一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法

技术特征：
1.一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)首先将氯金酸溶解于去离子水中，得到氯金酸溶液；再将氯金酸溶液在一定温度条件下恒温加热回流一段时间，维持恒定的温度条件下，加入柠檬酸三钠溶液继续加热一段时间；停止加热后将其置于常温条件下搅拌后得到反应液，待反应液冷却至室温，即得到柠檬酸钠修饰的金纳米粒溶液；(2)通过层层自组装方式对金纳米粒表面修饰：(a)将步骤(1)得到的柠檬酸钠修饰的金纳米粒溶液进行离心，去除上清液，得到柠檬酸钠-金纳米粒固体，然后采用去离子水洗涤柠檬酸钠-金纳米粒，随后将其重新分散于等体积的去离子水中，得到纯化的柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液；随后将柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液逐滴加入至聚烯丙基胺盐酸盐溶液中，避光并在20～40℃条件下搅拌10～60min后，离心洗涤以去除未反应的聚烯丙基胺盐酸盐，得到聚烯丙基胺盐酸盐修饰的金纳米粒，即氨基修饰的金纳米粒；将氨基修饰的金纳米粒经去离子水清洗后，重新分散于超纯水中，得到氨基修饰的金纳米粒分散液；(b)将步骤(a)中得到的氨基修饰的金纳米粒溶液逐滴加入聚丙烯酸钠溶液中，避光在20～40℃条件下搅拌10～60min后，经离心洗涤以去除未反应的聚丙烯酸钠，得到羧基修饰的金纳米粒；再将羧基修饰的金纳米粒重新分散于磷酸盐缓冲液中，得到羧基修饰金纳米粒胶体溶液；(3)向步骤(2)制备的羧基修饰的金纳米粒胶体溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液和n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，震荡反应10～30min后，逐滴加入至不同浓度的胰蛋白酶溶液中，在一定温度条件下，持续搅拌反应，反应后经离心洗涤，得到的固体产物为胰蛋白酶-金纳米粒，即得到以金纳米粒为载体的固定化胰蛋白酶。2.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氯金酸溶液的浓度为1～2mm；所述柠檬酸三钠溶液的浓度为2～3mm。3.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一定温度条件为170℃，恒温加热回流的时间为10min；所述继续加热一段时间为10min；常温条件下搅拌的时间为60min。4.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，步骤(1)中，氯金酸溶液中的氯金酸与柠檬酸三钠溶液中柠檬酸三钠反应的摩尔比为1:(1～5)。5.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，步骤(2)的(a)中，聚烯丙基胺盐酸盐溶液与柠檬酸钠-金纳米粒胶体溶液的体积比为1:(1～3)；所述聚烯丙基胺盐酸盐溶液的浓度10～20mg/ml。6.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，步骤(2)的(a)中，将氨基修饰的金纳米粒重新分散于超纯水中，得到氨基修饰的金纳米粒分散液的浓度为1～10nm。7.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，步骤(2)的(b)中，所述聚丙烯酸钠溶液的浓度10～20mg/ml；氨基修饰的金纳
米粒溶液与聚丙烯酸钠溶液的体积比为1:1；羧基修饰金纳米粒胶体溶液的浓度为1～10nm；其中磷酸盐缓冲液的浓度为20mm，ph为6.8。8.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液的浓度为12mm；所述n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液的浓度为60mm；所述胰蛋白酶浓度为1mg/ml～10mg/ml。9.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述修饰后的纳米金胶体溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和胰蛋白酶溶液的用量关系为760μl：20μl：20μl：200μl。10.根据权利要求1所述的一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法，其特征在于，步骤(3)中，一定温度条件为25℃，持续搅拌反应的时间为1～5h。

技术总结
本发明属于固定化酶的制备技术领域，具体涉及一种可应用于蛋白质组学研究的固定化胰蛋白酶制备方法；本发明采用两种带相反电荷的聚电解质对柠檬酸钠-金纳米粒表面进行层层自组装修饰，两种修饰剂带有大量电荷显著提升了金纳米粒在溶液中的分散性和稳定性；通过共价键合方法将胰蛋白酶固定于金纳米粒表面。采用此方法制备的胰蛋白酶-纳米金共聚物具有很强的稳定性，固定化的胰蛋白酶几乎不发生泄漏。此外，制备过程中经聚丙烯酸钠修饰后的金纳米粒表面带有大量的羧基，提供了高量的胰蛋白酶固定结合位点，显著增加了酶的固载量。本发明胰蛋白酶的固定化较好地解决了天然酶在应用和储存期间的自溶自聚、催化活性下降、难以重复利用的问题。复利用的问题。复利用的问题。


技术研发人员：刘思瑶 周晨光 杨星杰 肖鹏 常睿琛
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2022.11.22
技术公布日：2023/3/3