一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法

1.本发明属于固定化酶的制备技术领域，具体涉及一种可应用于蛋白质组学研究中的固定化胰蛋白酶制备方法。


背景技术：

2.酶是一种天然的生物催化剂，其具有反应条件温和、催化效率高、底物选择性好、环境友好等优点。与此同时，游离酶制剂也存在环境稳定性差、货架期短、难以被回收利用等诸多应用局限。酶的固定化技术通过采用物理或化学方法将酶限制在一定空间范围内，可以改善酶稳定性，同时可以对酶进行回收和再利用。此外，通过精心设计固定化方法和载体材料，酶的催化活性和底物专一性能够被最大程度保留。因此，发展良好的固定化酶近年来已被广泛应用在食品工业、环境保护和生物医药等领域。
3.基于质谱的鸟枪法蛋白质组学技术是蛋白质组学研究的主要手段之一，其技术流程是先将蛋白质组样品经位点特异性蛋白酶消化形成肽组，再进行高效液相色谱分离和质谱检测。而位点特异性蛋白酶对蛋白质样品的消化是质谱检测的前提和基础。胰蛋白酶是蛋白质组学研究中常用的一种丝氨酸蛋白酶。胰蛋白酶消化可产生含有一个碱性精氨酸或者赖氨酸结尾的短肽，比较适合肽段的碎裂，形成较强的b和y离子系列对，适于现有的鉴定算法。此外，该酶价格合理，在实践中得到了广泛应用。然而，液相胰蛋白酶具有自溶，解折叠以及自聚效应，使得天然酶在应用和储存期间催化活性迅速下降，并难以重复使用。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明旨在解决所述问题之一；提供一种可应用于蛋白质组学研究中的固定化胰蛋白酶制备方法。
5.在纳米材料中，金纳米粒由于其形态可控、光学性能优良和表面易修饰、生物相容性好的特点而被广泛应用与生物学、化学和医学等领域；其合成方法简单，且采用合适的有机化合物或生物配体对其表面修饰较为容易。在对纳米金层层自组装修饰过后，通过共价结合法将活性氨基酸残基共价连接到金纳米粒载体表面，能够实现胰蛋白酶稳定的固定化。共价结合法制备的胰蛋白酶-纳米金共聚物具有很强的稳定性，结合的固定化胰蛋白酶几乎不发生泄漏。胰蛋白酶的固定化较好地解决了天然酶在应用和储存期间的自溶自聚、催化活性下降、难以重复利用的问题。
6.为了实现基于技术目的，一种可应用于蛋白质组学研究中的固定化胰蛋白酶制备方法，具体步骤如下：
7.(1)首先将氯金酸溶解于去离子水中，得到氯金酸溶液；再将氯金酸溶液在一定温度条件下恒温加热回流一段时间，维持恒定的温度条件下，加入柠檬酸三钠溶液继续加热一段时间；停止加热后将其置于常温条件下搅拌后得到反应液，待反应液冷却至室温，即得到柠檬酸钠修饰的金纳米粒溶液；
8.(2)通过层层自组装方式对金纳米粒表面修饰。
9.(a)将步骤(1)得到的柠檬酸钠修饰的金纳米粒溶液进行离心，去除上清液，得到柠檬酸钠-金纳米粒固体，然后采用去离子水洗涤柠檬酸钠-金纳米粒，随后将其重新分散于等体积的去离子水中，得到纯化的柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液；
10.随后将柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液逐滴加入至聚烯丙基胺盐酸盐溶液中，避光并在20～40℃条件下搅拌10～60min后，离心洗涤以去除未反应的聚烯丙基胺盐酸盐，得到聚烯丙基胺盐酸盐修饰的金纳米粒，即氨基修饰的金纳米粒；将氨基修饰的金纳米粒经去离子水清洗后，重新分散于超纯水中，得到氨基修饰的金纳米粒分散液；
11.(b)将步骤(a)中得到的氨基修饰的金纳米粒溶液逐滴加入聚丙烯酸钠溶液中，避光在20～40℃条件下搅拌10～60min后，经离心洗涤以去除未反应的聚丙烯酸钠，得到羧基修饰的金纳米粒；再将羧基修饰的金纳米粒重新分散于磷酸盐缓冲液中，得到羧基修饰金纳米粒胶体溶液；
12.(3)向步骤(2)制备的羧基修饰的金纳米粒胶体溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液和n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，震荡反应10～30min后，逐滴加入至不同浓度的胰蛋白酶溶液中，在一定温度条件下，持续搅拌反应，反应后经离心洗涤，得到的固体产物为胰蛋白酶-金纳米粒，即得到以金纳米粒为载体的固定化胰蛋白酶。
