一种颗粒酶B靶向激活型PET显像探针及其应用的制作方法

一种颗粒酶b靶向激活型pet显像探针及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种颗粒酶b靶向激活型pet显像探针及其应用，属于化学技术领域。


背景技术：

2.免疫疗法是指用药物或者生物制剂调节机体免疫状态，使机体对疾病产生恰当的免疫应答，从而防治疾病的一种治疗方法。近年来，免疫疗法在癌症临床治疗方面应用较广，但是由于癌症患者个体差异较大，临床客观响应率低于30％。另一方面，免疫疗法常伴随着严重的免疫相关不良反应，包括过敏性反应、炎症性反应，甚至导致患者死亡。因此，纵向监测和可视化免疫应答对于在免疫治疗过程中更好地对患者进行分层和选择应答者十分关键，对免疫治疗响应率进行准确评估具有重要意义。
3.颗粒酶b是一种由细胞毒性t细胞和自然杀伤(nk)细胞内的细胞质颗粒释放的丝氨酸蛋白酶，在靶细胞中诱导程序性细胞死亡或凋亡。当细胞毒性t淋巴细胞(ctls)识别目标细胞时，颗粒酶从溶质中释放出来，进入目标细胞的细胞质，通过直接和间接的层压处理和激活、线粒体渗透或针对其他核蛋白，有效地诱导细胞凋亡。人类有五种不同的颗粒酶，a、b、h、k和m，其中颗粒酶b是最丰富的类型，具有高细胞毒性功效和各种诱导细胞凋亡机制。颗粒酶b在t细胞介导细胞死亡的两个主要途径之一中起作用，是参与t细胞细胞毒性作用最突出的丝氨酸蛋白酶之一。因此，通过监测颗粒酶b的表达水平，能够识别免疫作用中的细胞毒性t细胞的活性，进而准确评估肿瘤免疫治疗早期疗效。
4.分子影像技术能够运用影像学手段显示组织水平、细胞和亚细胞水平的特定分子，反映活体状态下分子水平变化，对其生物学行为在影像方面进行定性和定量研究。因此，通过分子影像技术对免疫治疗过程中肿瘤部位的颗粒酶b表达水平进行有效监测，对准确评估肿瘤免疫治疗早期疗效具有重要意义。然而，目前用于检测颗粒酶b表达水平的pet分子探针缺乏足够的灵敏度和靶向性。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种靶向颗粒酶b的分子探针，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列或者颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列；
6.当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列时，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有如下所示结构：
[0007][0008]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列时，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有如下所示结构：
[0009][0010]
其中，r为放射性核素标记基团。
[0011]
在本发明的一种实施方式中，所述放射性核素标记基团为
68
ga、[
18
f]alf、[
18
f]ambf3、
64
cu或
89
zr。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为[
18
f]ambf3时，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有如下所示结构：
[0013][0014]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为[
18
f]alf时，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有如下所示结构：
[0015][0016]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为[
18
f]ambf3时，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有如下所示结构：
[0017][0018]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为[
18
f]alf时，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有如下所示结构：
[0019][0020]
在本发明的一种实施方式中，当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为
68
ga时，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有如下所示结构：
[0021][0022]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为
68
ga时，所述靶向颗粒酶b的分子探针具有如下所示结构：
[0023][0024]
在本发明的一种实施方式中，当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为[
18
f]ambf3时，所述靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物具有如下所示结构：
[0025][0026]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为[
18
f]ambf3时，所述靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物具有如下所示结
构：
[0027][0028]
在本发明的一种实施方式中，当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为
68
ga时，所述靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物具有如下所示结构：
[0029][0030]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为
68
ga时，所述靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物具有如下所示结构：
