一种检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的引物及试剂盒

一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的引物及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的引物及试剂盒，属于生物传感技术领域。


背景技术：

2.慢性粒细胞白血病，简称慢粒(chronic myelocytic leukemia,cml)，是一类(约95％以上)因染色体易位t(9；22)形成bcr/abl融合基因后编码表达酪氨酸蛋白激酶而导致粒细胞异常增生的恶性血液病之一。因断裂点不一，bcr/abl融合可产生e19a2、e14a2、e1a2和e13a2四种转录本，其中e14a2(b2a2)和e13a2(b3a2)是较为常见的两种转录本，表达经典的p210融合蛋白。bcr/abl融合基因是一个慢性粒细胞白血病的临床治疗的重要靶标。对bcr/abl融合基因的准确检测有利于慢性粒细胞白血病早期诊断和精准诊疗。
3.目前，bcr/abl融合基因检测的方法主要是实时荧光定量pcr，但是，该方法在检测速度、成本和可便携性等方面存在着诸多缺陷，单一的检测模式也在一定程度上影响了其用于bcr/abl检测的准确性，使其难以发展为各级临床机构上可常规开展的bcr/abl检测的准确、可靠诊断工具。
4.因此，急需开发出一种准确度高的、可靠的bcr/abl检测方法。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的引物及试剂盒，可以有效解决上述问题。
6.本发明是这样实现的：
7.一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的引物，包括lcr引物cp，sp，t1，t2，其核苷酸序列如seq id no:1-seq id no:4所示，或如seq id no:5-seq id no:8所示。
8.一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的试剂盒，包括上述的引物。
9.在一实施例中，所述试剂盒还包括链霉亲及素修饰的磁珠。
10.在一实施例中，所述试剂盒还包括抗6-羧基荧光素抗体标记的辣根过氧化物酶、过氧化氢及tmb。
11.一种慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的扩增方法，在目的基因存在的情况下，采用上述的引物进行连接酶链式反应。
12.在一实施例中，所述连接酶链式反应的反应条件：65℃2min；94℃1min，30个循环。
13.在一实施例中，所述连接酶链式反应的反应体系为5μl cp(0.1μm)、5μl sp(0.1μm)、5μl t1(0.1μm)、5μl t2(0.1μm)、0.2μl ampligase(5u/μl)、10μl reaction buffer(10
×
)、10μl目标基因溶液与59.8μl的tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)。
14.本发明的有益效果是：
15.本发明的引物用于bcr/abl融合基因的lcr反应具有以下优点：(1)其检测限低至
4.5
×
10-20
m(100μl反应体系中含有2个拷贝目标基因)，与传统的实时荧光定量pcr相媲美；(2)可区分单碱基错配，完全互补链的信号是单碱基错配信号的40倍以上；(3)所需引物用量少(nm水平)，相比于传统方法所需的μm水平，引物用量可降低2～3个数量级。
16.本发明的引物可以用于慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的多模式检测(荧光-比色-电化学)。其特点是利用目标核酸启动连接酶链式反应消耗引物(cp、sp、t1、t2)，得到首尾分别标记有生物素和6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，fam)的dna双链扩增产物，利用生物素与链霉亲和素间的特异性结合将扩增产物固定到包被有链霉亲和素修饰的磁珠(magnetic beads，mbs)上，经磁性分离后可直接进行流式细胞术检测，也可以通过结合抗6-羧基荧光素抗体标记的辣根过氧化物酶(6-carboxyfluorescein antibody labeled-horse radish peroxidase，anti-fam-hrp)，得到hrp-dsdna-mbs复合物，通过辣根过氧化物酶催化过氧化氢(h2o2)氧化3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺(3,3’,5,5