13.优选的，步骤(1)中，所述氯金酸溶液的浓度为1～2mm；所述柠檬酸三钠溶液的浓度为2～3mm；所述一定温度条件为170℃，恒温加热回流的时间为10min；所述继续加热一段时间为10min；常温条件下搅拌的时间为60min。
14.优选的，步骤(1)中，氯金酸溶液中的氯金酸与柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠反应的摩尔比为1:(1～5)。
15.优选的，步骤(2)的(a)中，聚烯丙基胺盐酸盐溶液与柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液的体积比为1:(1～3)；所述聚烯丙基胺盐酸盐溶液的浓度10～20mg/ml。
16.优选的，步骤(2)的(a)中，将氨基修饰的金纳米粒重新分散于超纯水中，得到氨基修饰的金纳米粒分散液的浓度为1～10nm。
17.优选的，步骤(2)的(b)中，所述聚丙烯酸钠溶液的浓度10～20mg/ml；氨基修饰的金纳米粒溶液与聚丙烯酸钠溶液的体积比为1:1；羧基修饰金纳米粒胶体溶液的浓度为1～10nm；其中磷酸盐缓冲液的浓度为20mm，ph为6.8。
18.优选的，步骤(3)中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液的浓度为12mm；所述n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为60mm；所述胰蛋白酶浓度为1mg/ml～10mg/ml。
19.优选的，步骤(3)中，所述修饰后的纳米金胶体溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和胰蛋白酶溶液的用量关系为760μl：20μl：20μl：200μl；一定温度条件为25℃，持续搅拌反应的时间为1～5h。
20.性能测定：
21.取胰蛋白酶-金纳米粒重新分散于1ml的碳酸氢铵缓冲液(ph 8.5)中，制备胰蛋白酶-金纳米粒的10倍浓缩溶液；采用此浓缩液在37℃的条件下对模型蛋白质肌红蛋白消化水解，水解后通过离心的方式去除固定胰蛋白酶-金纳米粒从而终止反应，即可得到经固定化胰蛋白酶解后的多肽片段产物，通过采用高效液相色谱-串联质谱技术对肌红蛋白消化液检测，进而对蛋白质进行定性定量分析。
22.在本发明的可选实施案例中，所述的胰蛋白酶-金纳米粒对蛋白质的酶解研究中，固定化酶与肌红蛋白的摩尔比为1:(20～200)，所述对蛋白质水解反应时间为5min～20h。
23.有益效果：
24.(1)本发明采用聚烯丙基胺盐酸盐和聚丙烯酸钠对金纳米粒层层自组装修饰，两种修饰剂所带有的多量电荷显著提升了金纳米粒在溶液中的稳定性。此外，聚丙烯酸钠对金纳米粒修饰后使其表面带有大量羧基，为胰蛋白酶的固定提供大量结合位点，增加了酶固载量。
25.(2)本发明限定了氯金酸与柠檬酸三钠反应的摩尔比为1:(1～5)其比例是有重要影响的，直接关系到金纳米粒的尺寸大小，如果比例过低会导致合成的金纳米粒尺寸过小，过小的粒径可能阻塞酶活性位点，影响固定化酶的活性；比例过高则会导致金纳米粒尺寸过大，减弱酶-金纳米粒分散性。
26.此外，本发明还限定了聚烯丙基胺盐酸盐和聚丙烯酸钠两种修饰剂的用量，反应过程中两种修饰剂的浓度过低，修饰后引入的羧基量少，导致固载酶量减少；浓度过高则导致形成的聚合物修饰层较厚且可能形成一定孔隙，陷入孔隙内部的酶则无法发挥其作用。
附图说明
27.图1为实施例1中制备的柠檬酸钠-金纳米粒、氨基修饰的金纳米粒、羧基修饰的金纳米粒和胰蛋白酶-金纳米粒的动态光散射(dls)和zeta电位的测量结果。
28.图2为采用胰蛋白酶-金纳米粒对肌红蛋白水解前和水解后的质谱总离子流图；上图为采用胰蛋白酶-金纳米粒对肌红蛋白水解前的肌红蛋白溶液的总离子流图，下图为胰蛋白酶-金纳米粒对肌红蛋白水解后生成的肽段混合液的总离子流图。
29.图3为蛋白酶解过程中使用不同的胰蛋白酶与肌红蛋白用量比例对测序覆盖度的影响结果图。
具体实施方式
30.为下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，并不用于限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1：
32.(1)反应开始前，先将25.25mg氯金酸溶解于50ml去离子水中，溶液在170℃加热条件下回流10min后，保持恒定条件，向溶液中加入6.25ml浓度为2.28mm的柠檬酸三钠溶液，继续加热反应10min后，停止加热，将其置于常温条件下搅拌60min，使反应液温度冷却至室温，即得到柠檬酸钠修饰的金纳米粒溶液，溶液保存于4℃，备用。