[0031][0032]
本发明还提供了一种制备上述靶向颗粒酶b的分子探针的方法，当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为[
18
f]ambf3时，所述方法包括如下步骤：
[0033]
步骤一：将化合物iefd和化合物sf经缩合反应，得到化合物
ⅰ‑
1；
[0034]
步骤二：将化合物
ⅰ‑
1经脱保护反应，得到化合物
ⅰ‑
2；
[0035]
步骤三：将化合物
ⅰ‑
2、烷基氨甲基三氟化硼、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和六氟磷酸四(乙酸)铜(i)经click点击缩合反应，得到靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物m-1；
[0036]
步骤四：对靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物m-1进行放射性核素标记，得到靶向颗粒酶b的分子探针；
[0037]
所述化合物iefd具有如下所示结构：
[0038][0039]
所述化合物sf具有如下所示结构：
[0040][0041]
所述化合物
ⅰ‑
1具有如下所示结构：
[0042][0043]
所述化合物
ⅰ‑
2具有如下所示结构：
[0044][0045]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为[
18
f]ambf3时，所述方法包括如下步骤：
[0046]
步骤一：将化合物iepd和化合物sf经缩合反应，得到化合物
ⅱ‑
1；
[0047]
步骤二：将化合物
ⅱ‑
1经脱保护反应，得到化合物
ⅱ‑
2；
[0048]
步骤三：将化合物
ⅱ‑
2、烷基氨甲基三氟化硼、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和六氟磷
酸四(乙酸)铜(i)经click点击缩合反应，得到靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物h-1；
[0049]
步骤四：对靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物h-1进行放射性核素标记，得到靶向颗粒酶b的分子探针；
[0050]
所述化合物iepd具有如下所示结构：
[0051][0052]
所述化合物
ⅱ‑
1具有如下所示结构：
[0053][0054]
所述化合物
ⅱ‑
2具有如下所示结构：
[0055][0056]
本发明还提供了一种制备上述靶向颗粒酶b的分子探针的方法，当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为
68
ga时，所
述方法包括如下步骤：
[0057]
步骤一：将化合物iefd-zl和化合物cbt-1经缩合反应，得到化合物
ⅲ‑
1；
[0058]
步骤二：将化合物
ⅲ‑
1经脱保护反应，得到化合物
ⅲ‑
2；
[0059]
步骤三：将化合物
ⅲ‑
2与2-(ethyldisulfanyl)pyridine经缩合反应，得到化合物
ⅲ‑
3；
[0060]
步骤四：将化合物
ⅲ‑
3和羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸经缩合反应，得到靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物m-2；
[0061]
步骤五：对靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物m-2进行放射性核素标记，得到靶向颗粒酶b的分子探针；
[0062]
所述化合物iefd-zl具有如下所示结构：
[0063][0064]
所述化合物cbt-1具有如下所示结构：
[0065][0066]
所述化合物
ⅲ‑
1具有如下所示结构：
[0067][0068]
所述化合物
ⅲ‑
2具有如下所示结构：
[0069][0070]
所述化合物
ⅲ‑
3具有如下所示结构：
[0071][0072]
当具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列，且放射性核素标记基团为
68
ga时，所述方法包括如下步骤：
[0073]
步骤一：将化合物iepd-zl和化合物cbt-1经缩合反应，得到化合物
ⅳ‑
1；
[0074]
步骤二：将化合物
ⅳ‑
1经脱保护反应，得到化合物
ⅳ‑
2；
[0075]
步骤三：将化合物
ⅳ‑
2与2-(ethyldisulfanyl)pyridine经缩合反应，得到化合物
ⅳ‑
3；
[0076]
步骤四：将化合物
ⅳ‑
3和羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸经缩合反应，得到靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物h-2；
[0077]
步骤五：对靶向颗粒酶b的分子探针的前体化合物h-2进行放射性核素标记，得到靶向颗粒酶b的分子探针；
[0078]
所述化合物iepd-zl具有如下所示结构：
[0079]
[0080]
所述化合物
ⅳ‑
1具有如下所示结构：
[0081][0082]
所述化合物
ⅳ‑
2具有如下所示结构：
[0083][0084]
所述化合物
ⅳ‑
3具有如下所示结构：
[0085][0086]
在本发明的一种实施方式中，所述进行放射性核素标记的方法为同位素交换法。
[0087]
本发明还提供了上述靶向颗粒酶b的分子探针在颗粒酶b显像中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
[0088]
本发明还提供了一种靶向颗粒酶b的显像剂，所述显像剂含有上述靶向颗粒酶b的分子探针。
[0089]
本发明技术方案，具有如下优点：
[0090]
本发明提供了一种靶向颗粒酶b的分子探针，所述分子探针具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列或者颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列，能够在颗粒酶b高表达的肿瘤微环境中发生天冬酰胺位点的剪切和二硫键的还原，利用生物相容性cbt-cys点击缩合反应，裸露的氨基、巯基易与cbt上的氰基缩合，快速进行分子内缩合环化自组装，形成放射性大环化产物；并且，在反应环境中存在较高浓度的l-cys时，所述分子探针的分子内缩合环化几乎不受影响；同时，所述分子探针有稳定性、灵敏度高、特异性强和安全性好等优点。因此，所述分子探针可对颗粒酶b活性进行准确和动态监测，将所述分子探针用于肿瘤免疫治疗早期疗效时，能够增强显像效果，进而提高对肿瘤免疫治疗早期疗效评估的准确性。