’‑
tetramethylbenzidine，tmb)反应进行电化学、比色法检测，从而实现对目标核酸的超灵敏和交叉验证检测。所构建的多模式生物传感平台，具有灵敏度高、可靠性强、简便和成本低等优点，有望成为慢性粒细胞白血病早期诊断、精准诊疗的强有力工具。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
18.图1为基于连接酶链式反应的功能性磁珠载体的多模式传感方法的原理图。
19.图2为本发明实施例3提供的平均荧光强度(mfi)与目标基因标准品浓度之间的线性关系图(以b3a2为例)。
20.图3为本发明实施例4提供的吸光度(od)与目标基因标准品之间的线性关系图(以b3a2为例)。
21.图4为本发明实施例5提供的电流值与目标基因标准品之间的线性关系图(以b3a2为例)。
22.图5为本发明实施例6提供的传感器的特异性考察：完全互补链(target)与单碱基错配链(t-mut、c-mut和g-mut)、三碱基错配链及空白的电流响应结果比较。所用dna链浓度为10-14
m(以b3a2为例)。
具体实施方式
23.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本
发明保护的范围。
24.在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
25.本发明实施例提供一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的引物，包括lcr引物cp，sp，t1，t2，其核苷酸序列如seq id no:1-seq id no:4所示，或如seq id no:5-seq id no:8所示。用此引物可以对目的基因进行连接酶链式反应而扩增。
26.本发明实施例提供一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的试剂盒，包括上述的引物。用此引物对bcr/abl融合基因进行连接酶链式反应而扩增后，便于对bcr/abl融合基因的检测。
27.在一实施例中，所述试剂盒包括上述引物，还包括链霉亲及素修饰的磁珠。使用该试剂盒可以利用目标核酸启动连接酶链式反应消耗上述引物，得到头尾分别标记有生物素和6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，fam)的dna双链扩增产物，利用生物素与链霉亲和素间的特异性结合将扩增产物固定到包被有链霉亲和素的磁珠(magnetic beads，mbs)上，经磁性分离后可直接进行流式细胞术检测bcr/abl融合基因。
28.在一实施例中，所述试剂盒包括上述引物，还包括链霉亲及素修饰的磁珠，进一步还包括抗6-羧基荧光素抗体标记的辣根过氧化物酶、过氧化氢及tmb。使用该试剂盒，利用目标核酸启动连接酶链式反应消耗上述引物，得到头尾分别标记有生物素和6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，fam)的dna双链扩增产物，利用生物素与链霉亲和素间的特异性结合将扩增产物固定到包被有链霉亲和素的磁珠(magnetic beads，mbs)上，可以通过结合抗6-羧基荧光素抗体标记的辣根过氧化物酶(6-carboxyfluorescein antibody labeled-horse radish peroxidase，anti-fam-hrp)，得到hrp-fam-dsdna-mbs复合物，通过辣根过氧化物酶催化过氧化氢(h2o2)氧化3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺(3,3’,5,5
’‑
tetramethylbenzidine，tmb)反应进行电化学、比色法检测，从而实现对bcr/abl融合基因的超灵敏和交叉验证检测。
29.本发明实施例提供一种慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的扩增方法，在目的基因存在的情况下，采用上述的引物cp，sp，t1，t2进行连接酶链式反应。
30.在一实施例中，所述连接酶链式反应的反应条件：65℃2min；94℃1min，30个循环。
31.在一实施例中，所述连接酶链式反应的反应体系为5μl cp(0.1μm)、5μl sp(0.1μm)、5μl t1(0.1μm)、5μl t2(0.1μm)、0.2μl ampligase(5u/μl)、10μl reaction buffer(10
×
