，以ad2-fv-f和ad2-fv-r为引物，pcr扩增得到携带同源重组臂的cmv-cd2v-bgh目的片段，胶回收。
[0175]
其中，ad2-fv-f的序列为：agatggaatggtgccaatat(seq id no.17)；ad2-fv-r的序列为：gatacaccgtcttggtagtcct(seq id no.18)。
[0176]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃50s，28个循环；72℃5min，采用胶回
收试剂盒回收目的片段，4℃保存。
[0177]
pad2δe1δe3(由广州恩宝生物医药科技有限公司保存)以snabi线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的cmv-cd2v-bgh目的片段和线性化的pad2δe1δe3共转化bj5183，同源重组得到携带cd2v基因的pad2-cd2v质粒，技术流程如图3所示。
[0178]
2.3、ad2-cd2v载体的拯救与生产
[0179]
按照常规方法，ad2-cd2v以paci线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后4小时，加入2毫升含5％胎牛血清的dmem培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以od260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝od260
×
稀释倍数
×
36/基因组长度(kb)；病毒储存液于-80℃冻存。病毒纯化结果如图4所示。
[0180]
3、pad2-p72-p72c的构建
[0181]
3.1、构建非洲猪瘟病毒p72-p72c基因的穿梭质粒pga1-p72-p72c
[0182]
以pcdna3.1-p72(将优化后的p72(b646l)插入pcdna3.1的bamh i/ecor i之间)和pcdna3.1-p72c(将优化后的p72 chaperone(b602l)插入pcdna3.1的bamh i/ecor i之间)(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)质粒为模板，分别以p72-f和p72-r、p72c-f和p72c-r为引物，采用primer star mix(takara)pcr扩增得到目的片段p72片段和p72c片段。
[0183]
其中，p72-f的序列为：cctccacatcgccacaggtcagcagggagcccctgccctcgtttatcaggtgctgtagc(seq id no.21)；p72-r的序列为：ccgagctcggatccgccaccatggccagcggcggagcctt(seq id no.22)；p72c-f的序列为：ctatagaatagggccctctagactagtttatcacagctcggc(seq id no.23)；p72c-r的序列为：gacctgtggcgatgtggaggagaaccctggccccatggccgagttcaacatcga(seq id no.24)。
[0184]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃30s，28个循环；72℃5min，4℃保存。
[0185]
以pga1-egfp质粒(携带ad2e1区同源重组臂质粒，由广州恩宝生物医药科技有限公司保存)为模板，以cmv-r和bgh-f为引物，采用primer star mix(takara)pcr扩增得到载体骨架pga1。其中，cmv-r的序列为：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg(seq id no.15)；bgh-f的序列为：tctagagggccctattctatagtgtc(seq id no.16)。
[0186]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃30s，28个循环；72℃5min，4℃保存。
[0187]
将目的片段p72、p72c和载体骨架pga1采用同源重组酶(vazyme)进行重组，得到携带p72和p72c抗原基因的穿梭质粒pga1-p72-p72c。
[0188]
3.2、构建携带非洲猪瘟p72、p72c抗原基因的pad2-p72-p72c
[0189]
以pga1-p72-p72c质粒为模板，以ad2-fv-f和ad2-fv-r为引物，pcr扩增得到携带同源重组臂的cmv-p72-p72c-bgh目的片段，胶回收。
[0190]
其中，ad2-fv-f的序列为：agatggaatggtgccaatat(seq id no.17)；ad2-fv-r的序列为：gatacaccgtcttggtagtcct(seq id no.18)。
[0191]
pcr程序为：98℃3min；98℃10s，60℃5s，72℃50s，28个循环；72℃5min，采用胶回