[0091]
进一步的，所述分子探针采用同位素交换法进行放射性核素标记，此方法操作简单，无需制备型hplc进一步纯化，减少了纯化时间，从而降低了因步骤繁琐而造成标记失败的可能性，并且，获得的pet示踪剂具有高放射化学产率和良好比活度，大大促进了pet示踪
剂的发展及其在疾病诊断上的应用。
附图说明
[0092]
图1：前体化合物m-1的质谱图。
[0093]
图2：前体化合物m-1的高效液相色谱图。
[0094]
图3：前体化合物m-1的氢谱图。
[0095]
图4：前体化合物m-1的碳谱图。
[0096]
图5：分子探针[
18
f]m-1放射性合成与纯化前后的hplc分析结果。
[0097]
图6：前体化合物m-2的质谱图。
[0098]
图7：前体化合物m-2的高效液相色谱图。
[0099]
图8：分子探针[
68
ga]m-2放射性合成的hplc分析结果。
[0100]
图9：分子探针[
18
f]m-1在pbs中孵育1、2、4小时的稳定性hplc分析。
[0101]
图10：分子探针[
18
f]m-1在小鼠血清中孵育1、2、4小时的稳定性hplc分析。
[0102]
图11：前体化合物m-1的酶切高效液相色谱图。
[0103]
图12：前体化合物m-1的酶动力学计算结果图。
[0104]
图13：不同细胞中颗粒酶b表达水平的westernblot分析结果。
[0105]
图14：不同细胞中颗粒酶b表达水平的westernblot定量分析结果。
[0106]
图15：分子探针[
18
f]m-1在与t细胞共孵育的4t1细胞和未与t细胞共孵育的4t1细胞中的摄取。
[0107]
图16：分子探针[
68
ga]m-2在与t细胞共孵育的4t1细胞和未与t细胞共孵育的4t1细胞中的摄取。
[0108]
图17：分子探针[
18
f]m-1在进行免疫治疗的4t1和未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠体内的micro-pet显像。
[0109]
图18：分子探针[
18
f]m-1在未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取定量分析结果。
[0110]
图19：分子探针[
18
f]m-1在进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取定量分析结果。
[0111]
图20：分子探针[
18
f]m-1进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠和未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取比值。
[0112]
图21：分子探针[
68
ga]m-2在进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠和未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠体内的micro-pet显像。
[0113]
图22：分子探针[
68
ga]m-2在未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取定量分析结果。
[0114]
图23：分子探针[
68
ga]m-2在进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取定量分析结果。
[0115]
图24：分子探针[
68
ga]m-2进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠和未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取比值。
[0116]
图25：前体化合物h-1的质谱图。
[0117]
图26：前体化合物h-1的高效液相色谱图。
[0118]
图27：前体化合物h-2的质谱图。
[0119]
图28：前体化合物h-2的高效液相色谱谱图。
[0120]
图29：分子探针h-1的氢谱。
[0121]
图30：前体化合物h-1的碳谱图。
[0122]
图31：前体化合物[
18
f]h-1的放射性合成合成纯化前后的hplc分析结果。
[0123]
图32：分子探针[
68
ga]h-2放射性合成的hplc分析结果。
[0124]
图33：分子探针[
18
f]h-1在pbs中孵育1、2、4小时的稳定性hplc分析。
[0125]
图34：分子探针[
18
f]h-1在小鼠血清中孵育1、2、4小时的稳定性hplc分析。
[0126]
图35：前体化合物h-1的酶切高效液相色谱图。
[0127]
图36：前体化合物h-1的酶动力学计算结果图。
[0128]
图37：分子探针[
18
f]h-1在与t细胞共孵育的4t1细胞和未与t细胞共孵育的4t1细胞中的摄取。
[0129]
图38：分子探针[
68
ga]h-2在与t细胞共孵育的4t1细胞和未与t细胞共孵育的4t1细胞中的摄取。
[0130]
图39：分子探针[
18
f]h-1在进行免疫治疗的4t1和未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠体内的micro-pet显像。
[0131]
图40：分子探针[
18
f]h-1在未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取定量分析结果。
[0132]
图41：分子探针[
18
f]h-1在进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取定量分析结果。
[0133]
图42：分子探针[
18
f]h-1进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠和未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取比值。