)、10μl目标基因溶液与59.8μl的tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)。
32.实施例1
33.连接酶链式反应对目标核酸的指数级扩增
34.为实现bcr-abl融合基因的高灵敏度检测，本发明设计了4条dna引物用于连接酶链式反应，其核苷酸序列见表1(b2a2型融合基因)和表2(b3a2型融合基因)。
35.cml检测目标序列选择及lcr扩增引物设计如下：
36.(1)cml特异性目标序列的选择
37.所检测的目标是bcr/abl融合基因，bcr基因断裂点集中在外显子e13/e14附近的
主要区域(major bcr,m-bcr)、第1个内含子的次要区域(minor bcr,m-bcr)、外显子e19和e20之间的μ区域(μ-bcr)这三个区域，abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr/abl融合可产生e19a2、e14a2、e1a2和e13a2四种转录本。慢性粒细胞白血病的bcr基因断裂点常位于m-bcr，主要产生e13a2(b2a2)和e14a2(b3a2)两种转录本。通过genebank分别查找人的bcr基因的13号/14号外显子序列、abl基因的2号外显子序列和bcr/abl的e13a2和e14a2的融合基因序列，然后进行序列比对，即可确定融合位点及附近的序列。
38.(2)lcr扩增引物设计
39.确定了融合位点及附近的序列之后，此序列的互补链即为cdna，作为检测的目标基因序列。考虑lcr中ampligase最佳活性温度范围、dna探针半解链温度(tm)，确定所需引物的长短并合成相应官能团修饰的cp、sp、t1和t2四条引物：cp的5’端修饰生物素(biotin)；sp的5’端磷酸化，3’端修饰荧光素(fam)；t2的5’端磷酸化，保证扩增效率的最大化和单碱基错配区分的能力。
40.在目标基因存在的情况下，cp和sp与目标基因杂交，形成含有缺口的dna双链，耐热dna连接酶ampligase催化缺口处磷酸二酯键的形成，得到连接产物cp-sp，热变性后目标基因和连接产物分开，目标基因可再次作为cp和sp的模板进行连接反应，而连接产物cp-sp可作为t1和t2的模板，形成新的连接产物t1-t2(即目标基因)。因此，从第二个热循环开始，每经历一个热循环连接产物的数量理论上增加一倍，从而实现对目标基因进行指数级扩增，得到大量头尾分别标记有锚定基团(生物素)和信标基团(6-羧基荧光素)的dna双链。
41.本实施例所用的ampligase和reaction buffer购买于美国lucigen公司，lcr引物(cp、sp、t1、t2)由上海生工生物有限公司提供合成服务。
42.所述的连接酶链式反应对目标基因核酸的指数级扩增中涉及到的所有脱氧核糖核苷酸序列，包括lcr引物cp、sp、t1、t2以及目标t如表1和表2所示。
43.表1
44.45.表2
[0046][0047][0048]
lcr反应产物的制备：将5μl cp(0.1μm)、5μl sp(0.1μm)、5μl t1(0.1μm)、5μl t2(0.1μm)、0.2μl ampligase(5u/μl)、10μl reaction buffer(10
×
)、10μl目标基因溶液与59.8μl的tris-hcl缓冲液(ph＝7.4)充分混匀，放入pcr仪进行扩增，反应条件：65℃，2min-94℃1min，30个循环。反应完成后，4℃保存备用。
[0049]
实施例2
[0050]
功能性磁珠载体的构建
[0051]
(1)将链霉亲和素修饰磁珠母液(10mg/ml)温和振荡，使其分散均匀后，取0.4μl于0.2ml的离心管中。
[0052]
(2)加入100μl磁珠清洗缓冲液并涡旋混匀后放置于小型磁力架上，待磁珠在离心管一侧聚集成团后，弃去缓冲液。
[0053]
(3)重复步骤(2)两次，加入50μl的lcr反应产物重悬磁珠并涡旋混匀，室温下旋转组装30min，将离心管放置于小型磁力架上，待磁珠在离心管一侧聚集成团后，弃去反应液。重复步骤(2)三次清洗磁珠，得到fam-dsdna-mbs复合物，4℃备用。
[0054]
本实施例所用的链霉亲和素修饰磁珠(dynabeadstm m-270streptavidin)购买于赛默飞世尔科技有限公司。
[0055]
实施例3
[0056]
流式细胞术检测
[0057]
加入100μl的去离子水重悬步骤(4)得到的fam-dsdna-mbs复合物，混匀后放置于流式细仪进样口，在488nm激光激发下，通过fl1(fitc/fam，530
±
15nm)通道(检测每个mbs的荧光信号。参数设置如下：fl1检测器的电压设置为470v，放大器增益值为1，激光功率为15mw，样品电压为6.4v，每个样本收集10000个mbs，对不同浓度的目标基因标准品进行检测，通过平均荧光强度(mfi)与目标基因标准品浓度之间的关系，绘制工作曲线，如图2所示。