33.(2)随后对金纳米粒进行层层自组装修饰，首先采用聚烯丙基胺盐酸盐作为金纳米粒的第一层修饰剂。
34.(a)将柠檬酸钠修饰的金纳米粒溶液离心洗涤，除去未反应的柠檬酸钠，重新分散于等体积的去离子水中，得到纯化的柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液；
35.在持续搅拌的条件下，将10ml的柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液逐滴加入到10ml的
20mg/ml聚烯丙基胺盐酸盐溶液中，在避光25℃的条件下搅拌反应30min后，在12000rpm转数下离心15min，通过离心去除未反应的聚烯丙基胺盐酸盐，得到氨基修饰的金纳米粒固体。
36.经去离子水清洗后，将氨基修饰的金纳米粒重新分散于10ml超纯水中，得到氨基修饰的金纳米粒分散液，浓度为4.8nm。
37.(b)将10ml氨基修饰的金纳米粒分散液中逐滴加入到10ml的20mg/ml的聚丙烯酸钠溶液，避光在25℃的条件下搅拌30min后，离心洗涤以去除未反应的聚丙烯酸钠，得到羧基修饰的金纳米粒固体。随后将羧基修饰的金纳米粒重新分散于10ml的20mm磷酸盐缓冲液(ph 6.8)中，得到胶体溶液浓度为4.0nm。
38.(3)固定化胰蛋白酶的制备
39.分别配置浓度为12mm的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液和浓度为60mm的n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，其中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液需现用现配。
40.向760μl的羧基修饰金纳米粒胶体溶液中分别加入20μl的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和20μl的n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，震荡反应20min后，将羧基修饰金纳米粒胶体溶液逐滴加至200μl的不同浓度的胰蛋白酶溶液中(1mg/ml～10mg/ml)，在25℃的条件下持续搅拌反应2h。
41.采用12000rpm转数离心10min，用去离子水洗涤以去除未反应的胰蛋白酶，得到的固体产物为胰蛋白酶-金纳米粒，即得到以金纳米粒为载体的固定化胰蛋白酶。随后将胰蛋白酶-金纳米粒重新分散于1ml的20mm磷酸盐缓冲液(ph 6.8)中，得到分散液，储存于4℃，备用。
42.实施例2：胰蛋白酶-金纳米粒的表征
43.对每一步表面修饰后得到的金纳米粒进行表征，采用紫外分光光度法测定纳米金粒的等离子体共振(spr)吸收峰，测定波长范围在300nm到800nm，以监测纳米颗粒的大小变化和分散状态。柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液的spr吸收峰的波长为527nm，而经双层修饰后的金纳米粒溶液的spr吸收峰波长528nm，表明金纳米粒的尺寸有一定变化，且分散性良好。此外，本发明还采用动态光散射技术(dls)表征金纳米粒的粒径分布情况，通过测定金纳米粒表面的zeta电位来表征金纳米粒的稳定性，每次测量都在173
°
的背向散射检测模式下进行。以上实验中的每个样品均用水稀释5倍，且平行三次测定。
44.如图1所示，图中citrate-gnp代表柠檬酸钠-金纳米粒，gnp/pah代表氨基修饰的金纳米粒，gnp/pah/paa代表羧基修饰的金纳米粒，trypsin-gnp代表胰蛋白酶-金纳米粒。其中citrate-gnp的平均水合直径为34nm，其zeta电位为-44.4mv；经聚烯丙基胺盐酸盐修饰后，粒径增加至133nm，由于修饰后金纳米粒表面带有大量氨基，使得其zeta电位变为 60.5mv；经过聚丙烯酸钠的第二层修饰后，金纳米粒的粒径增加至134nm，增加幅度较小，主要是由于聚丙烯酸钠通过与聚烯丙基胺盐酸盐的静电相互作用被修饰到金纳米粒表面，静电作用较强，结合非常紧密，导致表面修饰的高分子聚合物的体积存在一定程度上的压缩，引起的粒径变化不明显；由于表面带有大量的羧基基团，其zeta电位变为-42.5mv；最后，胰蛋白酶固载到金纳米粒表面后，其粒径增大至182nm，zeta电位为-35.9mv。