[0134]
图43：分子探针[
68
ga]h-2在进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠和未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠体内的micro-pet显像。
[0135]
图44：分子探针[
68
ga]h-2在未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取定量分析结果。
[0136]
图45：分子探针[
68
ga]h-2在进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取定量分析结果。
[0137]
图46：分子探针[
68
ga]h-2进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠和未进行免疫治疗的4t1荷瘤鼠肿瘤和肌肉中的摄取比值。
具体实施方式
[0138]
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0139]
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0140]
实施例1-1：一种靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1
[0141]
本实施例提供了一种靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1，所述靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1具有如下所示结构：
[0142][0143]
实施例1-2：一种制备靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1的方法
[0144]
本实施例提供了实施例1所述靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1的制备方法，具体步骤如下：
[0145]
步骤一：根据文献“linj,gaod,wangs,etal.jamchemsoc.2022；144(17):7667-7675.doi:10.1021/jacs.1c12935.”合成化合物sf；根据文献“hes,lij,lyuy,huangj,puk.jam chemsoc.2020；142(15):7075-7082.doi:10.1021/jacs.0c00659.”合成化合物iefd。
[0146]
步骤二：将化合物sf(40mg，0.053mmol，1eq)、化合物iefd(1.1eq)和苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu，1.15eq)溶于10ml无水四氢呋喃(thf)中，得到溶解液；在溶解液加入1mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)至完全溶解后，加入n，n-二异丙基乙胺(dipea，4eq)调节溶液的ph至8，得到混合物；将所得混合物使用氮气保护并置于室温(25℃)下搅拌(150rpm)3小时后，使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物
ⅰ‑
1(产率为87％)。
[0147]
步骤三：将化合物
ⅰ‑
1(40mg，0.031mmol，1eq)溶于5ml二氯甲烷(dcm)，得到溶解液；在溶解液加入5ml三氟乙酸(tfa)，得到混合物；将所得混合物置于室温(25℃)下搅拌(150rpm)30min后，先使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，然后使用乙醚洗涤、沉淀，再除去上清，取下层化合物干燥，得到化合物
ⅰ‑
2(产率为23％)。
[0148]
步骤四：将化合物
ⅰ‑
2(20mg，0.015mmol)溶于dmf/h2o(3ml，v:v＝2:1)混合溶液中，得到混合物；向混合物中加入烷基氨甲基三氟化硼(ambf3，0.053mmol)、三(2-苯并咪唑基甲基)胺(ligand，0.0015mmol)和六氟磷酸四(乙酸)铜(i)(cu(i)，11mg，0.015mmol)，得到反应体系；将反应体系抽真空，使用氮气保护置于45℃下搅拌(150rpm)45min后，先使用半制备型高效液相进行纯化，再冷冻干燥，得到前体化合物m-1(11mg，白色偏淡绿色粉末)。前体化合物m-1的质谱图见图1，高效液相色谱图见图2，氢谱图见图3，碳谱图见图4。
[0149]
步骤五：由医用回旋加速器按需生产
18
f氟离子；生产完成后，将
18
f氟离子传靶于阴离子交换柱(qma)，用哒嗪缓冲液(300μl，ph＝2.5)将
18
f阴离子从qma柱洗脱到聚丙烯反
应管(1ml)中，将前体化合物m-1(25mm，30μl)加入反应管中，80℃下孵育30min，得到反应液；将反应液转移到含有20ml超纯水的离心管中，然后将所得的分子探针[
18
f]m-1先后负载于用乙醇(10ml)和超纯水(10ml)活化的c18纯化柱(型号sep-pak plusc18)上；将c18柱用超纯水洗涤三次后，先用乙醇(500μl)将纯化的分子探针[
18
f]m-1淋洗至西林瓶中，再用生理盐水将分子探针[
18
f]m-1稀释至1μci/μl，得到分子探针[
18
f]m-1溶液。使用gabinova放射性检测器对分子探针[
18
f]m-1标记前后反应液进行放射性hplc检测，检测结果见图5。通过放射性产物峰面积/总峰面积计算分子探针[
18
f]m-1的放射化学纯度(rcp)，计算结果为：标记所得产物的放射化学纯度高于95％。通过放射性hplc检测计算分子探针[
18
f]m-1的放射化学产率(rcy)，计算结果为：56
±
1.2％。
[0150]
实施例1-3：一种靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]m-2
[0151]
本实施例提供了一种靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]m-2，所述靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]m-2具有如下所示结构：