[0058]
从图2中可以看出，测定目标dna浓度在10-14
m～10-9
m范围内，mfi值与目标链浓度的对数值lgctarget(m)呈良好的线性关系，检测限为7fm(》3σ)，说明所构建的流式细胞术检测方法有较宽的线性范围(6个数量级)和较高的灵敏度。
[0059]
实施例4
[0060]
比色法检测
[0061]
加入100μl 0.5u/ml抗6-羧基荧光素抗体标记的辣根过氧化物酶(anti-fam-hrp)重悬实施例2得到的fam-dsdna-mbs复合物，室温下旋转孵育15min。磁性分离后弃去反应液，重复实施例2的步骤(2)三次清洗磁珠，加入10μl的pbs重悬，得到hrp-fam-dsdna-mbs复合物，加入90μl tmb底物(含有h2o2)溶液中，混匀后显色5min，加入50μl的2m硫酸溶液终止反应，溶液由蓝色变为黄色，使用酶标仪测定其在450nm波长处的吸光度，通过吸光度与目标基因标准品浓度之间的关系，绘制工作曲线，如图3所示。
[0062]
本实施例使用的抗6-羧基荧光素抗体标记的辣根过氧化物酶购买于上海罗氏制药有限公司，3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺(含有h2o2)底物溶液购买于美国neogen公司。
[0063]
从图3中可以看出，测定目标dna浓度在10-17
m～5
×
10-15
m范围内，od值与目标链浓度ctarget呈良好的线性关系，检测限为10am(》3σ)，说明所构建的比色生物传感器有较高的灵敏度。
[0064]
实施例5
[0065]
电化学检测
[0066]
磁式玻碳电极(mgce，3mm直径)用0.05μm al2o3粉末的混悬液在麂皮上打磨抛光3min，然后依次在无水乙醇和超纯水中各超声1min以除去残留的al2o3粉末及其他杂质，最后氮气吹干。紧接着，将实施例4得到的hrp-fam-dsdna-mbs复合物滴于磁式玻碳电极的表面，在磁场的作用下将mbs-dsdna-hrp复合物固定于电极表面，得到mbs修饰电极。使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以上述mbs修饰电极为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在tmb(含有h2o2)溶液中采用时间-电流曲线进行测定，电位为0.1v，扫描时间100s，通过第100s获得的稳定电流值与目标基因标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线，如图4所示。
[0067]
从图4中可以看出，在浓度为10-19
m～5
×
10-16
m(a图)与10-15
m～10-12
m(b图)的两个范围内，对应的电流信号值分别与目标链浓度的对数值lgctarget(m)呈良好的线性关系，最低检测限为0.045am(相当于100μl反应体系中含有2个拷贝目标，》3σ)，说明所构建的电化学生物传感器具有极高的灵敏度，可以与传统的实时荧光定量pcr相媲美。
[0068]
实施例6
[0069]
传感器的特异性考察：
[0070]
按照实施例1的方法进行连接酶链式反应，所添加的目标基因链分别为完全互补链(target)、单碱基错配链(t-mut、c-mut和g-mut)和三碱基错配链，所用dna链浓度为10-14
m(以b3a2为例)；然后按照实施例5的方法进行电化学检测。将它们各自的电流响应及空白的电流响应结果进行比较。实验结果如图5所示。
[0071]
从图5中可以看出，完全互补链的信号是单碱基错配信号的40倍以上，说明所构建的电化学生物传感器具有很高的特异性，可用于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)的分析。
[0072]
实施例7
[0073]
一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的试剂盒，包括上述的引物，还包括链霉亲及素修饰的磁珠及其他必要试剂。
[0074]
实施例8
[0075]
一种检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的试剂盒，包括上述的引物，还包括链霉亲及素修饰的磁珠，进一步还包括抗6-羧基荧光素抗体标记的辣根过氧化物酶、过氧化氢及tmb及其他必要试剂。
[0076]
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。