收试剂盒回收目的片段，4℃保存。
[0192]
pad2δe1δe3(由广州恩宝生物医药科技有限公司保存)以snabi线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的cmv-p72-p72c-bgh目的片段和线性化的pad2δe1δe3共转化bj5183，同源重组得到携带p72-p72c基因的pad2-p72-p72c质粒，技术流程如图5所示。
[0193]
3.3、ad2-p72-p72c载体的拯救与生产
[0194]
按照常规方法，ad2-p72-p72c以paci线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后4小时，加入2毫升含5％胎牛血清的dmem培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以od260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝od260
×
稀释倍数
×
36/基因组长度(kb)；病毒储存液于-80℃冻存。病毒纯化结果如图6所示。
[0195]
实施例3检测非洲猪瘟病毒抗原基因的表达
[0196]
用实施例2制备得到的ad2-p30-p54、ad2-cd2v、pad2-p72-p72c病毒分别侵染a549细胞，24h后收集细胞。按照常规的westernblot方法处理样品，并进行蛋白检测。可以看出疫苗候选株ad2-p30-p54、ad2-cd2v、pad2-p72-p72c样品中能够观察到非洲猪瘟病毒p30、p54、cd2v、p72蛋白的表达(如图7)，说明ad2-p30-p54、ad2-cd2v、pad2-p72-p72c疫苗候选株构建正确，可以成功表达p30、p54、cd2v、p72抗原蛋白。
[0197]
实施例4动物免疫原性评价
[0198]
8周商品猪分为2组，每组5只；第0天，疫苗组(ad2-asfv)肌注免疫均等实施例2制备的ad2-p30-p54、ad2-cd2v、pad2-p72-p72c(ad2-asfv，总剂量：1.5
×
10
10
vp/只)，对照组肌注免疫ad2-empty剂量：1.5
×
10
10
vp/只；第14天，前腔静脉取血并分离血清与pbmc。采用酶联免疫吸附测定(elisa)，以非洲猪瘟病毒的p30(ms-d102-01)、p54(ms-d104)、cd2v(ms-d103)、p72(ms-d101-03)蛋白(均购买于北京兆葵生物科技有限公司)为抗原检测血清中的抗体水平。具体操作为：
[0199]
(1)96孔板，每孔分别加50ng的p30、p54、cd2v、p72蛋白，4℃过夜，
[0200]
(2)吸掉上清，采用pbst洗3次，每孔加入200ul 5％bsa室温封闭2h；
[0201]
(3)pbst洗3次；每孔加入采用pbs以1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600和1:51200稀释的猪血清，37℃孵育2h；
[0202]
(4)加酶标抗体：加入100ul稀释后hrp标记igg二抗，37℃孵育2h；
[0203]
(5)pbst洗6-8次；
[0204]
(6)加底物液显色：加入100ul tmb显色；
[0205]
(7)终止反应：加入50ul 1m硫酸终止反应；
[0206]
(8)结果判定：测od值，od值控制在0.1-4。
[0207]
(9)实验结果表明(图8和图9)，ad2-asfv(ad2-p30-p54、ad2-cd2v、pad2-p72-p72c)能够诱导猪产生针对非洲猪瘟病毒p30、p54、cd2v、p72特异性结合抗体和细胞免疫反应。
[0208]
实施例5ad2-asfv的田间感染非洲猪瘟的免疫保护效果评价
[0209]
本实验在广东省鹤山市某猪场进行：将10周龄非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康商品小猪分成3组：第1组免疫低剂量均等实施例2制备的ad2-p30-p54、ad2-cd2v、pad2-p72-p72c的混合疫苗ad2-asfv(剂量为1.2*10
10
vp，n＝5)，第2组免疫高剂量均等实施例2制备的ad2-p30-p54、ad2-cd2v、pad2-p72-p72c的混合疫苗ad2-asfv(剂量为6*10
10
vp，n＝5)，第3组未免疫对照组(n＝10)，采用肌肉注射 鼻喷方式进行免疫((肌注与鼻喷剂量各一半)，并在初次免疫4周后进行相同剂量加强免疫，计观察各组动物的存活率。存活率结果显示(图10)，未免疫对照组在第6周时出现死亡，到第10周时7只猪死亡，存活率为30％；而低、高剂量腺病毒混合疫苗免疫组猪在10周后无死亡，存活率为100％；可见，本技术提供的混合疫苗ad2-asfv可以有效保护机体免受非洲猪瘟病毒的侵染。
[0210]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。