[0152][0153]
实施例1-4：一种制备靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]m-2的方法
[0154]
本实施例提供了实施例3所述靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]m-2的制备方法，具体步骤如下：
[0155]
步骤一：用二氯甲烷冲洗砂芯漏斗两次，抽干，在抽干的砂芯漏斗中加入2-氯三苯甲基氯树脂(负载量为1.106mmol/g，271.25mg)，并加入10ml的二氯甲烷浸泡溶胀2-氯三苯甲基氯树脂，浸泡溶胀10min后，抽干；
[0156]
步骤二：向步骤一获得的砂芯漏斗中加入氨基酸fmoc-异亮氨酸(0.5mmol)，用10ml的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶解，得到溶解液；在溶解液中加入dipea(n,n-二异丙基乙
胺)(130μl，0.75mmol)调节溶解液的ph至8后，将溶解液在25℃下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10ml dmf/ch3oh/dipea的混合溶液(dmf/ch3oh/dipea＝7：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作一次，以除去未反应的氨基酸；再用10ml dmf(hplc型)洗涤两次，振荡2min后抽滤；向砂芯漏斗中加入10ml含20vt％哌啶的dmf溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的fmoc保护基团；再用10ml dmf(hplc型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时fomc基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
[0157]
步骤三：在步骤二的基础上，将氨基酸fmoc-谷氨酸(0.5mmol)依次替换为氨基酸fmoc-苯丙氨酸(0.5mmol)、氨基酸fmoc-天冬氨酸(0.5mmol)和氨基酸fmoc-s-三苯甲基-l-半胱氨酸(0.5mmol)、氨基酸fmoc-甘氨酸(0.5mmol)，氨基酸fmoc-对氨基苯甲酸(0.5mmol)、氨基酸fmoc-对氨基苯甲酸(0.5mmol)，并重复步骤二的操作，得到化合物iefd-zl(化合物iefd-zl即为具有颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸序列)。
[0158]
步骤四：根据文献“lin,j.etal.journal of the american chemical society,(jacs)2022，144(17)，7667-7675.”合成化合物cbt-1；将化合物cbt-1(10mg，0.023mmol，1eq)、化合物iefd-zl(1.1eq)和苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu，1.15eq)溶于10ml无水四氢呋喃(thf)中，得到溶解液；在溶解液加入1mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)至完全溶解后，加入n，n-二异丙基乙胺(dipea，4eq)调节溶液的ph至8，得到混合物；将所得混合物使用氮气保护并置于室温(25℃)下搅拌(150rpm)3小时后，使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物
ⅲ‑
1(产率为76％)。
[0159]
步骤五：将化合物
ⅲ‑
1(20mg，0.013mmol，1eq)溶于5ml二氯甲烷(dcm)，得到溶解液；在溶解液加入5ml三氟乙酸(tfa)，得到混合物；将所得混合物置于室温(25℃)下搅拌(150rpm)30min后，先使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，然后使用乙醚洗涤、沉淀，再除去上清，取下层化合物干燥，得到化合物
ⅲ‑
2(产率为61％)。
[0160]
步骤六：将化合物
ⅲ‑
2(9mg，0.007mmol，1eq)溶于10ml甲醇(meoh)中，得到溶解液；在溶解液加入200μl三异丙基硅烷(tips)和102μl2-(ethyldisulfanyl)pyridine(set，0.675mmol)，得到混合物；将混合物置于室温(25℃)下搅拌(150rpm)2h后，先使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，然后使用冷(4℃)乙醚洗涤3次，得到化合物
ⅲ‑
3(产率为85％)。
[0161]
步骤七：将化合物
ⅲ‑
3(8mg，0.006mmol)与羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(nota-nhs，0.009mmol)混合后，加入dipea调节ph至8，得到混合物；将所得混合物使用氮气保护并置于室温(25℃)下搅拌(150rpm)2小时后，先使用半制备型高效液相进行纯化，再冷冻干燥，得到前体化合物m-2(5mg，白色粉末)。前体化合物m-2的质谱图见图6，高效液相色谱图见图7。前体化合物m-2的分子量为1621，纯度大于95％。
[0162]
步骤八：使用0.05mhcl从
68
ge/
68
ga发生器(itg)中洗脱
68
ga，并与1.25mnaoac缓冲液混合以将ph值调节至4.0，得到混合物；将混合物转移到含有前体化合物m-2(20μg)的5mlep管中混匀后，于37℃孵育15min，得到分子探针[
68
ga]m-2；用生理盐水将分子探针[
68
ga]m-2稀释至1μci/μl，得到分子探针[
68
ga]m-2溶液。使用gabinova放射性检测器对分子探针[
68
ga]m-2标记前后反应液进行放射性hplc检测，检测结果见图8。通过放射性产物峰面积/总峰面积计算分子探针[
68
ga]m-2的放射化学纯度(rcp)，计算结果为：标记所得产物
的放射化学纯度高于95％。通过放射性hplc检测计算分子探针[
68
ga]m-2的放射化学产率(rcy)，计算结果为：98％。
[0163]