45.实施例3：固定化胰蛋白酶量的测定
46.胰蛋白酶固定化反应后，离心沉淀胰蛋白酶-金纳米粒，并用超纯水对纳米粒洗涤3次，收集上清液和胰蛋白酶-金纳米粒的洗涤液，用bradford法测定上清液和洗涤液中未结合的胰蛋白酶与考马斯亮蓝g-250染液反应后的吸光度，从而计算未固定的胰蛋白酶浓度。计算初始胰蛋白酶的总量和未反应酶量的差值即得到固定化胰蛋白酶的酶量。
47.具体测定过程：首先，配置考马斯亮蓝g-250染液，将10mg考马斯亮蓝g-250溶于5ml的95％乙醇中，加入10ml的85％的磷酸，然后用去离子水补充至100ml。
48.配置标准胰蛋白酶溶液0.01～1mg/ml，加入染液并与胰蛋白酶反应5min后，分别在595nm和465nm波长下测定各管对应吸光度，采用595nm和465nm下吸光度的比值为纵坐标，制作标准曲线。
49.向200μl胰蛋白酶固定化后上清液、洗涤液和空白缓冲溶液中分别加入5ml染料结合溶液，作用5min后，溶液由红棕色变为蓝色，分别595nm和465nm下测定样品吸光度，计算两种吸光度的比值，利用标曲对未固定的胰蛋白浓度进行计算；最终得到固定的胰蛋白浓度值为1.8μmol/l。
50.实施例4：胰蛋白酶-金纳米粒对蛋白质的酶解研究
51.首先，将肌红蛋白溶解于去离子水中，制得浓度为1mg/ml蛋白储备液。
52.向100μl的肌红蛋白溶液中加入10μl浓度为80mm的尿素和10μl浓度为50mm的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，加热至60℃，反应30min，破坏蛋白质结构中的二硫键。
53.冷却至室温后，向反应液中继续加入10μl浓度为150mm的碘乙酰胺，室温下避光反应30min。
54.随后，取10ml的胰蛋白酶-金纳米粒，经离心除去上清液后，重新分散于1ml的碳酸氢铵缓冲液(ph 8.5)中，即得到胰蛋白酶-金纳米粒的10倍浓缩溶液。
55.将浓缩后的胰蛋白酶-金纳米粒溶液与肌红蛋白混合成不同酶与蛋白摩尔比的溶液(从1:20到1:200)，水解反应温度为37℃，蛋白质水解反应时间分别控制在5min～20h。
56.将反应液离心，取上清液用0.22μm的滤膜过滤后进样到液-质联用系统中进行测定。
57.采用高效液相色谱-电喷雾离子源-时间飞行串联质谱技术对蛋白质酶解产物进行分析。
58.以phenomenex aeris peptide c18(3.6μm 150x 2.1mm id)为液相色谱柱，流动相采用0.1％的甲酸水溶液(a)和含0.1％甲酸的乙腈溶液(b)进行梯度洗脱，流速采用0.3ml/min，进样体积为10μl，对蛋白质酶解产物进行分离。
59.采用mascot ms/ms对所得的质谱数据结果进行搜库比对。
60.图2显示了采用胰蛋白酶-金纳米粒对肌红蛋白水解前和水解后的质谱总离子流图，水解前在图中保留时间7.18min的位置可以找到肌红蛋白峰，利用bio tool kit插件重构qtof高分辨数据得到蛋白分子量为16951.7，确定此峰为肌红蛋白峰。水解后，7.18min位置的峰强减弱，强度极低，同时在保留时间为2.5～7min之间出现大量的多肽片段峰，由此说明肌红蛋白已被胰蛋白酶-金纳米粒高效地水解。因此，附图2说明本发明制备的固定化胰蛋白酶具有高效的蛋白水解力，可应用于蛋白质组学研究中。
61.图3显示的是对蛋白酶解过程中胰蛋白酶与肌红蛋白(myb)用量比例的优化结果，在肌红蛋白与固定化胰蛋白酶的摩尔比为20的时候，通过mascot ms/ms搜库比对得到的肌
红蛋白测序覆盖度最高，达到了40％以上；此外，经比较发现，在所有的用量比例条件下，利用固定化酶水解产物的测序覆盖度均显著高于使用游离酶的水解产物，这主要是由于游离胰蛋白酶本身的自溶导致对结果造成的干扰。因此，以上结果说明固定化胰蛋白酶在蛋白质的分析应用中，可以提供更准确的蛋白测序覆盖度结果，有效地避免了游离酶在酶解蛋白过程中产生的自溶效应。
62.综上所述，本发明所述的固定方法在反应原理层面、固定化材料选用、反应修饰剂用量比例选择、蛋白质研究的应用效果等方面均具有明显的优势。所制备的胰蛋白酶-金纳米粒尺寸较小，可提供类似于游离酶的分散性能，对蛋白质的水解效率高，但却有效地避免了游离酶在酶解蛋白过程中产生的自溶，可应用于蛋白质组学研究中。
63.说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。