实验例1-1：靶向颗粒酶b的分子探针的体外稳定性实验
[0164]
本实验例提供了靶向颗粒酶b的分子探针的体外稳定性实验，具体过程如下：
[0165]
实验一：将实施例2制得的靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1溶液与pbs缓冲液(ph7.4，0.01m)以1：9的体积比混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育1、2或4h；孵育结束后，取孵育液使用gabinova放射性检测器进行放射性hplc分析，分析结果见图9。
[0166]
实验二：将实施例2制得的靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1溶液与小鼠血清(取自购自南京森贝伽生物科技有限公司)以1：9的体积比混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育1、2或4h；孵育结束后，取20μl孵育液，加入等体积乙腈，在12000g条件下高速离心5min使血清与蛋白分离，吸取上清液使用gabinova放射性检测器进行放射性hplc分析，分析结果见图10。
[0167]
由图9～10可知，当孵育时间增加至4h，靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1的放射化学纯度都在95％以上，证明在孵育过程中无其他产物生成，说明分子探针[
18
f]m-1具有较好的稳定性。
[0168]
实验例1-2：靶向颗粒酶b的分子探针的脂水分配系数实验
[0169]
参照文献“lin j,gao d,wang s,et al.j am chem soc.2022；144(17):7667-7675.”检测实施例2制得的靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1的脂水分配系数。
[0170]
实验测得靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1的脂水分配系数为0.113
±
0.0018，这说明分子探针[
18
f]m-1具有亲脂性，可能在体内主要通过肝脏途径代谢。
[0171]
实验例1-3：靶向颗粒酶b的分子探针的酶动力学实验
[0172]
本实验例提供了靶向颗粒酶b的分子探针的酶动力学实验，具体过程如下：
[0173]
在活化缓冲液(含50mm nacl的50mmmes缓冲液，ph＝5.5)中加入活性小鼠组织蛋白酶c(0.57μl，0.481mg/ml)和重组小鼠颗粒酶b(25μl，0.1mg/ml)后，于37℃下孵育4小时激活重组小鼠颗粒酶b，得到活化重组小鼠颗粒酶b；将活化重组小鼠颗粒酶b用tris缓冲液(50mm，ph＝7.5)稀释至1.0ng/μl，得到活化重组小鼠颗粒酶b稀释液；取99μl活化重组小鼠颗粒酶b稀释液添加到1μl实施例2制得的靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1(10mm)中，并在37℃下孵育4小时以上；孵育结束后，取孵育液使用gabi nova放射性检测器进行放射性hplc分析，分析结果见图11～12。
[0174]
由图11～12可知，分子探针[
18
f]m-1具有优异的靶向颗粒酶b的能力。此外，将不同浓度的分子探针[
18
f]m-1(浓度分别为12.5、25、50、100、150、200、250和400μm)与颗粒酶b一起孵育并通过hplc检测。颗粒酶b对分子探针[
18
f]m-1的酶促michaelis-menten常数(km)为198.90μm，颗粒酶b对分子探针[
18
f]m-1的催化速率常数(kcat)为1.12s-1
，颗粒酶b对分子探针[
18
f]m-1的催化效率(kcat/km)为5645m-1
s-1
。此结果进一步说明分子探针[
18
f]m-1具有优异的靶向颗粒酶b的能力。
[0175]
实验例1-4：颗粒酶b的细胞表达实验
[0176]
本实验例提供了颗粒酶b的细胞表达实验，具体过程如下：
[0177]
以不添加t细胞的4t1细胞作为对照，将t细胞(从正常balb/c小鼠脾脏中提取，balb/c小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司)和4t1细胞(购自中科院细胞库)分别以300
万和30万个的细胞密度接种至添加有2ml rpmi1640培养基(购自biological industries公司)的6孔板中后，于37℃培养；待培养至细胞密度达到90％后，吸出孔中培养基，除去孔中t细胞，吸干孔中液体，并在4℃下，在孔中添加200μl含有蛋白酶抑制剂pmsf(2μl，1mm)的ripa裂解缓冲液裂解细胞，得到细胞裂解物；将细胞裂解物在4℃、12000rpm下离心20分钟并收集上清液；测定上清液的蛋白质浓度后，进行western blot分析，并用chemi doc xrs 凝胶成像系统检测印迹蛋白，分析结果见图13～14。
[0178]
结果如图13～14所示，可以明显看出与t细胞共孵育的4t1细胞颗粒酶b高表达，而未与t细胞孵育的4t1细胞低表达。说明与t细胞共孵育的4t1细胞和未与t细胞孵育的4t1细胞可分别作为颗粒酶b高表达和低表达的细胞进行分子探针后续的靶向性实验。
[0179]
实验例1-5：靶向颗粒酶b的分子探针的细胞摄取实验
[0180]
本实验例提供了靶向颗粒酶b的分子探针的细胞摄取实验，具体过程如下：
[0181]
以不添加t细胞的4t1细胞作为对照，将t细胞(从正常balb/c小鼠脾脏中提取，balb/c小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司)和4t1细胞(购自中科院细胞库)分别以300万和30万个的细胞密度接种至添加有2ml rpmi 1640培养基(购自biological industries公司)的6孔板中后，于37℃培养；培养24h后，除去孔中t细胞，并于孔中取200μl培养液(含1
×
106个4t1细胞)与100μl含实施例2制得的靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]m-1(1μci/100μl)的无血清培养基共同添加至放免管中，于37℃孵育0.5、1、2和4h；孵育结束后，用冷(4℃)pbs缓冲液洗涤放免管中的4t1细胞两次以除去未被摄取的分子探针[
18
f]m-1；洗涤结束后，通过γ计数仪测定细胞摄取的放射性剂量，并测定对应细胞浓度，每个时间点平行实验三组，检测结果见图15。使用同样的方法检测实施例4制得的靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]m-2的细胞摄取，检测结果见图16。
[0182]
如图15显示，与t细胞共培养后4t1细胞中分子探针[
18
f]m-1的摄取值在4小时内始终较高，0.5小时达到最高值(6.71％id/mg)，并在接下来的两个小时维持在4.03％id/mg以上。相比之下，未与t细胞共培养的4t1细胞在4小时内的摄取值始终低于1.95％id/mg，远低于共培养组。说明分子探针[
18
f]m-1能够很好地靶向颗粒酶b高表达的细胞。
[0183]
如图16显示，与t细胞共培养后4t1细胞中分子探针[
68
ga]m-2的摄取值在0.5小时达到最高值(4.38％id/mg)，并在接下来的2小时维持在2.31％id/mg以上。相比之下，未与t细胞共培养的4t1细胞在4小时内的摄取值始终低于1.8％id/mg，远低于共培养组。说明分子探针[
68
ga]m-2能够很好地靶向颗粒酶b高表达的细胞。
[0184]
实验例1-6：靶向颗粒酶b的分子探针的小鼠pet成像实验
[0185]
本实验例提供了靶向颗粒酶b的分子探针的小鼠pet成像实验，具体过程如下：
[0186]
将4t1细胞按照1
×
106个的剂量以皮下注射的方式植入雌性balb/c小鼠(6周龄，购自常州卡文斯实验动物公司)的右侧腋窝；肿瘤生长一周后，将小鼠分为两组，一组为治疗组，小鼠接受免疫治疗，治疗方案为bec(购自medchemexpress公司)治疗(注射剂量为20mg/kg)，每天给药一次，连续给药3天，另一组为未治疗组；治疗结束后的第2天，用含有2vt％(vt％表示体积比)异氟烷的氧气以2l/min的流速麻醉小鼠；将小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在100μl生理盐水中的150μci的实施例2制得的分子探针[
18
f]m-1和实施例4制得的分子探针[
68
ga]m-2分别通过尾静脉注射；探针注射完毕后，立即执行60min的动态pet扫描，pet显像结果见图17和21；扫描完成后，使用osem3d/map算法将60min的pet成像结果
分割成12帧图像，每5min一帧，以实现对小鼠体内成像的实时分析；采用asipro软件中感兴趣区(roi)技术对探针在肿瘤部位及其他器官组织中的分布情况进行勾画和分析比较，分析结果见图18～20和22～24，其中，分子探针在活体内各个组织中的摄取值以％id/ml(每毫升注射剂量百分比)表示。
[0187]
如图17～20所示，分子探针[
18
f]m-1在免疫治疗前肿瘤部位无明显摄取，免疫治疗后肿瘤部位摄取明显增加，1小时内维持良好的影像学效果。对肿瘤部位的摄取进行定量分析，摄取值在10min时达到最高值，约为4％id/ml，1小时后仍保持在3％id/ml，肿瘤与肌肉的摄取比值最大为4。在未经免疫治疗的小鼠中，肿瘤摄取值1小时内维持在1％id/ml左右，并且肿瘤与肌肉的摄取比也较低。说明分子探针[
18
f]m-1可以通过pet显像对免疫治疗疗效进行准确监测。
[0188]
如图22～24显示，分子探针[
68
ga]m-2在免疫治疗前肿瘤部位无明显摄取，免疫治疗后肿瘤部位摄取明显增加，1小时内维持良好的影像学效果。对肿瘤部位的摄取进行定量分析，摄取值在40min时达到最高值，约为2.2％id/ml，1小时后仍保持在2.2％id/ml，肿瘤与肌肉的摄取比值最大为3。在未经免疫治疗的小鼠中，肿瘤摄取值1小时内维持在1％id/ml左右，并且肿瘤与肌肉的摄取比也较低。说明分子探针[
68
ga]m-2可以通过pet显像对免疫治疗疗效进行准确监测。
[0189]
实施例2-1：一种靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1
[0190]
本实施例提供了一种靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1，所述靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1具有如下所示结构：
[0191][0192]
实施例2-2：一种制备靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1的方法
[0193]
本实施例提供了实施例1所述靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1的制备方法，具体步骤如下：
[0194]
根据文献“hes,lij,lyuy,huangj,puk.jamchemsoc.2020；142(15):7075-7082.”合成化合物iepd；在实施例1-2的基础上，将化合物iefd(1.1eq)替换为化合物iepd
(1.1eq)，得到化合物
ⅱ‑
1(产率为69％)、化合物
ⅱ‑
2(产率为82％)、前体化合物h-1(15mg，白色粉末)和分子探针[
18
f]h-1溶液。前体化合物h-1的质谱图见图25，高效液相色谱图见图26，氢谱图见图29，碳谱图见图30。使用gabinova放射性检测器对分子探针[
18
f]h-1标记前后反应液进行放射性hplc检测，检测结果见图31。通过放射性产物峰面积/总峰面积计算分子探针[
18
f]h-1的放射化学纯度(rcp)，计算结果为：标记所得产物的放射化学纯度高于95％。通过放射性hplc检测计算分子探针[
18
f]h-1的放射化学产率(rcy)，计算结果为：41％。
[0195]
实施例2-3：一种靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]h-2
[0196]
本实施例提供了一种靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]h-2，所述靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]h-2具有如下所示结构：
[0197][0198]
实施例2-4：一种制备靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]h-2的方法
[0199]
本实施例提供了实施例3所述靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]h-2的制备方法，具体步骤如下：
[0200]
在实施例1-4的基础上，将氨基酸fmoc-苯丙氨酸(0.5mmol)替换为氨基酸fmoc-脯氨酸(0.5mmol)，得到化合物iefd-zl(化合物iefd-zl即为颗粒酶b靶向识别的异亮氨酸-谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸序列)、化合物
ⅳ‑
1(产率为72％)、化合物
ⅳ‑
2(产率为31％)、化合物
ⅳ‑
3(产率为43％)、前体化合物h-2(11mg，白色粉末)和分子探针[
68
ga]h-2溶液。前体化合物h-2的质谱图见图27，高效液相色谱图见图28。前体化合物h-2的分子量为1571，纯度大于90％。使用gabinova放射性检测器对分子探针[
68
ga]h-2标记前后反应液进行放射性hplc检测，检测结果见图32。通过放射性产物峰面积/总峰面积计算分子探针[
68
ga]h-2的放射化学纯度(rcp)，计算结果为：标记所得产物的放射化学纯度高于95％。通过放射性hplc检测
计算分子探针[
68
ga]h-2的放射化学产率(rcy)，计算结果为：98％。
[0201]
实验例2-1：靶向颗粒酶b的分子探针的体外稳定性实验
[0202]
按照与实验例1-1同样的方法进行靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1的体外稳定性实验，实验结果见图33～34。
[0203]
由图33～34可知，当孵育时间增加至4h，靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1的放射化学纯度都在95％以上，证明在孵育过程中无其他产物生成，说明分子探针[
18
f]h-1具有较好的稳定性。
[0204]
实验例2-2：靶向颗粒酶b的分子探针的脂水分配系数实验
[0205]
参照文献“linj,gaod,wangs,etal.jamchemsoc.2022；144(17):7667-7675.”检测实施例2制得的靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1的脂水分配系数。
[0206]
实验测得靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1的脂水分配系数为-0.803
±
0.0046，这说明分子探针[
18
f]h-1具有亲水性，在代谢方面有从肾脏中排泄，减少肝脏代谢的优势。
[0207]
实验例2-3：靶向颗粒酶b的分子探针的酶动力学实验
[0208]
按照与实验例1-3同样的方法进行靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1的酶动力学实验，实验结果见图35～36。
[0209]
由图35～36可知，分子探针[
18
f]h-1具有优异的靶向颗粒酶b的能力。此外，将不同浓度的分子探针[
18
f]h-1(浓度分别为12.5、25、50、100、150、200、250和400μm)与颗粒酶b一起孵育并通过hplc检测。颗粒酶b对分子探针[
18
f]h-1的酶促michaelis-menten常数(km)为94.11μm，颗粒酶b对分子探针[
18
f]h-1的催化速率常数(kcat)为0.60s-1
，颗粒酶b对分子探针[
18
f]h-1的催化效率(kcat/km)为6375m-1
s-1
。此结果进一步说明分子探针[
18
f]h-1具有优异的靶向颗粒酶b的能力。
[0210]
实验例2-4：靶向颗粒酶b的分子探针的细胞摄取实验
[0211]
按照与实验例1-5同样的方法进行靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1和靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]h-2的细胞摄取实验，实验结果见图37～38。
[0212]
如图37显示，与t细胞共培养后4t1细胞中分子探针[
18
f]h-1的摄取值在4小时内始终较高，1小时达到最高值(2.75％id/mg)，并在接下来的两个小时维持在1.57％id/mg以上。相比之下，未与淋巴细胞共培养的4t1细胞在4小时内的摄取值始终低于1.1％id/mg，远低于共培养组。说明分子探针[
18
f]h-1能够很好地靶向颗粒酶b高表达的细胞。
[0213]
如图38显示，与t细胞共培养后4t1细胞中分子探针[
68
ga]h-2的摄取值在4小时内始终较高，1小时达到最高值(2.3％id/mg)。相比之下，未与淋巴细胞共培养的4t1细胞在4小时内的摄取值始终低于1.02％id/mg，远低于共培养组。说明分子探针[
68
ga]h-2能够很好地靶向颗粒酶b高表达的细胞。
[0214]
实验例2-5：靶向颗粒酶b的分子探针的小鼠pet成像实验
[0215]
按照与实验例1-6同样的方法进行靶向颗粒酶b的分子探针[
18
f]h-1和靶向颗粒酶b的分子探针[
68
ga]h-2的小鼠pet成像实验，检测结果见图39～46。
[0216]
如图39～42所示，分子探针[
18
f]h-1在免疫治疗前肿瘤部位无明显摄取，免疫治疗后肿瘤部位摄取明显增加，1小时内维持良好的影像学效果。对肿瘤部位的摄取进行定量分析，摄取值在40min时达到最高值，约为3.5％id/ml，1小时后仍保持在3.5％id/ml，肿瘤与肌肉的摄取比值最大为4。在未经治疗的小鼠中，肿瘤摄取值1小时内维持在1％id/ml左右，
并且肿瘤与肌肉的摄取比也较低。说明分子探针[
18
f]h-1可以通过pet显像对免疫治疗疗效进行准确监测。
[0217]
如图43～46显示，分子探针[
68
ga]h-2在免疫治疗前肿瘤部位无明显摄取，免疫治疗后肿瘤部位摄取明显增加，1小时内维持良好的影像学效果。对肿瘤部位的摄取进行定量分析，摄取值在40min时达到最高值，约为3.5％id/ml，1小时后仍保持在3.5％id/ml，肿瘤与肌肉的摄取比值最大为5。在未经治疗的小鼠中，肿瘤摄取值1小时内维持在1％id/ml左右，并且肿瘤与肌肉的摄取比也较低。说明分子探针[
68
ga]h-2可以通过pet显像对免疫治疗疗效进行准确监测。
[0218]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。